Pesquisa em Kaloshian laboratório é financiado por uma concessão dos Estados Unidos Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (2007-35607-17765). Pesquisas em laboratório Roberts é financiado por doações da Agência dos Estados Unidos para Desenvolvimento Internacional (GDG-G-00-02-00012-00 e EDH-A-00-07-00005) e da Califórnia feijão Conselho Consultivo.

1. Crescimento de mudas de tomateiro em vasos e bandejas <ol><li> Para experimentos em vasos, sementes de plantas de tomate em um único vaso em um solo orgânico rico, como mix de sol. Manter em casa de vegetação, 22-28 ° C. Após a germinação, adubar uma vez por semana com Miracle-Gro. </li><li> Aproximadamente duas semanas após a germinação, a fase dois verdadeiro-folha, transplantar individualmente as plântulas em panelas (10 cm de diâmetro e 17 cm de profundidade) cheios com solo arenoso estéril contendo areia 90% e 10% mistura orgânica. Adicionar Osmocote fertilizante de liberação lenta e manter em estufa a 22-28 ° C durante duas semanas. Continue para fertilizar plantas uma vez por semana com Miracle-Gro. </li><li> Para telas de alto rendimento, plantar sementes diretamente em bandejas em solo arenoso, cobrir a bandeja com filme plástico até a germinação e manter como acima. Após a germinação, adicione Osmocote fertilizante de liberação lenta e adubar uma vez por semana com Miracle-Gro. </li></ol> 2. Cowpea Crescimento em bolsas de plântulas <ol><li> Seeds ou são germinadas em uma placa de Petri, revestidas com várias camadas de papel Kimwipe, e transferidos separadamente para bolsas ou colocado directamente dentro da ranhura de papel da bolsa e germinadas. </li><li> Coloque os malotes em uma pasta de arquivo de plástico pendurado, dois por pasta e organizar as pastas em um rack na posição vertical. Coloque a cremalheira numa câmara de ambiente controlado mantida a uma temperatura de 25-28 ° C e luz 16 h / 8 de ciclo h escuro. Cremalheiras também podem ser mantidas em uma estufa, mas requerem uma folha metálica ou papel duro tampa colocada sobre a cremalheira em ambos os lados das hastes de plantas, para reduzir o potencial de contaminação por fungos. </li><li> As bolsas de água uma vez ou duas vezes por dia, com água de osmose inversa. Cerca de 10 a 14 dias após a semeadura, quando um sistema de raiz adequada com pontas de raízes terciárias desenvolveu (Figura 1), as mudas estão prontas para inoculação. </li></ol> 3. Extração de ovos de nematóides Extração de eGGS de raízes infectadas é modificado a partir de um protocolo desenvolvido por Hussey e Barker (1973). <ol><li> Três a quatro dias antes da inoculação do nematóide, extrair ovos galhas-nematóides das raízes de tomate infectadas. Antes de iniciar a extracção de ovo, lavar a área de trabalho completamente com água quente para evitar a contaminação. Também lavar em água quente a. Liquidificador, dois baldes, um suporte de malha de arame, um martelo de borracha, três peneiras de 425, 90 e 25 mM de abertura, uma proveta graduada e tesoura </li><li> Empilhe as peneiras de cima para baixo na seguinte ordem: 425, 90 e 25 mM de abertura. Os ovos serão recolhidos no peneiro de 25 uM na parte inferior. Coloque as peneiras em uma malha de arame apoiada em uma pia. Coloque um balde sob a malha de arame para coletar a solução run-through. </li><li> Cortar os topos da planta infectada (s), utilizados como a fonte do inoculo, e descartar. Retire cuidadosamente a planta do vaso. Lavar as raízes, por imersão em um balde de plástico cheio de água. Lavar as raízes mais em executarning água até que as partículas do solo são lavados a partir das raízes. </li><li> Corte as raízes com uma tesoura em pedaços pequenos. Descarte a raiz principal. </li><li> Coloque as raízes cortadas a partir de uma única planta em uma jarra de plástico grande com tampa, adicione apenas o suficiente solução de lixívia a 10% para cobrir as raízes