La recherche en laboratoire Kaloshian est financé par une subvention de États-Unis Institut national de l&#39;alimentation et l&#39;agriculture (2007-35607-17765). La recherche en laboratoire est Roberts financé par des subventions de l&#39;Agence des États-Unis pour le développement international (GDG-G-00-02-00012-00 et l&#39;EDH-A-00-07-00005) et de la Californie à sec Bean Conseil consultatif.

1. La croissance des semis de tomates en pots et plateaux <ol><li> Pour les essais en pot, les graines de tomates de plantes dans un pot dans un sol riche en matière organique comme le mélange de soleil. Maintenir dans une serre à 22-28 ° C. Après la germination, fertiliser une fois par semaine avec Miracle-Gro. </li><li> Environ deux semaines après la germination, à deux vrai stade de la feuille, transplanter individuellement les plantules dans des pots (10 cm de diamètre et 17 cm de profondeur) remplis de terre sablonneuse stérile contenant du sable 90% et 10% mélange organique. Ajouter Osmocote engrais à libération lente et à maintenir dans une serre à 22-28 ° C pendant deux semaines. Continuer à fertiliser les plantes une fois par semaine avec Miracle-Gro. </li><li> Pour les écrans à haut débit, des graines de plantes directement dans des bacs dans le sol sablonneux, de couvrir le bac avec une pellicule de plastique jusqu&#39;à la germination et de maintenir comme ci-dessus. Après la germination, ajouter Osmocote engrais à libération lente et fertiliser une fois par semaine avec Miracle-Gro. </li></ol> 2. La croissance du niébé dans des sachets de semis <ol><li> Seeds sont soit mises à germer dans une boîte de Pétri, bordée de plusieurs couches de papier Kimwipe, et transférés individuellement à poches ou placés directement dans la rainure du papier de la poche et ont germé. </li><li> Placez les sachets dans un dossier suspendu en plastique, deux par dossier, et d&#39;organiser les dossiers dans un rack en position verticale. Placer le support dans une chambre à environnement contrôlé maintenu à une température de 25-28 ° C et 16 h lumière / 8 h cycle d&#39;obscurité. Crémaillères peuvent également être maintenu dans une serre, mais nécessitent une feuille ou papier rigide couvercle placé au-dessus de la grille sur les deux côtés des tiges des plantes, afin de réduire les risques de contamination fongique. </li><li> Les sachets d&#39;eau une ou deux fois par jour avec de l&#39;eau par osmose inverse. Environ 10 à 14 jours après le semis, quand un système racinaire adéquat avec des racines tertiaires a développé (Figure 1), les plants sont prêts pour l&#39;inoculation. </li></ol> 3. Extraction des œufs de nématodes Extraction de l&#39;eggs de racines infectées est modifiée à partir d&#39;un protocole développé par Hussey et Barker (1973). <ol><li> Trois à quatre jours avant l&#39;inoculation des nématodes, d&#39;extraire les œufs de nématodes à galles des racines de tomate infectées. Avant de commencer l&#39;extraction d&#39;oeufs, lavez la zone de travail à l&#39;eau chaude pour éviter la contamination. Aussi laver à l&#39;eau chaude a. Mélangeur, deux seaux, un support en treillis métallique, un maillet en caoutchouc, trois tamis de 425, 90 et 25 um d&#39;ouverture, une éprouvette graduée et les ciseaux </li><li> Empilez les tamis de haut en bas dans l&#39;ordre suivant: 425, 90 et 25 um d&#39;ouverture. Les oeufs seront recueillis sur le tamis de 25 um au fond. Mettez les tamis sur un treillis métallique pris en charge dans un évier. Mettre un seau sous le treillis métallique pour recueillir la solution d&#39;exécution à travers. </li><li> Couper le dessus de la plante infectée (s), utilisés comme source de l&#39;inoculum, et le jeter. Retirez délicatement la plante du pot. Laver les racines en les trempant dans un seau en plastique rempli d&#39;eau. Rincer les racines supplémentaires en vertu de courirNing eau jusqu&#39;à ce que les particules de sol sont emportés par les racines. </li><li> Couper les racines avec des ciseaux en petits morceaux. Éliminer la racine pivotante. </li><li> Mettez les racines hachées à partir d&#39;une seule plante dans un grand pot en plastique avec un couvercle, ajoutez juste assez solution javellisée à 10% pour couvrir les racines et fermez le couvercle. </li><li> Agiter le bocal