Neste vídeo, estaremos demonstrando a culminação da gânglio cervical superior de ratos embrionários para análise morfológica e proteômica. Antes de iniciar a dissecção, prepare o controle e a dissecação dos meios de comunicação. O meio de controle contém F-12 e DMEM de baixa glicose suplementado com uma mistura de insulina-selênio-transferrina, glutamina, fator de crescimento nervoso e BSA.
O meio de dissecção contém L-15 complementado com pen-estreptococos e BSA. Consulte o manuscrito para obter protocolos detalhados para preparação da mídia. Preparação de placas para os neurônios de cultivo.
Diluir um miligrama por mililitro de poli-D-lysine a 100 microgramas por mililitro com água destilada estéril. Para análise proteômica ou genômica, de um a dois dias antes da dissecção, cubra placas de seis poços com aproximadamente dois mililitros de 100 gramas estéreis por mililitro de poli-D-lysine. Isso é necessário para garantir a adesão celular ao poço.
Enrole as placas com filme agarrado e armazene as placas durante a noite a quatro graus Celsius. No dia da dissecção, antes do início da dissecção, remova a solução de poli-D-lysine dos poços e enxágue os poços cinco vezes com água destilada estéril, seguida por uma vez com DMEM de baixa glicose. Durante a digestão enzimática do gânglio, aproximadamente uma hora antes de emplacamento das células, aspire o DMEM das placas e substitua-o por 0,3 mililitros de meio de controle.
Armazene as placas a 35 graus Celsius abaixo de 5% de CO2 em uma câmara umidificada. No capô, configure os seguintes itens para dissecção. Quatro tubos cônicos estéreis de 50 mililitros com cerca de 20 mililitros de mídia de dissecção em cada tubo.
Quatro pratos estéreis de 35 milímetros com 1,5 mililitros de mídia de dissecção. Um tubo cônico estéril de 50 mililitros com 20 mililitros de mídia de dissecção para centrifugação. Um tubo cônico estéril de 15 mililitros para centrifugar o gânglio, um tubo estéril de 10 mililitros para coletar as células dissociadas.
Use um esterilizador de contas secas para esterilizar um par de fórceps finos por pelo menos um minuto. Todos os procedimentos realizados em estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Saint Mary's College of California. As diretrizes de cuidado e uso de animais no Saint Mary's College of California foram desenvolvidas com base em diretrizes fornecidas pelo Escritório de Bem-Estar Animal Laboratorial dos Institutos Nacionais de Saúde.
Remoção de embriões E21 da rato grávida. Observe que a remoção da buzina uterina pode ser realizada fora do capô se a área circundante estiver completamente esterilizada. Eutanize um rato grávida com inalação de CO2.
Tesourar a pele da região abdominal e limpar a pele na área com 70% de álcool para esterilizá-la. Usando um conjunto fresco de tesouras estéreis e fórceps, corte a pele e, em seguida, o músculo para expor os chifres uterinos contendo os embriões. Remova o chifre uterino com os embriões, utilizando um novo conjunto de tesouras e fórceps, tomando cuidado para não danificar os intestinos no processo.
Transfira o chifre uterino com os embriões em placa de Petri estéril de 150 milímetros e transfira-os para o capô. Usando um novo conjunto de fórceps e tesouras, remova os embriões do chifre uterino e separe os embriões das membranas amnióticas e da placenta. Para eutanásia dos embriões, corte a medula espinhal dos embriões ao longo da linha média sob o braço direito.
Isso reduzirá o sangramento da artéria carótida durante a remoção do SCG. Transfira esses embriões para os tubos cônicos preparados de 50 mililitros contendo mídia de dissecção. Certifique-se de que os embriões estão submersos na mídia.
Cada tubo pode conter até três embriões. Isolamento do gânglio cervical superior do embrião. Transfira um filhote da mídia de dissecção para uma placa de Petri estéril de 150 milímetros meio cheia de substrato sólido com sua superfície dorsal no substrato.