e feche a tampa. </li><li> Agitar o frasco contendo as raízes durante 2 min. </li><li> Abra o frasco e despeje as raízes para o peneiro superior e lavar com uma mangueira ligada a um bocal de nebulização. Lave bem até que todo o cheiro a lixívia se foi. Use um martelo para apertar os lados das peneiras para evitar o entupimento dos poros de peneira. </li><li> Remover o peneiro superior e enxaguar os detritos no peneiro segundo. </li><li> Remover o segundo crivo e recolher os detritos fina, que inclui os ovos, a partir do peneiro última. Com uma ligeira corrente a partir de uma garrafa de água, mover os detritos para um lado da peneira. Recolher os detritos e de ovos para um copo de limpa com uma quantidade mínima de água. </li><li> Peneira mais uma vez a água coletada nobalde através da peneira 25 mM de recolher todos os ovos que podem ter escapado. Lave bem com água e recolher no mesmo copo. </li><li> Descarte a restos de plantas do peneiro superior e lavar cuidadosamente as três peneiras com água pressurizada. Não toque na parte de malha dos peneiros como pode distorcer o tamanho dos poros. </li></ol> 4. Nematóides de ovos para incubação <ol><li> Forre uma cesta de metal limpo, com algumas camadas de papel Kimwipe e caber em uma placa de Petri de vidro. Permitir uma distância de 1 cm entre o fundo do cesto eo prato. </li><li> Verter os ovos de nematóides extraídos para o papel no cesto de arame. Adicionar líquido suficiente de modo que o fundo do cesto de arame toca a superfície da água, mas não está imerso na água. Cobrir a parte superior com uma tampa de plástico. </li><li> Cada dia verificar para a evaporação da água e adicionar um pouco de água numa placa de Petri de modo que o fundo do cesto toca a água. Isso vai evitar que os ovos sequem. </li><li> A cada dois dias, recolher o water que contém os J2s das placas de Petri para um copo. Se não for utilizado imediatamente, ventilar o inoculo recolhidos à temperatura ambiente utilizando uma fonte de ar do laboratório ou de ar gerada por uma bomba de aquário. Utilizar o inóculo gaseificado dentro de 2 dias. J2s podem ser recolhidos a partir da incubação definido ao longo de um período de 6-8 dias. </li></ol> 5. Infecção tomate Root em vasos ou bandejas e avaliação de infecção <ol><li> Use três alíquotas dos nemátodos recolhidos para contar o número de J2s em uma corrediça de contagem ou prato, calcular a média e determinar o volume desejado para inoculação. Tipicamente 3000 J2s são usados ​​por plantas em vasos e 500 J2s para plantas cultivadas em substrato. </li><li> Agita-se o inoculo sobre uma placa de agitação magnética a baixa velocidade. </li><li> Antes de inocular as plantas, certifique-se que o solo está úmido, mas não muito molhado. Para inoculação panela, faça três furos de cerca de profundidade de meio pote na areia ao redor de cada sistema radicular de tomate usando um lápis (Figura 2 </strong&gt;). Inocular cada planta, fornecendo as J2s nas três furos com uma pipeta. Posteriormente, cobrir os buracos. </li><li> Para as telas de alto rendimento em bandejas, utilizar uma ponta da agulha modificado fechado, com orifícios nos lados coladas a uma ponta de pipeta de 5 ml ao longo de uma pipeta (Figura 3) para entregar os J2s no solo. Alternativamente, os nemátodos podem ser entregues como no passo 5.3. </li><li> Manter as plantas em uma estufa em 24-27 ° C por seis a oito semanas. Continue para fertilizar duas vezes por mês com Miracle-Gro. </li><li> Para a avaliação da infecção, cuidadosamente remover as plantas dos vasos e lavar as raízes (como descrito no passo 3.3). </li><li> Stain as massas de ovos azuis por submersão das raízes em 1 mg / L erioglaucine, durante 15 min. </li><li> Lavar as raízes em água e avaliar através da contagem de massas de ovos manchados no sistema radicular individual. Um ampliador iluminado mesa pode ser usada para ajudar a visualizar