contenant les racines pendant 2 min. </li><li> Ouvrez le bocal et verser les racines sur le tamis supérieur et laver avec un tuyau attaché à une buse de brumisation. Lavez bien jusqu&#39;à ce que tout l&#39;odeur de javel ait disparu. Utilisez un maillet pour enfoncer les côtés des tamis pour éviter le colmatage des pores de tamis. </li><li> Retirer le tamis supérieur et rincer les débris sur le deuxième tamis. </li><li> Retirer le deuxième tamis et recueillir les débris fines, qui comprend les oeufs, de l&#39;dernier tamis. Avec un léger courant d&#39;une bouteille d&#39;eau, déplacer les débris d&#39;un côté du tamis. Recueillir les débris et les œufs dans un bécher propre avec une quantité minimum d&#39;eau. </li><li> Tamisez une fois de plus l&#39;eau recueillie dans leseau à travers le tamis 25 um pour recueillir les œufs qui auraient pu échapper. Rincez bien avec de l&#39;eau et de recueillir dans le même bécher. </li><li> Jeter les débris végétaux de la grille supérieure et se laver soigneusement tous les trois tamis avec de l&#39;eau sous pression. Ne touchez pas la partie des mailles des tamis car il peut fausser la taille des pores. </li></ol> 4. Œufs de nématodes d&#39;incubation <ol><li> Tapisser un panier métallique propre avec quelques couches de papier Kimwipe et tenir sur un plat en verre de Petri. Permettre à une distance de 1 cm entre le fond du panier et le plat. </li><li> Verser les œufs de nématodes extraits sur le papier dans le panier métallique. Ajouter suffisamment de liquide pour que le fond du panier de fil touche la surface de l&#39;eau, mais n&#39;est pas immergé dans l&#39;eau. Couvrir le dessus avec un couvercle en plastique. </li><li> Chaque jour, vérifier l&#39;évaporation de l&#39;eau et ajouter un peu d&#39;eau dans la boîte de Pétri de sorte que le fond du panier touche l&#39;eau. Cela permettra d&#39;éviter les œufs de se dessécher. </li><li> Chaque autre jour, de recueillir l&#39;water qui contient les J2 des boîtes de Pétri dans un bécher. S&#39;il n&#39;est pas utilisé immédiatement, il faut aérer l&#39;inoculum recueillies à la température ambiante en utilisant une alimentation en air de laboratoire ou de l&#39;air générée par une pompe d&#39;aquarium. Utilisez l&#39;inoculum aéré dans les 2 jours. J2 peuvent être collectées à partir de l&#39;éclosion mis en place sur une période de 6-8 jours. </li></ol> 5. Infection des racines de tomate dans des pots et d&#39;évaluation des maladies infectieuses <ol><li> Utilisation trois aliquotes des nématodes collectées pour compter le nombre de J2 dans une glissière de comptage ou plat, calculer la moyenne et de déterminer le volume désiré pour l&#39;inoculation. Typiquement 3000 J2 sont utilisées par plante dans des pots et 500 J2S pour les plantes cultivées en bacs de semis. </li><li> Incorporer l&#39;inoculum sur une plaque d&#39;agitation magnétique à faible vitesse. </li><li> Avant de vous inoculer les plantes, assurez-vous que le sol est humide mais pas trop humide. Pour l&#39;inoculation pot, faire trois trous d&#39;environ la moitié du pot de profondeur dans le sable autour de chaque système de racine de tomate à l&#39;aide d&#39;un crayon (Figure 2 </strong&gt;). Inoculer chaque plante en fournissant les J2 dans les trois trous à l&#39;aide d&#39;une pipette. Ensuite, recouvrir les trous. </li><li> Pour les écrans à haut débit dans les bacs, utiliser une aiguille pointe modifiée scellée avec des trous sur les côtés collés à une pointe de 5 ml pipette le long d&#39;une pipette (Figure 3) pour fournir les J2 dans le sol. Alternativement, les nématodes peuvent être livrés que dans l&#39;étape 5.3. </li><li> Maintenir les plantes dans une serre à 24-27 ° C pendant six à huit semaines. Continuer à fertiliser deux fois par mois avec Miracle-Gro. </li><li> Pour l&#39;évaluation de l&#39;infection, retirer soigneusement les plantes des pots et laver les racines (comme décrit dans l&#39;étape 3.3). </li><li> Colorer les masses d&#39;œufs bleus en immergeant les racines de 1 mg / L érioglaucine, pendant 15 min. </li><li> Rincez les pieds dans l&#39;eau et d&#39;évaluer en comptant les masses d&#39;œufs colorés sur le système racine individuelle. Une loupe bureau lumineux peut être utilisé pour aider à visualiser les masses