La ricerca in Kaloshian laboratorio è finanziato da una sovvenzione da parte degli Stati Uniti National Institute of Food and Agriculture (2007-35607-17765). La ricerca in laboratorio Roberts è finanziata da sovvenzioni da Stati Uniti Agency for International Development (GDG-G-00-02-00012-00 e EDH-A-00-07-00005) e la California a secco Bean Advisory Board.

1. Pomodoro crescita delle piantine in vasi e vassoi <ol><li> Per i saggi vaso, semi di piante di pomodoro in un piatto unico in un organico ricco di suolo, come mix sole. Mantenere in una serra a 22-28 ° C. Dopo la germinazione, concimare una volta alla settimana con Miracle-Gro. </li><li> Circa due settimane dopo la germinazione, la vera foglia in due fasi, singolarmente trapiantare le piantine in vasi (10 cm di diametro e 17 cm di profondità) riempiti con terreno sabbioso sterile contenente il 90% sabbia e 10% di mix organico. Aggiungi Osmocote concime a lenta cessione e di mantenere in una serra a 22-28 ° C per due settimane. Continuare a concimare le piante una volta alla settimana con Miracle-Gro. </li><li> Per high-throughput schermi, semi di piante direttamente in vassoi in terreno sabbioso, coprire il vassoio con pellicola trasparente fino alla germinazione e mantenere come sopra. Dopo la germinazione, aggiungere Osmocote concime a lenta cessione e concimare una volta alla settimana con Miracle-Gro. </li></ol> 2. La crescita Cowpea in buste Seedling <ol><li> SI responsabili politici sono sia germogliato in una capsula di Petri, rivestito con diversi strati di carta Kimwipe, e trasferiti singolarmente ai sacchetti o inserito direttamente nella scanalatura di carta del sacchetto e germinato. </li><li> Mettere i sacchetti di plastica in una cartella di file di sospensione, due per ogni cartella, e organizzare le cartelle in un rack in posizione verticale. Inserire la griglia in un ambiente controllato camera mantenuta ad una temperatura di 25-28 ° C e 16 h di luce / 8 ore buio ciclo. Rack può anche essere mantenuto in una serra, ma richiedono un foglio di carta rigida o coperchio posizionato sulla cremagliera su entrambi i lati dei gambi delle piante, per ridurre il potenziale di contaminazione fungina. </li><li> Le buste d&#39;acqua una o due volte al giorno con acqua ad osmosi inversa. Circa 10 a 14 giorni dopo la semina, quando un apparato radicale adeguato con punte delle radici terziarie si è sviluppata (Figura 1), le piante sono pronte per l&#39;inoculo. </li></ol> 3. Estrazione di uova dei nematodi Estrazione eGGS da radici infette è stato modificato da un protocollo sviluppato da Hussey e Barker (1973). <ol><li> Tre o quattro giorni prima dell&#39;inoculazione nematode, estrarre galligeni uova di nematodi dalle radici di pomodoro infetti. Prima di iniziare l&#39;estrazione delle uova, lavare l&#39;area di lavoro accuratamente con acqua calda per evitare la contaminazione. Anche lavare in acqua bollente un frullatore, due secchi, uno di sostegno rete metallica, un martello di gomma, tre setacci di 425, 90 e 25 micron di apertura, un cilindro graduato e le forbici. </li><li> Stack dei setacci dall&#39;alto verso il basso nel seguente ordine: 425, 90 e 25 micron di apertura. Le uova vengono raccolte sul setaccio da 25 micron in basso. Mettere i setacci su una rete metallica supportato in un lavandino. Mettere un secchio sotto la rete metallica per raccogliere il run-through soluzione. </li><li> Tagliare le cime della pianta infetta (s), utilizzati come fonte di inoculo, e scartare. Rimuovere delicatamente la pianta dal vaso. Lavare le radici mediante immersione in un secchio di plastica pieno d&#39;acqua. Lavare le radici di età inferiore a correreacqua corrente fino a quando le particelle di terreno vengono lavate via dalle radici. </li><li> Tagliare le radici con le forbici in piccoli pezzi. Smaltire il fittone. </li><li> Mettere le radici tagliate da un unico stabilimento in un grande vaso di plastica con un coperchio, basta aggiungere solo una soluzione di candeggina al 10% per coprire