as massas de ovos. </li><li> Se as plantas crivados são necessários para g ainda maisestudos enetic, não corte os topos antes da lavagem, as raízes para avaliação. Após coloração e contando as massas de ovos, o transplante de mudas em solo orgânico, podar as copas fortemente para reduzir a transpiração, e manter em uma estufa. </li></ol> 6. Cowpea Infecção Root em Bolsas e avaliação de infecção <ol><li> Contar o inoculo de nemátodos e agita-se sobre uma placa de agitação magnética, tal como descrito anteriormente. </li><li> Remova as bolsas das pastas suspensas e coloque sobre uma superfície horizontal. Inocular cada bolsa com 1500 J2s em 5 ml. Levantar a tampa de plástico da bolsa e distribuir os nemátodos uniformemente sobre a superfície das raízes. </li><li> Manter as bolsas numa posição horizontal durante 24 h após a inoculação, coberto com papel escuro para eliminar a luz, e depois voltar para as pastas de suspensão na câmara de crescimento. </li><li> De água das plantas, conforme necessário, uma ou duas vezes por dia, com metade da força-solução de Hoagland (Hoagland &amp; Arnon, 1950; Tabela 1 </&gt; forte) até que uma resposta para o fertilizante é observada, esverdeamento folhagem tipicamente melhorada e crescimento de rebentos mais vigorosa. Normalmente, as plantas são regadas com meia-força Hoagland 3 dias seguidos. Depois, manter as bolsas úmido com água. </li><li> Aproximadamente 30 dias (intervalo de 28-35 dias) após a inoculação, infundir cada bolsa com cerca de 10-20 ml de 75 erioglaucine mg / L. Manter as bolsas inundadas com o corante numa posição horizontal durante a noite. </li><li> Escorra as bolsas e avaliar os sistemas radiculares através da contagem de massas de ovos em um amplificador de mesa iluminada. </li><li> Se as plantas blindados são necessários para estudos genéticos ou de trabalho de criação, cuidadosamente puxe as raízes do papel do transplante, em solo orgânico em vasos e manter em uma estufa. </li></ol> 7. Os resultados representativos As fases adequadas do tomate e caupi plantas para as inoculações de nematóides, para os dois sistemas descritos são mostrados nas Figuras1 e 2. Além disso, exemplos de bem-infectadas raízes de tomate e caupi são mostrados nas Figuras 4 e 5. Tal como na maioria das telas de resistência à doença, é aconselhável a utilização de pelo menos 6-10 plantas por genótipo para a inoculação de nemátodos para calcular a média da taxa de infecção. Variação da infecção por nematóides entre as plantas, do mesmo genótipo, pode ser reduzido pelo uso de tamanho uniforme e planta quantidade exacta e entrega de inoculo. A utilização de tabuleiros e bolsas de crescimento permite rastreio de centenas a milhares de plantas em um espaço pequeno crescimento. Bolsas de crescimento também permitem rápido e eficiente de avaliação não destrutiva de infecções galhas-nematóides sem a necessidade de raízes de lavagem (Figura 4). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> Figura 1. A duas semanas de idade, planta caupi cultivado em uma bolsa e pronto para o root-knot nemaTode inoculação. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> Figura 2. A três plantas de tomate semanas de idade, pronto para galhas-inoculação do nematóide. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> Figura 3. Uma agulha modificado e utilizado para ponta de pipeta de alto rendimento inoculação de nematóides. A parte inferior de uma agulha foi selado e três conjuntos de furos foram perfurados na agulha usando um feixe de laser. Em seguida, a agulha modificado foi colada a uma ponta de pipeta de 5 ml. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> Figura 4. Um sistema radicular de tomateiro com galhas-nematóides. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> Figura 5. Um sistema radicular caupi com massas de ovos corados com erioglaucine 30 dias pós-inoculação crescido a28 ° C.