d&#39;œufs. </li><li> Si les plantes blindés sont nécessaires pour g en outreétudes enetic, ne coupez pas les sommets avant le lavage des racines pour l&#39;évaluation. Après la coloration, et le comptage des masses d&#39;œufs, repiquer les plantules dans un sol organique, taillez les sommets fortement à réduire la transpiration, et de maintenir dans une serre. </li></ol> 6. Infection des racines du niébé dans les poches et d&#39;évaluation des maladies infectieuses <ol><li> Comptez le inoculum de nématode et remuer sur une plaque d&#39;agitation magnétique, comme décrit précédemment. </li><li> Retirez les sachets des dossiers suspendus et les placer sur une surface horizontale. Inoculer chaque sachet de 1500 J2 dans 5 ml. Soulevez le couvercle en plastique de la poche et de distribuer les nématodes uniformément sur la surface des racines. </li><li> Gardez les sachets dans une position horizontale pendant 24 h après l&#39;inoculation, recouvert de papier noir pour exclure la lumière, puis revenir à des dossiers suspendus dans la chambre de croissance. </li><li> Arroser les plantes selon les besoins, une ou deux fois par jour, avec demi-concentration de la solution de Hoagland (Hoagland et Arnon, 1950; Tableau 1 </&gt; forte) jusqu&#39;à ce qu&#39;une réponse à l&#39;engrais est observée, écologisation feuillage généralement renforcée et la croissance des pousses plus énergique. Habituellement, les plantes sont arrosées avec une demi-force Hoagland 3 jours dans une rangée. Ensuite, garder les sachets humide avec de l&#39;eau. </li><li> Environ 30 jours (intervalle de 28-35 jours) après l&#39;inoculation, infuser chaque sachet avec environ 10-20 ml de 75 mg / L érioglaucine. Gardez les sachets inondées avec le colorant dans une position horizontale pendant la nuit. </li><li> Égoutter les poches et d&#39;évaluer les systèmes racinaires en comptant les masses d&#39;œufs en vertu d&#39;une loupe bureau éclairé. </li><li> Si les plantes blindés sont nécessaires pour d&#39;autres études génétiques ou de travail d&#39;élevage, retirez soigneusement les racines du papier, la transplantation dans un sol organique dans des pots et de maintenir dans une serre. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Les étapes appropriées de plants de tomates et de niébé pour des inoculations de nématodes pour les deux systèmes décrits sont illustrés aux figures1 et 2. En outre, des exemples de bien-infectés racines de tomate et le niébé sont présentés dans les figures 4 et 5. Comme dans la plupart des écrans de résistance aux maladies, il est conseillé d&#39;utiliser au moins 6-10 plantes par génotype pour l&#39;inoculation des nématodes pour calculer la moyenne du taux d&#39;infection. Variation de l&#39;infection des nématodes entre les plantes, de la même génotype, peut être réduite en utilisant la taille uniforme des plantes et la quantité exacte et la distribution de l&#39;inoculum. L&#39;utilisation de plateaux et de pochettes de croissance permet de dépister des centaines de milliers de plantes dans un espace de croissance faible. Sachets de croissance aussi rapide et efficace de permettre l&#39;évaluation non destructive des infections de nématodes à galles sans avoir besoin de racines de lavage (Figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> Figure 1. Une plante vieille de deux semaines niébé cultivé dans une poche et prêt pour l&#39;utilisateur root-knot nématodestode inoculation. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> Figure 2. Une plante de tomate trois semaines d&#39;âge prêt à être ensemencé nématode à galles. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> Figure 3. Une aiguille modifié et pointe de la pipette utilisée pour l&#39;inoculation à haut débit de nématodes. Le fond d&#39;une aiguille a été scellé et trois séries de trous ont été forés dans l&#39;aiguille à l&#39;aide d&#39;un faisceau laser. Ensuite, l&#39;aiguille modifiée a été collé à un bout de 5 ml pipette. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> Figure 4. Un système de racine de tomate infectée par les nématodes à galles. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> Figure 5. Un système racinaire du niébé avec les masses d&#39;œufs colorés avec érioglaucine 30 jours post-inoculation augmenté à28 ° C.

