Agradeço L Watanabe, M Gorczyca e outros membros do laboratório Yoshihara para comentários úteis e discussão. Agradeço K. Scott e L. Looger para as populações da mosca, S Yokoyama para demonstrar experimentos, Shinya Iguchi para ajuda técnica e Nobuko Yoshihara de informação material. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Bolsas de Saúde Mental MH85958, e da Fundação Worcester para MY

1. Construção das Moscas <ol><li> Moldar uma plataforma a partir da tampa de 35 mm por prato Falcon derretendo a parede lateral e talha-lo para formar um ângulo apropriado e espessura (Figura 1a; Figura 2). Perfurar um furo na plataforma para aceitar a cabeça mosca (Figura 1a, b), de tal modo que as mandíbulas são livremente exposta ao exterior da câmara (Figura 1a). Cortar a extremidade de uma ponta de Pipetman, com o tamanho correspondente a mosca a ser observado. Cole a ponta para a plataforma, como mostrado na Figura 1a para completar as moscas (Figura 2). </li></ol> 2. Preparando o Fly para a observação <ol><li> Starve uma mosca adulta durante 24 horas a 25 ° C antes da experiência, colocando-o num frasco com apenas uma toalha de papel molhado, se a fome é necessário. </li><li> Anestesiar a mosca, colocando-o em um tubo de plástico 15ml de pé sobre gelo. </li><li> Usando uma pinça, inserir uma mosca para dentro da câmara doVoa, e empurre a mosca até que ela é incapaz de se mover. Em seguida, insere uma ficha para reter a mosca. (Figura 1a, b). </li><li> Selar as partes adjacentes dos probóscide proximais (rostro) até à extremidade interior do orifício; Aplicar uma pequena quantidade de luz de cura cola (Tetric EvoFlow) para os lados e acima do rostro a partir do exterior (setas na Figura 3). Também se aplicam a cola a partir do interior das moscas para o espaço entre a parte dorsal da cabeça ea extremidade interior do orifício (Figura 1b). Para permitir a tribuna para se mover livremente, deve ser tomado cuidado para evitar qualquer cola de tocar no pódio usando uma pestana (ou algo semelhante) para espalhar a cola. Finalmente, curar a cola com o mais fraco de iluminação de luz azul suficiente para curar, para evitar danificar a mosca do calor excessivo. Retire a ficha. </li><li> Um segmento para segurar o rostro parcialmente levantada (seta na Figura 3) pode ser empregue para estabilizar a mosca &#39;a cabeça, evitando colisão da parte da faringe para SOG e para expor a parte ventral do SOG, especialmente para os terminais pré-sinápticos da imagem Gr5a neurônios 8, que são cobertos por parte da faringe quando a tromba é totalmente retraída. </li><li> Encher a superfície da plataforma com um açúcar livre de soro fisiológico (em mM): NaCl, 140; KCl, 2; de MgCl2, 4,5; CaCl2, 1,5; e HEPES-NaOH, 5 com um pH de 7,1 10. Esta solução salina sacarose-livre tem tonicidade semelhantes aos de comumente usados ​​sacarose-salinas contendo tais como HL3.1 11. </li><li> Abra a cápsula cabeça, usando uma lâmina de tungstênio e pinça com pontas afiadas, como tesouras, que é um dispositivo feito sob medida e originalmente concebida pelo Dr. Kageyuki Yamaoka, Japão, cortar a cutícula e traquéia para expor o SOG (Figura 4). A borda ventral da cutícula cabeça foi cortada como ventral possível que o corte de borda dorsal não era tão crítica. Primeiro, faça uma incisão através daborda posterior utilizando uma lâmina de tungsténio. Em seguida, cortam o lado e as bordas anterior utilizando os fórceps afiadas. A peça cutícula corte deve ser levantado com a pinça e removido. Nervos antenas e antenas devem ser cortadas pelas pinças afiadas. </li><li> A fim de evitar artefactos do movimento durante a gravação, o cérebro deve ser estabilizada através da remoção de certas partes da mosca. Em primeiro lugar, remover seletivamente sacos