<ol>
	<li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway.">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li><li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea.">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li><li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.,+including+a+new+technique.">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li><li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid.">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li><li>Matkin, O. A., Chandler, P. A., Baker, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U.C.-type+soil+mixes.+In:+The+U.C.+system+for+producing+healthy+container-grown+plants.">The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. 23, 68-85 (1957).</li><li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature.">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li><li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita.">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li><li>Perry, R. N., Moens, M., Starr, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root-Knot Nematodes. , (2009).</li><li>Starr, J. L., Cook, R., Bridge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Resistance to Parasitic Nematodes. , (2002).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Há dois passos essenciais para uma tela de nematóide de sucesso: preparação de um inóculo altamente infecciosa e uso de plantas na fase adequada de desenvolvimento. Taxa de eclosão de ovos de nematóides de galha-é altamente variável e varia entre 5 - 50%. Portanto, para obter níveis ótimos de escotilha e J2s altamente infecciosa, atenção deve ser dada para a extração de ovos para incubação e procedimentos. Ovos deve ser exposto a lixívia por um período mínimo de tempo e de lixívia deve ser lavado para fora a partir da mistura bem de raiz. Quando a eclosão dos ovos, a lama contendo os ovos não deve ser mergulhado em água. Além disso, evitar derramar os ovos em uma placa de Petri subjacente, onde os jovens nascidos são coletados. Uma maneira de evitar o derramamento dos ovos durante o processo de incubação não é adicionar água diretamente ao Kimwipe como o papel pode quebrar. Em vez adicionar a água directamente para a placa de Petri. Para melhores resultados, use J2s recém-nascidos. Se o hatctaxa h é baixa e mais inoculo é necessário, J2s pode ser armazenado a 15 ° C durante um período mais longo. Aquecer o inoculo armazenado à temperatura ambiente para recuperar os nematóides antes da inoculação. No entanto, não armazenam os J2s durante períodos prolongados, mesmo a 15 ° C como J2s starved não irá infectar de forma eficiente. Mudas jovens são o melhor estágio de desenvolvimento de galhas-inoculação do nematóide. No entanto, este tem de ser equilibrada com a formação de um sistema de raiz adequada que permita um número suficiente de pontas de raízes como pontos de entrada para os J2s. Manter condição de crescimento ideal das plantas é também crítico para as telas. Evitar o excesso de rega-plantas, especialmente aquelas cultivadas em bolsas. Mais-molhar as bolsas, como indicado por pé de água no fundo da bolsa, pode promover o crescimento de fungos e diminuir a saúde da raiz. Com ambos os ensaios de avaliação subsequente da infecção de nematóides e cálculo do número de ovos / sistema radicular e ovos / grama de freraiz sh pode ser realizada. Para os ensaios de tomate, raízes individuais são pesados ​​e de ovos extraídos como descrito para a preparação de inóculo (secção 3). Quando o processamento grande número de amostras de plantas, sistemas de raízes individuais poderiam ser macerada usando um misturador para a extracção de ovo. O número de ovos devem ser contadas em pelo menos três alíquotas e os ovos / grama de sistema de raízes frescas calculado. Para os ensaios de bolsa, o sistema da raiz é puxado para fora do inserto de papel, pesados, e os ovos extraído.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Compound </td>
			<td>Concentration </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2 &bull; 4 H2O</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamp-ene Fe EDTA 13.0%</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>46 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 &bull; 4H2O</td>
			<td>9 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>0.00076 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &bull; 5H2O</td>
			<td>0.00032 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24 &bull; 4H2O</td>
			<td>0.00016 &mu;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Reagents for Hoagland's solution.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent </td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalogue number </td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erioglaucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC22973-0250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro for tomato</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>18-18-21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmocote</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedling growth pouches</td>
			<td>Mega International</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 25 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3886</td>
			<td>US standard #500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 90 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3880</td>
			<td>US standard #170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 425 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3871</td>
			<td>US standard #40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine mix</td>
			<td>Sun Gro Horticulture Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 2. Table of specific reagents and equipment.