<ol>
	<li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway.">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li><li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea.">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li><li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.,+including+a+new+technique.">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li><li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid.">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li><li>Matkin, O. A., Chandler, P. A., Baker, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U.C.-type+soil+mixes.+In:+The+U.C.+system+for+producing+healthy+container-grown+plants.">The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. 23, 68-85 (1957).</li><li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature.">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li><li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita.">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li><li>Perry, R. N., Moens, M., Starr, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root-Knot Nematodes. , (2009).</li><li>Starr, J. L., Cook, R., Bridge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Resistance to Parasitic Nematodes. , (2002).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Il ya deux étapes essentielles pour un écran de nématodes succès: la préparation d&#39;un inoculum très infectieux et l&#39;utilisation de plantes au stade de développement approprié. Taux d&#39;éclosion des œufs de nématodes Meloidogyne est très variable et se situe entre 5 à 50%. Par conséquent, pour obtenir des niveaux optimaux de trappe et J2 très infectieux, une attention particulière doit être accordée à l&#39;extraction d&#39;oeufs à couver et des procédures. Oeufs doit être exposé à de blanchiment pendant une période de temps minimum et de blanchiment doit être rincé et à partir du mélange de racine. Une fois l&#39;éclosion des œufs, la suspension contenant les œufs ne doivent pas être immergé dans l&#39;eau. En outre, d&#39;éviter de renverser les oeufs dans le plat sous-jacent de Petri où les juvéniles éclos sont recueillis. Une façon pour éviter de renverser les œufs pendant le processus d&#39;éclosion est de ne pas ajouter de l&#39;eau directement à la Kimwipe que le papier peut se rompre. Au lieu de cela, ajouter l&#39;eau directement à la boîte de Petri. Pour de meilleurs résultats, utilisez J2 fraîchement écloses. Si le hatctaux de h est faible et plus l&#39;inoculum est nécessaire, J2 peut être conservé à 15 ° C pendant une période plus longue. Réchauffez l&#39;inoculum stocké à température ambiante pour faire revivre les nématodes avant l&#39;inoculation. Cependant, ne pas stocker les J2 pendant des périodes prolongées, même à 15 ° C comme J2 affamés ne seront pas infecter efficacement. Les jeunes plantules sont le meilleur stade de développement pour l&#39;inoculation nématode à galles. Toutefois, cela doit être équilibré avec la formation d&#39;un système racinaire suffisant fournir un nombre suffisant de pointes racinaires comme points d&#39;entrée pour les J2. Le maintien optimal des conditions de croissance des plantes est également critique pour les écrans. Évitez de trop d&#39;arrosage des plantes spécialement celles qui sont cultivées dans des sachets. Au cours de l&#39;arrosage des sachets, comme indiqué par l&#39;eau stagnante dans le fond de la poche, peut favoriser la croissance fongique et de diminuer la santé des racines. Avec à la fois l&#39;évaluation des tests de l&#39;infection des nématodes et le calcul du nombre d&#39;œufs ou système racinaire et les œufs / gramme de fréquenceracine sh peut être effectuée. Pour les tests de tomates, des racines individuelles sont pesés et les œufs extraits comme décrit pour la préparation d&#39;inoculum (section 3). Lors du traitement de grand nombre d&#39;échantillons de plantes, les systèmes racinaires individuelles pourraient être macérés à l&#39;aide d&#39;un mélangeur pour l&#39;extraction de l&#39;œuf. Le nombre d&#39;oeufs doivent être comptés dans au moins trois aliquotes et les œufs / gramme de système de racine fraîche calculée. Pour les tests de poche, le système racinaire est retiré l&#39;insert papier, pesé, et les œufs extrait.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Compound </td>
			<td>Concentration </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2 &bull; 4 H2O</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamp-ene Fe EDTA 13.0%</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>46 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 &bull; 4H2O</td>
			<td>9 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>0.00076 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &bull; 5H2O</td>
			<td>0.00032 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24 &bull; 4H2O</td>
			<td>0.00016 &mu;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Reagents for Hoagland's solution.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent </td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalogue number </td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erioglaucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC22973-0250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro for tomato</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>18-18-21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmocote</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedling growth pouches</td>
			<td>Mega International</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 25 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3886</td>
			<td>US standard #500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 90 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3880</td>
			<td>US standard #170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 425 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3871</td>
			<td>US standard #40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine mix</td>
			<td>Sun Gro Horticulture Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 2. Table of specific reagents and equipment.