le radici e chiudere il coperchio. </li><li> Scuotere il vaso contenente le radici per 2 min. </li><li> Aprire il vaso e versare le radici sulle setaccio superiore e lavare con un tubo collegato a un ugello di appannamento. Lavare bene fino a quando tutto l&#39;odore di candeggina è andato. Usare un martello per toccare i lati dei setacci per evitare di intasare i pori setaccio. </li><li> Rimuovere il setaccio superiore e sciacquare i detriti sul setaccio secondi. </li><li> Rimuovere il setaccio secondo e raccogliere i detriti sottile, che comprende le uova, dal setaccio ultimo. Con un flusso delicato da una bottiglia d&#39;acqua, spostare i detriti di un lato del setaccio. Raccogliere i detriti e le uova in un becher pulito con una quantità minima di acqua. </li><li> Sieve ancora una volta l&#39;acqua raccolta nellasecchio attraverso il setaccio da 25 micron di raccogliere tutte le uova che possono essere sfuggiti. Sciacquare bene con acqua e raccogliere nel bicchiere stesso. </li><li> Eliminare i detriti pianta dal setaccio superiore provvedendo a lavare accuratamente tutti e tre i vagli con acqua in pressione. Non toccare la parte maglie dei setacci in quanto può alterare la dimensione dei pori. </li></ol> 4. Nematodi uova da cova <ol><li> Linea un cestino di metallo pulito, con pochi strati di carta Kimwipe e stare su un piatto di vetro Petri. Consentire un 1-cm di distanza tra il fondo del cestello e il piatto. </li><li> Versare le uova nematodi estratti sulla carta nel cestello. Aggiungere abbastanza liquido in modo che il fondo del cestello tocca la superficie dell&#39;acqua, ma non è immerso in acqua. Coprire la parte superiore con un coperchio di plastica. </li><li> Ogni giorno controllare l&#39;evaporazione dell&#39;acqua ed aggiunge dell&#39;acqua nella scatola di Petri in modo che il fondo del cestello tocca l&#39;acqua. Questo consentirà di evitare le uova si asciughi. </li><li> Ogni altro giorno, raccogliere il WAter che contiene i J2S dai piatti Petri in un becher. Se non utilizzato immediatamente, aerare l&#39;inoculo raccolti a temperatura ambiente utilizzando una fornitura dell&#39;aria di laboratorio o aria generata da una pompa acquario. Utilizzare l &#39;inoculo aerato entro 2 giorni. J2S possono essere raccolte dalla schiusa istituito per un periodo di 6-8 giorni. </li></ol> 5. Pomodoro infezione Root in vasi o vassoi e valutazione di infezione <ol><li> Utilizzare tre aliquote dei nematodi raccolti per contare il numero di J2S in una diapositiva di conteggio o un piatto, calcolare la media e determinare il volume desiderato per l&#39;inoculo. Tipicamente 3000 J2S vengono utilizzati per pianta in vaso e 500 J2S per le piante coltivate in vassoi piantine. </li><li> Mescolare il inoculo su una piastra di agitazione magnetica a bassa velocità. </li><li> Prima di inoculare le piante, assicurarsi che il terreno è umido ma non troppo bagnato. Per l&#39;inoculazione pot, fare tre fori di circa mezzo piatto di profondità sotto la sabbia attorno ad ogni sistema di radici di pomodoro con una matita (figura 2 </strong&gt;). Inoculare ogni pianta fornendo i J2S nei tre fori con una pipetta. Successivamente, coprire i buchi. </li><li> Per gli high-throughput schermi in vassoi, utilizzare un ago modificato punta sigillata con fori sui lati incollati a 5 ml punta della pipetta lungo una pipettatura (Figura 3) di consegnare i J2S nel terreno. In alternativa, nematodi possono essere forniti come nel passaggio 5,3. </li><li> Mantenere le piante in una serra a 24-27 ° C per sei-otto settimane. Continuare a concimare due volte al mese con Miracle-Gro. </li><li> Per la valutazione di infezione, rimuovere con attenzione le piante dai vasi e lavare le radici (come descritto al punto 3.3). </li><li> Colorare le masse di uova azzurre immergendo le radici in 1 mg / L erioglaucine, per 15 min. </li><li> Lavare le radici in acqua e valutare contando le masse di uova colorate sul sistema radicale individuale. Una lente di ingrandimento scrivania illuminata