aéreos entre a SOG e cutícula. Cortar o esófago, do lado da faringe e no final de entrar no SOG para remover a ligação entre a faringe e do cérebro. Em seguida, puxe para fora do músculo 16 12 e, finalmente, retirar qualquer traquéia que liga o cérebro ea cutícula. </li><li> Nós estabelecemos nossos moscas em fase de um microscópio Olympus BX51WI ligado a um sistema de microscópio fiação disco confocal (Improvision em PerkinElmer) (Figura 5). Uma lente de imersão em água, por exemplo, 40X/0.8 NA, foi imersa no banho (Figura 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + Imagem do Cérebro <ol><li> Ca 2 + imagens usando GCaMP3.0 1, 9 foi realizada através do método estabelecido por Marella et al. 8 (Figura 6). Usando um microscópio confocal disco giratório (Improvision), tomar uma única seção óptica a 4 Hz com tempo de exposição de 122ms usando laser de 491nm de excitação, com foco na região de interesse (um corpo celular de um neurônio motor, ou um interneurônio, ou terminais pré-sinápticos gustativas de neurônios sensoriais) com software Velocity, ver. 4,3 (Improvision). </li></ol> 4. Estimular os Proboscis <ol><li> Aspirar a solução de sacarose 100 mM aquosa para uma agulha hipodérmica com um pavio pequeno (feito a partir de papel Washi japonês, ver Tabela dos reagentes específicos) saliente a partir da ponta (Figura 7). </li><li> Descarregar uma pequena gota de solução de sacarose para o pavio, em seguida, aspirar que, imediatamente antes da suae aplicando o pavio papel encharcado Washi para a ponta dos probóscide. O pavio papel Washi deve ser aplicado apenas por um instante para evitar a saciedade (Figura 8). Monitorar a resposta extensão da probóscide (PER) comportamento utilizando uma câmara CCD acoplada a um microscópio de dissecção (Figura 5) simultaneamente com Ca 2 + imagem. Os dados devem ser tomadas dentro de uma hora após o início da dissecção, porque a resposta PER não é mantida mais de uma hora sob estas condições. </li></ol> 5. Os resultados representativos Neurónios motores do transferidor rostro, um par de músculos principais responsáveis ​​para a elevação da rostro para a extensão probóscide, têm sido relatados para mostrar as respostas a estímulos robustos doces 13. Figura 9 mostra Ca 2 + sinais através GCaMP3.0 1, 9 expressa por um Gal motorista 4, E49 13, a partir de um corpo celular do neurônio motor. Como mostrado no vídeo, um Robur PER foi observada em sincronia com um aumento no sinal de Ca 2 +. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática do cérebro da mosca ao vivo Imagem e Estágio Eletrofisiologia (moscas). um, as moscas é construído de tal modo que o ângulo da parede permite que a cabeça da mosca a sair recta. Três segmentos da probóscide da mosca são codificados por cores, a tribuna é magenta. A mosca é inserido para dentro da câmara com uma pinça, e uma peça cortada a partir da extremidade de uma ponta de Pipetman está conectado à parte de trás da câmara para bloquear a mosca de escapar. B, O orifício é perfurado para se conformar à cabeça da mosca. As lacunas restantes são selados com fotopolimerizável cola tal como indicado para assegurar que não existem fugas. Depois de a cola ter curado, a ponta Pipetman como uma ficha é removida. É vertida em solução salina das moscas tais que a superfície do cérebro está completamente coberta. Deve ser assegurado que não há vazamento salinação para fora na extremidade anterior da cabeça da mosca. A área sombreada rodeado pela linha tracejada na painel b mostra a peça a ser dissecados. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografia das moscas. A parede em forma de crescente de cola (a partir de uma pistola de cola) é feito para controlar o fluxo de solução salina durante a perfusão, e para reduzir a quantidade de solução salina usada. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> Figura 3. Vista frontal de uma mosca montado em as moscas. Esta imagem mostra como uma mosca é definida nas moscas, e como a cola fotopolimerizável é aplicado em torno da cabeça da mosca (setas) para criar um selo de solução salina prova. Se todas as fugas salino, através das probóscide da mosca, em seguida, o experimento vai falhar. A rosca (pontas de seta) amarrado ao estágio é segurar os probóscide em posição, de modo que não é completamente afastadores<html> Ted. Caso contrário, ele iria obstruir a porção mais ventral do SOG e causar artefatos de movimento. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> Figura 4. Top-view das moscas com uma mosca dissecados. Esta imagem mostra o SOG exposta de uma remoção cutícula mosca seguinte. O esófago, Músculo 16 e traqueias ligado ao cérebro, bem como seleccionados do ar de sacos também têm sido removido para impedi-los de perturbar o cérebro, o que pode levar a artefactos nos sinais de cálcio. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> Figura 5. O aparelho de monitorização. Este aparelho é montado a partir de um microscópio Olympus BX51WI ligado a um sistema de microscópio fiação disco confocal (Improvision), e um lado montado Nikon microscópio SMZ800. Esta configuração permite a criação de imagens ao vivo da atividade cerebral durante PER comportamento. 6 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg / &quot;/&gt; Figura 6. Fotografias que mostram a vista lateral das moscas. A camada fina de solução salina é ensanduichada entre a lente da imersão em água 40X ea mosca. <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> Figura 7. Esquema para fazer o pavio papel Washi. Gampi-Washi papel é um pergaminho japonês tradicional que é extremamente fina e lisa (Haibara, Japão). Também é muito forte e podem reter uma grande quantidade de líquido. O papel Washi deve ser cortado em um trapézio com dimensões muito específicas; 0,3 mm e 0,7 mm de largura, e 4-5 mm de comprimento (a). Este trapezoidal é então inserido a partir do lado 0,7 mm para dentro da ponta de uma agulha hipodérmica 23 G e também pode ser estabilizado através da inserção de um pino de insectos, que é dobrada para uma forma em V (b). C, O papel torna-se Washi Após a exposição transparentea um líquido, tornando-o ideal para esta experiência. <img alt="A Figura 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> Figura 8. A estimulação dos probóscide sobre as moscas com o Washi pavio. A mecha de papel Washi na ponta de uma agulha hipodérmica é aplicada por um instante utilizando um manipulador Joystick com uma mão. A agulha é ligado através de um tubo flexível a um injector manipulado com a outra mão, para aspiração e de descarga solução de sacarose. <img alt="A Figura 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> Figura 9. Resultados representativos. um, PER comportamento gravado através da câmara CCD instalado no estereomicroscópio. Vistas frontais de uma mosca starved com um probóscide estendidos (setas) antes da estimulação, no estimulação, e depois da estimulação com um feixe contendo 100 mM de solução aquosa de sacarose (ponta de seta). Iluminação é realizado por um laser nm 491 usadopara GCaMP fluorescência. b, Sacarose induzida GCaMP resposta 3,0 no neurônio motor para o transferidor de músculo tribuna no estado faminto. O painel de topo, antes da estimulação, o painel de fundo, imediatamente após a estimulação. Barra de escala, 10 mM. C, a quantificação da sacarose resposta induzida por 3,0 GCaMP. O neurónio motor responde a um estímulo de sacarose por um aumento acentuado na fluorescência seguido por uma fase de recuperação de vários segundos para a linha de base.