high and low throughput screens with root-knot nematodes meloidogyne spp.

Galhas-nematóides (gênero Meloidogyne) são parasitas de plantas obrigatórios. Eles são extremamente polífagas e considerado um dos fitonematóides economicamente mais importantes parasitas. O microscópico segundo estágio juvenil (J2), molted uma vez no ovo, é o estágio infectante. Os J2s eclodem dos ovos, mover-se livremente no solo dentro de uma película de água, e localizar pontas de raízes das espécies de plantas adequadas. Após penetrar a raiz da planta, eles migram em direção ao cilindro vascular onde estabelecer um local de alimentação e iniciar a alimentação de seus estiletes. O local de alimentação multicelular é composto por vários ampliadas células multinucleadas chamados &#39;células gigantes&#39; que são formados a partir de células que foram submetidos a karyokinesis (repetido mitose) sem citocinese. Periciclo células vizinhas dividir e ampliar em tamanho dando origem a uma vesícula típica ou nó raiz, o sintoma característico da raiz nó-infecção por nematóides. Uma vez que a alimentação é iniciada, tornar-se sedentário e J2s undergo três mudas adicionais para se tornarem adultos. A fêmea adulta estabelece 150-250 ovos em uma matriz gelatinosa em ou abaixo da superfície da raiz. A partir dos ovos eclodem J2s infecciosos novos e iniciar um novo ciclo. A raiz-nó ciclo de vida do nematóide é completado em 4-6 semanas a 26-28 ° C. Aqui nós apresentamos o protocolo tradicional de infectar plantas, cultivadas em vasos, com galhas-nematóides e dois métodos de ensaios de alto rendimento. O método de alto rendimento primeira é usada para plantas com sementes pequenas, como tomate, enquanto o segundo é para as plantas com sementes grandes, como feijão caupi e comum. Sementes grandes apoiar o crescimento das mudas estendida com suplemento nutricional mínimo. O ensaio de taxa de transferência de alta primeiro utiliza plântulas crescidas em areia em bandejas, enquanto nas plantas segundo ensaio são cultivadas em bolsas, na ausência de solo. A bolsa de crescimento de plântulas é feita de um pavio 15,5 x 12,5 centímetros de papel, dobrada na parte superior para formar uma calha 2-centímetros de profundidade na qual as sementes ou plântulas é colocado. Opavio de papel está contido dentro de uma bolsa de plástico transparente. Estas bolsas de crescimento permitir a observação directa dos sintomas de infecção, de nematóides das raízes galhadores e produção em massa de ovo, sob a superfície de uma bolsa transparente. Ambos os métodos permitem a utilização das plantas rastreados, após fenotipagem, para a passagem ou de produção de sementes. Uma vantagem adicional da utilização de bolsas de crescimento é o requisito de espaço pequeno, porque são armazenados em bolsas de plástico pastas penduradas dispostos em prateleiras.

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High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Dois métodos distintos para as fábricas de tela com nematóides de galha-são descritos. As abordagens descritas incluem alto rendimento telas com nemátodos de uma maneira não destrutiva para facilitar a utilização destas plantas em programas de criação.

Alta e Baixa Screens rendimento com galhas-Nematóides Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

27.7K visualizações.  University of California, Riverside. Dois métodos distintos para as fábricas de tela com nematóides de galha-são descritos. As abordagens descritas incluem alto rendimento telas com nemátodos de uma maneira não destrutiva para facilitar a utilização destas plantas em programas de criação.

Vídeo: High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Imunologia e Infecção

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: de alta capacidade Quantificação do crescimento da colônia e intervalo de tempo

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em&gt; Brucella</em&gt; A infecção de células HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...