può essere usato per aiutare a visualizzare le masse di uova. </li><li> Se le piante schermati sono necessarie per g ulteriorestudi enetic, non tagliare le cime prima di lavare le radici per la valutazione. Dopo la colorazione, e contando le masse di uova, trapiantare le piantine in organico del suolo, potare le cime pesantemente per ridurre la traspirazione, e mantenere in una serra. </li></ol> 6. Cowpea infezione Root in sacchetti e valutazione di infezione <ol><li> Contare il nematode inoculo e mescolare in un piatto di agitazione magnetica come descritto in precedenza. </li><li> Rimuovere le buste delle cartelle sospese e posto su una superficie orizzontale. Inoculare ogni busta con 1500 J2S in 5 ml. Sollevare il coperchio di plastica del sacchetto e distribuire i nematodi uniformemente sulla superficie delle radici. </li><li> Tenete i sacchetti in posizione orizzontale per 24 h dopo l&#39;inoculazione, coperto con carta scura per escludere la luce, per poi tornare alle cartelle sospese nella camera di crescita. </li><li> Annaffiare le piante, se necessario, una volta o due volte al giorno, con trattamento di mezza forza la soluzione di Hoagland (Hoagland e Arnon, 1950; Tabella 1 </strong&gt;) fino a una risposta al fertilizzante si osserva, più verde fogliame in genere una maggiore ripresa e la crescita più vigorosa. Di solito le piante vengono annaffiate con trattamento di mezza forza Hoagland 3 giorni di fila. Successivamente, tenere i sacchetti umido con acqua. </li><li> Circa 30 giorni (range 28-35 giorni) dopo l&#39;inoculazione, infondere ogni busta con circa 10-20 ml di 75 mg / L erioglaucine. Mantenere i sacchetti inondati con il colorante in posizione orizzontale durante la notte. </li><li> Scolate i sacchetti e valutare i sistemi di root contando le masse di uova sotto una lente d&#39;ingrandimento scrivania illuminata. </li><li> Se le piante schermati sono necessari per ulteriori studi genetici o di lavoro di allevamento, estrarre delicatamente le radici dal trapianto carta, in organica del suolo in vaso e di mantenere in una serra. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Le fasi appropriate di piante di pomodoro e cowpea per vaccinazioni nematodi per i due sistemi descritti sono mostrati nelle Figure1 e 2. Inoltre, esempi di ben-infette radici di pomodoro e cowpea sono mostrate nelle figure 4 e 5. Come nella maggior parte degli schermi resistenza alle malattie, è consigliabile utilizzare almeno 6-10 piante per genotipo per l&#39;inoculazione nematode per calcolare la media del tasso di infezione. Variazione infezione nematodi tra piante, dello stesso genotipo, può essere ridotto utilizzando impianti e dimensioni uniformi quantità precisa e di consegna di inoculo. L&#39;uso di vassoi e sacchetti di crescita consente lo screening di centinaia di migliaia di piante in uno spazio di crescita di piccole dimensioni. Sacchetti crescita consentono anche veloce ed efficiente valutazione non distruttiva di galligeni infezioni da nematodi senza necessità di radici di lavaggio (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> Figura 1. Una settimana-vecchio impianto di due fagiolo cresciuto in un sacchetto e pronte per root-knot NEMAtode inoculazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> Figura 2. A tre week-vecchia pianta di pomodori pronti per la root-knot inoculazione nematode. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> Figura 3. Un ago modificato e puntale usato per high-throughput inoculazione di nematodi. Il fondo di un ago è stato sigillato e tre serie di fori sono stati perforati nella ago utilizzando un fascio laser. Poi, l&#39;ago modificata è stata incollata a 5 ml punta della pipetta. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> Figura 4. Un sistema di radici di pomodoro infettato da nematodi galligeni. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> Figura 5. Un apparato radicale cowpea con masse di uova colorate con erioglaucine 30 giorni post-inoculazione cresciuta a28 ° C.