Usando três agulhas estéreis de calibre 23, fixe o pub no prato com uma agulha sob cada braço e uma terceira agulha através da boca para hiperextendar cuidadosamente o pescoço. Corte a pele na região do pescoço usando fórceps finos estéreis para expor as glândulas salivares por baixo. Remova essas glândulas usando fórceps finos.
Localize os músculos estenicleidomastoide e omoidóides perto da clavícula e traqueia, respectivamente. Primeiro, corte os músculos estenicleidomastoides transversais. E então corte cuidadosamente o músculo omomóide fino usando fórceps finos.
Uma vez removidos esses músculos, a bifurcação na artéria carótida na extremidade anterior, será visível em ambos os lados da traqueia com o SCG localizado sob este garfo na artéria carótida. Usando fórceps fechados, levante suavemente a artéria carótida para visualizar o SCG. Usando um fórceps em ambos os lados do SCG, retire a carótida e transfira-a para os pratos estéreis preparados de 35 milímetros.
Este tecido provavelmente conterá o SCG com a artéria carótida, o nervo vago com o gânglios de nodose, bem como outros segmentos de músculo ou gordura na área. Repita o processo de dissecção do outro lado. Remova os SCGs de todos os embriões antes de continuar com as etapas de dissecção restantes descritas.
Distribua os tecidos isolados entre dois dos pratos de 35 milímetros para facilitar o processamento das amostras de tecido. Pós-processamento do SCG. Para separar o SCG do tecido dissecado, primeiro utilize fórceps finos para remover qualquer tecido ínteo, como músculo ou gordura, tomando cuidado para evitar a área próxima à bifurcação carótida.
Uma vez que esses tecidos foram removidos, dois gânglios são visíveis. O gânglio de nodose é menor e circular, enquanto o SCG tem forma de amêndoa. Puxe suavemente o nervo vago para separar o nervo vago e o gânglio nodose da carótida e, em seguida, separar o SCG da artéria carótida.
Use fórceps finos para remover a cápsula que circunda o SCG. Transfira o SCG para um novo prato de cultura de 35 milímetros. Repita este processo com todas as amostras de tecido dissecado.
Cubra uma pipeta de vidro esterilizada e plugada de algodão com mídia de dissecção para evitar que o tecido adque nas paredes da pipeta. Use a pipeta para substituir a mídia de dissecção por dois mililitros estéreis de colagenase tipo II, dispase tipo II em HBSS sem cálcio e magnésio e incubar por 50 minutos a 37 graus Celsius para ajudar a quebrar os tecidos. Observe que os tempos de incubação podem precisar ser otimizados com diferentes lotes de colagenase/dispase e geralmente varia de 40 minutos a uma hora.
Após a incubação, transfira os SCGs e a colagem/dispase para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Use a mídia de dissecção para enxaguar as placas e transferir a solução para o tubo. Adicione mídia de dissecção suficiente para levar o volume a aproximadamente 10 mililitros.
Centrifugar a 200 x g, 1.000 a 1.200 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente para pelotar a amostra. Aspire o supernatante, tomando o cuidado de não desalojar a pelota. Resuspenque a pelota com 10 mililitros de mídia de dissecção, repita a centrifugação e descarte o supernatante.
Substitua por um a dois mililitros de meio de cultura. Usando uma pipeta pasteur estéril de furo estreito, pré-revestida com meio de cultura, dissociar mecanicamente as moitas triturando suavemente cinco a seis vezes. Deixe os aglomerados maiores se contentarem por cerca de um minuto e transfira a suspensão celular supernacante para um novo tubo de 10 mililitros.
Repita este processo mais três vezes com força crescente de trituração cada vez para garantir a dissociação quase completa dos SCGs. Transfira o supernante após cada rodada de trituração para o tubo de 10 mililitros com o sobrenante da primeira trituração. Adicione mídia cultural suficiente para trazer o volume para oito a 10 mililitros.
Misture suavemente uma suspensão celular e quantifique a densidade celular com um hemótmetro. Distribua a suspensão celular nos poços na densidade celular apropriada para os experimentos. Misture continuamente a suspensão da célula durante o processo de revestimento para garantir a distribuição uniforme das células nos poços.