high and low throughput screens with root-knot nematodes meloidogyne spp.

Les nématodes à galles (Meloidogyne genre) sont des parasites de plantes obligatoires. Ils sont extrêmement polyphages et considéré comme l&#39;un des nématodes parasitaires importantes économiquement la plus. Le microscope de deuxième stade juvénile (J2), mué une fois dans l&#39;œuf, est le stade infectieux. Les J2 éclore des oeufs, se déplacer librement dans le sol dans un film d&#39;eau, et de localiser les extrémités des racines d&#39;espèces végétales adaptées. Après avoir pénétré dans la racine de la plante, ils migrent vers le cylindre vasculaire où ils établissent un site d&#39;alimentation et d&#39;initier l&#39;alimentation à l&#39;aide de leurs stylets. Le site d&#39;alimentation multicellulaire est composé de plusieurs cellules multinucléées appelées agrandies des cellules géantes qui sont formés à partir de cellules qui ont subi une caryocinèse (répété la mitose) sans cytokinèse. Cellules du péricycle voisins diviser et agrandir la taille donnant lieu à une galle typique ou d&#39;un noeud racine, le symptôme caractéristique de l&#39;infection nématode à galles. Une fois que l&#39;alimentation est initiée, J2 devenus sédentaires et nondergo trois mues supplémentaires à devenir des adultes. La femelle adulte pond des œufs 150-250 dans une matrice gélatineuse sur ou sous la surface de la racine. A partir des oeufs infectieux J2 nouvelles éclosent et commencer un nouveau cycle. Le cycle de nématodes à galles vie est achevée en 4-6 semaines à 26-28 ° C. Ici, nous présentons le protocole traditionnel pour infecter les plantes, cultivées dans des pots, avec les nématodes à galles et deux méthodes pour tests à haut débit. Le premier haut-débit méthode est utilisée pour les plantes à petites graines comme la tomate alors que le second est pour les plantes à grosses graines telles que le haricot niébé et commune. Les grosses graines soutenir la croissance des semis prolongé avec supplément nutritif minimal. Le dosage de débit première haute utilise plantules cultivées dans du sable dans des plateaux tandis que dans les plantes d&#39;essai seconds sont cultivées dans des sachets en l&#39;absence de sol. Le sachet croissance des plants est faite d&#39;une mèche 15,5 x 12,5 cm papier, pliée vers le haut pour former une auge de 2 cm de profondeur dans lequel la semence ou des semis est placé. Lamèche de papier est contenue dans un sachet en plastique transparent. Ces sachets de croissance permettent une observation directe des symptômes d&#39;infection des nématodes, des galles sur les racines et la production de masse d&#39;œufs, sous la surface d&#39;une pochette transparente. Ces deux méthodes permettent l&#39;utilisation des plantes blindés, après le phénotypage, pour le franchissement ou la production de semences. Un avantage supplémentaire de l&#39;utilisation de sachets de croissance est le faible encombrement, car sachets en plastique sont stockés dans des dossiers suspendus disposés dans des casiers.

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High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Deux méthodes distinctes pour les plantes d&#39;écran avec les nématodes à galles sont décrits. Les approches décrites comprennent à haut débit écrans avec les nématodes d&#39;une manière non destructive de faciliter l&#39;utilisation de ces plantes dans les programmes de sélection.

Écrans à haut débit et faible avec Les nématodes à galles Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

27.7K vues.  University of California, Riverside. Deux méthodes distinctes pour les plantes d'écran avec les nématodes à galles sont décrits. Les approches décrites comprennent à haut débit écrans avec les nématodes d'une manière non destructive de faciliter l'utilisation de ces plantes dans les programmes de sélection.

Vidéo: High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Recherche

Immunologie et infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: haut débit Quantification de Colony croissance et décalage

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Scalable High Throughput sélection à partir de bibliothèques d&#39;anticorps synthétiques phage

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infection des cellules HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Haut-débit Gene Tagging dans<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Un haut débit et haute teneur, liquide à base de c. elegans pathosystème

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...