<ol>
	<li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway.">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li><li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea.">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li><li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.,+including+a+new+technique.">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li><li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid.">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li><li>Matkin, O. A., Chandler, P. A., Baker, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U.C.-type+soil+mixes.+In:+The+U.C.+system+for+producing+healthy+container-grown+plants.">The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. 23, 68-85 (1957).</li><li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature.">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li><li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita.">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li><li>Perry, R. N., Moens, M., Starr, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root-Knot Nematodes. , (2009).</li><li>Starr, J. L., Cook, R., Bridge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Resistance to Parasitic Nematodes. , (2002).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ci sono due passaggi critici per uno schermo nematode successo: la preparazione di un inoculo altamente infettivo e utilizzando gli impianti in fase di sviluppo adeguato. Tasso di schiusa delle uova galligeni nematodi è altamente variabile e spazia tra il 5 - 50%. Quindi, per ottenere livelli ottimali di portello e J2S altamente infettivi, particolare attenzione deve essere posta l&#39;estrazione delle uova da cova e le procedure. Le uova dovrebbero essere esposti alla candeggina per un periodo di tempo minimo e candeggina devono essere risciacquati bene dalla miscela di root. Quando cova le uova, l&#39;impasto che contiene le uova non devono essere immerso in acqua. Inoltre, evitare di versare le uova nel piatto sottostante Petri dove sono raccolti i giovani nati. Un modo per evitare di versare le uova durante il processo di cova, non è quello di aggiungere l&#39;acqua direttamente al Kimwipe della carta potrebbe rompersi. Invece aggiungere l&#39;acqua direttamente alla piastra di Petri. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare J2S appena nati. Se il hatch tasso è basso e più inoculo è necessario, J2S può essere conservato a 15 ° C per un periodo più lungo. Scaldare l&#39;inoculo conservato a temperatura ambiente per rivivere i nematodi prima inoculazione. Tuttavia, non conservare i J2S per periodi prolungati anche a 15 ° C come J2S affamati non in grado di infettare in modo efficiente. Piantine giovani sono il miglior stadio di sviluppo per l&#39;utente root-knot inoculazione nematode. Tuttavia, questo deve essere equilibrata con la formazione di un apparato radicale adeguato fornire un numero sufficiente di apici radicali come punti di entrata per i J2S. Il mantenimento di ottimali condizioni di crescita delle piante è essenziale anche per gli schermi. Evitare di venire l&#39;acquolina in impianti appositamente quelli coltivati ​​in sacchetti. Over-irrigazione dei sacchetti, come indicato da acqua stagnante nel fondo della sacca, può promuovere la crescita fungina e diminuire salute radice. Con entrambi i dosaggi di valutazione ulteriore infestazione da nematodi e calcolo del numero di uova / sistema di radici e uova / grammo di freradice sh può essere eseguita. Per i saggi di pomodoro, le radici individuali vengono pesati e uova estratte come descritto per la preparazione inoculo (sezione 3). Durante l&#39;elaborazione numero elevato di campioni di piante, sistemi radicali singoli potevano essere macerata usando un miscelatore per l&#39;estrazione delle uova. Il numero di uova deve essere contato in almeno tre aliquote e le uova / grammo di sistema radice fresca calcolato. Per i saggi sacchetto, il sistema della radice viene tirato fuori il foglietto di carta, pesati, e uova estratte.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Compound </td>
			<td>Concentration </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2 &bull; 4 H2O</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamp-ene Fe EDTA 13.0%</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>46 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 &bull; 4H2O</td>
			<td>9 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>0.00076 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &bull; 5H2O</td>
			<td>0.00032 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24 &bull; 4H2O</td>
			<td>0.00016 &mu;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Reagents for Hoagland's solution.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent </td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalogue number </td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erioglaucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC22973-0250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro for tomato</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>18-18-21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmocote</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedling growth pouches</td>
			<td>Mega International</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 25 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3886</td>
			<td>US standard #500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 90 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3880</td>
			<td>US standard #170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 425 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3871</td>
			<td>US standard #40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine mix</td>
			<td>Sun Gro Horticulture Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 2. Table of specific reagents and equipment.