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121, 141-152 (2005).</li><li>Schroll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hamada, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Peabody, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+decision+network+for+wing+expansion+in+Drosophila+using+targeted+expression+of+the+TRPM8+channel.">Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel.</a> J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).</li><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hungry Fly. , (1976).</li><li>Shiraiwa, T., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proboscis+Extension+Response+(PER)+Assay+in+Drosophila.">Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).</li><li>Marella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category.">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category.</a> 49, 285-295 (2006).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+mediated+by+cAMP+and+protein+kinase+A+enhance+spontaneous+transmitter+release+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Miller, A., M, D. e. m. e. r. e. c. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-534 (1950).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+signaling+by+Syt+4+induces+presynaptic+release+and+synapse-specific+growth.">Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth.</a> Science. 310, 858-863 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Não tenho nada para revelar.</p

As Moscas permite a gravação simultânea de sinais de Ca 2 + e comportamentos PER. Mesmo com o cérebro exposto a um comportamento de solução salina normal PER foi observado. Usando o pavio Gampi-Washi em vez de um pavio Kimwipe utilizado no method7 inicial capilar facilita um comportamento altamente reprodutível e estável PER e evita a necessidade de se tornar hábil na tomada e escolhendo um pavio Kimwipe boa. As pontas experimentais acima referido nos permitiu com sucesso evitar perturbações pelo movimento das probóscide, levando a uma gravação muito estável de Ca 2 + sinais com baixo ruído. Ocasionalmente, a remoção de tecido não foi suficiente para expor as células ou suprimir o movimento de forma adequada, levando a resultados pobres. No entanto, uma vez que foram qualificados, mais do que 80% das preparações produziram bons resultados. Esta metodologia é não só para Ca 2 + de imagem, mas também pode ser adaptado a qualquer imagens ao vivo, enquanto observa PER comportamento. Por exemplo, podemos acessar qualquer célula através dauso de um eletrodo para gravar diretamente atividade. Combinado com dois microscópios de fóton de excitação, somos capazes de realizar imagem lapso de tempo da estrutura sináptica, que pode estar relacionado a mudanças comportamentais. Portanto, este método de imagiologia cerebral com observações comportamentais não só é valiosa para a dissecção funcional da rede neuronal, mas poderia ser utilizado como uma ferramenta poderosa para correlacionar 14 plasticidade sináptica para os mecanismos atrás memória.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Equipamento / Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar Vivadent </td><td> M04115 </td><td> Fotopolimerizável cola </td></tr><tr><td> Microscópio BX51WI </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td> Com 40X (NA 0,8) lente objetiva de imersão em água </td></tr><tr><td> Spinning disco do sistema microscópio confocal </td><td> Improvision em PerkinElmer </td><td></td><td> Com 491 nm do laser </td></tr><tr><td> Estereomicroscópio </td><td> Nikon </td><td> SMZ-800 </td><td> Ligado a um braço oscilante. Visão estéreo ainda está disponível com gravação de vídeo </td></tr><tr><td> Gampi-Washi papel </td><td> Haibara, Japão </td><td></td><td> Um tipo especial de papel tradicional japonesa </td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Fonte imagem </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 pixels SONY CCD </td></tr><tr><td> Manipulador Joystick </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> Injetor </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

Para estudar as redes neuronais em termos de sua função no comportamento, devemos analisar como os neurônios funcionam quando cada padrão comportamental é gerado. Assim, as gravações simultâneas de atividade neuronal e comportamento são essenciais para correlacionar a atividade do cérebro ao comportamento. Para tais análises comportamentais, a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, nos permite incorporar indicadores de cálcio geneticamente codificados como GCaMP 1, para monitorar a atividade neuronal, e usar sofisticadas manipulações genéticas para as técnicas optogenetic ou termogênico especificamente para ativar neurônios identificados 2-5. O uso de uma técnica termogênico levou-nos a encontrar os neurônios críticos para o comportamento de alimentação (Flood et al., Em revisão). Como parte principal do comportamento alimentar, um adulto de Drosophila estende sua tromba para alimentar 6 (probóscide resposta extensão; PER), em resposta a um estímulo doce a partir de células sensoriais na sua tromba ou tarsos. Combining o protocolo para PER 7 com uma imagem técnica de cálcio 8 usando GCaMP3.0 1, 9, tenho estabelecido um sistema experimental, onde podemos monitorar a atividade dos neurônios no centro de alimentação - o gânglio suboesophageal (SOG), simultaneamente com a observação comportamental dos tromba. Eu projetei um aparelho (&quot;Fly cérebro vivo Imaging and Stage Eletrofisiologia&quot;: as &quot;moscas&quot;) para acomodar um adulto Drosophila, permitindo sua tromba para mover-se livremente, enquanto seu cérebro está exposto ao banho de Ca 2 + imagem através de uma lente de imersão em água . As Moscas também é apropriado para muitos tipos de experiências ao vivo no cérebro da mosca, como a gravação eletrofisiológico ou imagem em tempo lapso de morfologia sináptica. Porque os resultados de imagem ao vivo pode ser diretamente correlacionada com o comportamento simultâneo PER, esta metodologia pode proporcionar um excelente sistema experimental para estudar o processamento de informações de redes neuronais, e como este cactividade ellular é acoplado a processos de plástico e de memória.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

A mosca da fruta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Estende sua tromba para alimentar, respondendo a um estímulo de açúcar a partir de sua tromba ou tarso. Eu combinei observações da resposta extensão da probóscide (PER), com uma técnica de imageamento de cálcio, o que nos permite monitorar a atividade dos neurônios no cérebro, simultaneamente com a observação comportamental.

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.5K visualizações.  University of Massachusetts Medical School. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, Estende sua tromba para alimentar, respondendo a um estímulo de açúcar a partir de sua tromba ou tarso. Eu combinei observações da resposta extensão da probóscide (PER), com uma técnica de imageamento de cálcio, o que nos permite monitorar a atividade dos neurônios no cérebro, simultaneamente com a observação comportamental.

Vídeo: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro da atividade elétrica dos neurônios identificados no cérebro intacto de peixes transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracelular de gravação, Sensorial Campo Mapping, e cultivando neurônios identificados nos Sanguessuga, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membrana Potencial Dye imagem de Ventromedial Hipotálamo Neurônios de camundongos adultos para estudar Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Um Guia para<em&gt; In vivo</em&gt; Gravação única unidade de Optogenetically Identificado Cortical Inibitória Interneurônios

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...