Este método poderia ajudar no desenvolvimento de variedades de algodão resistente a nematoides reniformes. Através da identificação de genótipos resistentes de outras espécies de algodão e da avaliação de populações reprodutoras. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um método simples e não destrutivo para triagem de nematoides reniformes.
Comece colocando uma bola de algodão no fundo de um diâmetro de quatro centímetros, 21 potes de plástico cônico de altura central por semente. E enchendo os potes com mistura de solo pasteurizado a vapor a aproximadamente dois centímetros do topo da panela. Coloque uma estaca de plástico em cada pote designando o genótipo a ser plantado e plante uma semente do genótipo de algodão correspondente apropriado em cada pote.
Encha cada pote com solo adicional para cobrir a semente e coloque os potes em uma câmara de crescimento definida para temperatura constante de 28 graus Celsius com um período de foto de lâmpada fluorescente e incandescente de 16 horas. Em seguida, coloque os emissores de água em cada panela e use um sistema de rega automática para regar os vasos duas vezes ao dia. Sete dias após o plantio, crie uma pequena depressão no solo ao lado de cada planta e adicione um mililitro de suspensão de nematode reniforme em cada depressão.
Após a inoculação, a água da panela precisa ser cuidadosamente controlada para evitar lavar os nematoides da zona raiz. 28 dias após a inoculação, use a tesoura para remover a maioria das folhas totalmente expandidas das plantas antes de espremer cada panela e deslizar o solo em uma mão para remover as plantas. Agitar suavemente o sistema radicular na água da torneira em um recipiente de 10 litros para remover o solo das raízes, seguido de uma breve lavagem em um recipiente de água limpa da torneira.
Use uma tesoura para remover o sistema radicular limpo da planta aproximadamente um centímetro abaixo da linha do solo. Coloque as raízes em um recipiente de espécime descartável plástico de 120 mililitros não estéril. Em seguida, cubra completamente o sistema radicular com aproximadamente 30 mililitros de solução de coloração de alimentos vermelhos e coloque o recipiente de espécime em um forno de micro-ondas para aquecimento da solução de coloração até que comece a ferver.
Quando a amostra tiver esfriado à temperatura ambiente, substitua a solução de coloração de alimentos vermelhos por 100 mililitros de água da torneira para remover qualquer excesso de mancha. Em seguida, coloque a tampa no recipiente da amostra e armazene a amostra a quatro graus Celsius até a análise da infecção radicular. Para recuperar as plantas para produção de sementes, coloque uma bola de algodão no fundo de um novo pote de plástico cônico e encha parcialmente a panela com meio de vaso de musgo de turfa.
Coloque um sistema radicular colhido em um tiro vegetativo na panela e adicione firmemente meio de vaso para encher a panela. Coloque uma nova estaca de plástico etiquetada em cada pote para designar o genótipo de algodão e coloque a bandeja de potes em um recipiente plástico de água. Regar brevemente as plantas para umedecer o meio de vaso e colocar os potes em uma câmara de crescimento definida a uma temperatura constante de 28 graus Celsius e um período de 16 horas de foto.
Após aproximadamente 30 dias, encha parcialmente um pote plástico de seis litros por planta com meio de vaso. Transfira cada planta em um pote de seis litros, adicionando firmemente meio de vaso a cada vaso à medida que cada muda é plantada. Em seguida, coloque as plantas em uma casa de vidro e adicione água para umedecer o meio de vaso.
Para avaliar a infecção raiz R.reniformis, remova uma amostra raiz do recipiente da amostra. Use um microscópio estéreo para contar o número de nematoides femininos ligados ao sistema radicular sob ampliação de 20X. Uma infecção bem-sucedida do sistema radicular nematoide pode ser influenciada por vários fatores, incluindo a viabilidade do nematoide usado para a inoculação e variação sazonal, já que os nematoides são menos ativos durante os meses de inverno.
Em seguida, coloque o sistema radicular em toalhas de papel por aproximadamente 10 minutos para remover o excesso de umidade. Pesar o sistema radicular para determinar o peso fresco da raiz. Variações no crescimento das raízes são comuns entre excisões.
Essas variações, medida pelo peso raiz fresco, também podem ser observadas entre plantas do mesmo genótipo. Relativamente menos nematoides reniformes femininos são capazes de estabelecer um local de alimentação para o genótipo de algodão resistente em comparação com o genótipo suscetível. Os dados de peso raiz fresco podem ser usados para calcular o número de nematoides reniformes femininos por grama de tecido radicular para cada genótipo.
O número de nematoides reniformes femininos por grama de raiz para genótipos resistentes é geralmente inferior a 10, enquanto genótipos suscetíveis normalmente têm mais de 30 nematoides por grama de raiz. Aqui, um subconjunto de dados de uma população segregadora de F2 que incluía 300 plantas é mostrado. Essas faixas de variação para crescimento radicular e infecção por nematoides dos sistemas radiculares são comumente observadas para avaliações de nematoides, ilustrando a capacidade deste procedimento de ser usado para triagem de um grande número de plantas em um único experimento, para minimizar essa variação, e para facilitar uma avaliação precisa da genética da resistência.
Após este procedimento, a genética da resistência à nematoide reniforma pode ser determinada para identificar os marcadores de DNA associados à resistência. Esses marcadores podem então ser usados para a reprodução assistida por marcadores e para a transferência de resistência ao nematoide para o algodão do interior. Após seu desenvolvimento, essa técnica forneceu um método não destrutivo para permitir que os pesquisadores recuperassem plantas após o reestruquemento do nematoides para auxiliar na criação de variedades de algodão resistente.