Para análise morfológica, a placa das células em torno de 8.000 células por poço em uma placa de 24 poços. E para protocolos genômicos e proteômicos, assode as células até 30.000 células por poço. Transfira as placas para um desiccador de vidro com água estéril na parte inferior para criar uma câmara umidificada.
Injete CO2 suficiente, em torno de 120 mililitros, para obter um ambiente de CO2 de 5% no desiccator, antes da vedação. Mantenha as placas a 35,5 graus Celsius. Isso é referido como o dia zero no protocolo.
Essas placas também podem ser mantidas em uma incubadora regular de 5% de CO2. O método descrito acima minimiza as mudanças de temperatura e pH e também ajuda a evitar a contaminação cruzada. Manutenção dos neurônios e tratamentos SCG cultivados.
Estas fotos mostram as células gânglios cervicais superiores dissociadas no dia zero, primeiro dia e quinto dia. A imagem do dia zero mostra as células ao chapeamento. As células banhadas no dia zero contêm uma mistura de células neuronais e não neuronais.
No primeiro dia, 24 horas após o revestimento, remova cuidadosamente metade da mídia cultural e substitua por dois micromolar Ara-C, citosina D-arabinofuranoside, um agente anti-mitotístico. Deixe o tratamento nas células por 48 horas. Normalmente, esse comprimento de tratamento é suficiente para eliminar células não neuronais na cultura.
No terceiro dia, aspire suavemente metade do meio e substitua com meio de controle. No quarto dia, as células estão prontas para tratamentos experimentais. Alimentar culturas a cada dois dias com o meio apropriado.
Substituindo suavemente metade do meio no poço por meio fresco. O quadro do quinto dia mostra um crescimento axonal extenso sem crescimento dendrático observado. Para induzir o crescimento dendrítico, os neurônios podem ser cultivados em Matrigel ou tratados com 10% de soro ou 50 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea-7.
A figura dois mostra alterações na morfologia neuronal dos neurônios SCG de ratos E21 após o tratamento com BMP-7. Micrografos de contraste de fase representativo em 10 X de ampliação mostram o corpo celular neuronal circular com axônios em neurônios de controle no painel A, e neurônios com múltiplos processos curtos de dendrite quando tratados com BMP-7 mostrados pelas setas no painel B.Neurônios cultivados SCGs após tratamentos apropriados podem ser usados para análise morfológica usando coloração imunocitômica para análise genômica e para estudos bioquímicos , como para análises proteômicas. Consulte o manuscrito para obter protocolos detalhados para imunosstaining e preparação de amostras para análise proteômica.
A Figura Três mostra imunossuagem da proteína MAP-2 em ratos embrionários cultivados neurônios simpáticos. Os painéis A a D mostram neurônios SCG cultivados tratados com mídia de controle e painéis E a H mostram neurônios tratados com BMP-7 a 50 nanogramas por mililitro por cinco dias. Micrografos representativos mostrando a coloração imunocitoquímica dos neurônios com proteína associada a microtúbulos-2 em C e G, uma mancha nuclear em D e H com micrografias de contraste de fase em B e F, e emergem dos três canais em A e D.Milímbicos manchas de proteína associada a microtúbulos-2 está presente no corpo celular e axônios proximais de neurônios de controle no painel C.E manchas da proteína MAP-2 no corpo celular , e dendritos em neurônios tratados BMP-7 está no painel G.Aqui está uma amostra de gânglio cervical superior tratado com mídia de controle, que detectou 1.100 proteínas.
A ontologia genética usando o banco de dados Panther descobriu que a maioria das proteínas eram citoplasmáticas. No entanto, havia proteínas e proteínas ligadas à membrana nas junções celulares na amostra. Esta análise também revelou que proteínas envolvidas em uma ampla gama de vias de sinalização neuronal foram detectadas na amostra.
Em conclusão, depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de isolar e cultivar neurônios de gânglio cervical superior embrionários para análise morfológica e proteômica. Este trabalho foi financiado pelo fundo de desenvolvimento do corpo docente e pelo programa de pesquisa de verão no Saint Mary's College of California.