high and low throughput screens with root-knot nematodes meloidogyne spp.

Nematodi galligeni (Meloidogyne genere) sono parassiti obbligati delle piante. Sono estremamente polifago e considerato uno dei nematodi parassiti economicamente più importanti. Il microscopico seconda fase giovanile (J2), una volta mutate nell&#39;uovo, è la fase infettiva. I J2S schiudono dalle uova, muoversi liberamente nel terreno all&#39;interno di una pellicola d&#39;acqua, e individuare punte delle radici delle specie di piante adatte. Dopo aver oltrepassato la radice, la loro migrazione verso il cilindro vascolare, dove creare un sito di alimentazione e avviare l&#39;alimentazione usando i loro stiletti. Il sito di alimentazione multicellulare è formato da diverse cellule ingrandite multinucleari chiamate &#39;cellule giganti&#39;, che sono formate da cellule che sottoposti a cariocinesi (ripetuto mitosi) senza citochinesi. Le cellule si dividono e si pericycle vicini allargare dimensioni dando origine ad una fiele tipico o nodo radice, il sintomo caratteristico di root-nodo infezione nematode. Una volta che l&#39;alimentazione è iniziato, J2S diventano sedentari e delle Nazioni Unitedergo tre mute supplementari per diventare adulti. La femmina adulta depone 150-250 uova in una matrice gelatinosa sopra o sotto la superficie della radice. Dalle uova si schiudono nuovi J2S infettive e iniziare un nuovo ciclo. La radice-nodo ciclo di vita del nematode si completa in 4-6 settimane a 26-28 ° C. Qui vi presentiamo il protocollo tradizionale per infettare piante, coltivate in vaso, con nematodi galligeni e due metodi di analisi high-throughput. Il primo high-throughput metodo viene utilizzato per le piante con semi di piccole dimensioni come pomodoro, mentre il secondo è per le piante con semi grandi come fagioli fagiolo e comune. Semi di grandi dimensioni sostenere la crescita estesa piantina con un minimo supplemento nutrizionale. Il primo test un&#39;elevata utilizza piantine coltivate in sabbia in vassoi, mentre negli impianti secondo saggio sono coltivate in bustine in assenza di terreno. Il sacchetto crescita delle piantine è fatto di un 15,5 x 12,5 centimetri stoppino di carta, piegata in alto per formare un 2-cm profondità trogolo in cui è posto il seme o piantina. Ilstoppino di carta è contenuto all&#39;interno di un sacchetto di plastica trasparente. Questi sacchetti di crescita permettono l&#39;osservazione diretta dei sintomi di infezione, i nematodi irritanti di radici e di massa produzione di uova, sotto la superficie di un sacchetto trasparente. Entrambi i metodi consentono l&#39;utilizzo degli impianti schermati, dopo fenotipo, per attraversare o semi produzione. Un ulteriore vantaggio dell&#39;uso di sacche di crescita è l&#39;ingombro ridotto perché buste vengono memorizzati in plastica cartelle sospese disposti in rack.

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High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Due metodi diversi per le piante schermo con nematodi galligeni sono descritti. Gli approcci descritti includono high-throughput schermi con nematodi in modo non distruttivo facilitare l&#39;uso di queste piante in programmi di allevamento.

Schermi throughput elevato e basso con Nematodi galligeni Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

27.7K Views.  University of California, Riverside. Due metodi diversi per le piante schermo con nematodi galligeni sono descritti. Gli approcci descritti includono high-throughput schermi con nematodi in modo non distruttivo facilitare l'uso di queste piante in programmi di allevamento.

Video: High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

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Immunologia e infezioni

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: High-throughput Quantificazione del Colony crescita e ritardo

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Istituzione e Ottimizzazione di un programma di installazione High Throughput per studiare<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infezione come modello per Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infezione di cellule HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

High-throughput di Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Un ad alta velocità, ad alto contenuto, liquido a base di c. elegans patosistema come contributo

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un High-throughput Shigella-specifica analisi battericida

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...