Kaloshian laboratuar Araştırma Gıda ve Tarım Birleşik Devletleri Ulusal Enstitüsü (2007-35607-17765) bir hibe ile finanse edilmektedir. Roberts laboratuarında Araştırma Uluslararası Kalkınma Birleşik Devletleri Ajansı hibe (GDG-G-00-02-00012-00 ve EDH-A-00-07-00005) ve Kaliforniya Kuru Fasulye Danışma Kurulu tarafından finanse edilmektedir.

1. Tencere ve Kaset Domates Fide Gelişimi <ol><li> Için pot deneyleri, bu Sunshine karışımı olarak organik bir zengin toprak tek bir saksı içinde domates tohumu. 22-28 bir serada koruyun ° C Çimlenme sonra, Miracle-Gro ile haftada bir kez döller. </li><li> Yaklaşık iki hafta çimlenme sonrası, iki gerçek yaprak aşamasında,% 90 kum ve% 10 organik karışımı içeren steril kumlu toprakla doldurulmuş kaplar (10 cm çapında ve derin 17 cm) içine tek tek fidan nakli. Yavaş salınımlı gübre Osmocote ve iki hafta boyunca 22-28 ° C&#39;de bir serada muhafaza ekleyin. Miracle-Gro ile haftada bir kez bitki dölleme devam edin. </li><li> Yüksek verimli ekranlar için, doğrudan kumlu topraklarda kasetlere bitki tohumları çimlenme kadar plastik örtü ile tepsisi kapağı ve yukarıda belirtildiği gibi korumak. Çimlenme sonra, yavaş salınımlı gübre Osmocote ve Miracle-Gro ile haftada bir kez gübrelemek ekleyin. </li></ol> 2. Fide Torbalar içinde Börülce Büyüme <ol><li> Seeds ya, bir Petri kabındaki çimlenmiş Kimwipe birçok kağıt tabakaları ile kaplı ve çantaları için tek başına transfer veya kese kağıdı oluk içine doğrudan yerleştirilen ve çimlenmiş edilir. </li><li> Klasör başına bir plastik asılı dosya klasörü, iki poşet yerleştirin ve dik bir konumda rafa klasörleri düzenlemek. 25-28 bir sıcaklık ° C ve 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık döngüsü tutulan kontrollü bir-çevre odasındaki rafa yerleştirin. Racklar ayrıca bir serada korunur, fakat mantar açısından potansiyel azaltmak için, bir folyoya ya da bitki gövdesinin her iki tarafında raf üzerine yerleştirilir sert kağıt kapak ihtiyaç olabilir. </li><li> Reverse osmosis su ile bir veya iki kez günlük su torbası. Ekim sonrası yaklaşık 10 ile 14 gün, üçüncül kök uçları ile yeterli bir kök sistemi meydana geldiğinde (Şekil 1), fide aşılama için hazırız. </li></ol> 3. Nematodu Yumurta çıkarımı E çıkarımıEnfekte köklerinden ggs Hussey ve Barker (1973) tarafından geliştirilen bir protokol üzerinden değiştirilebilir. <ol><li> Üç dört gün nematod aşılamadan önce, enfekte domates köklerinden kök-ur nematod yumurtaları ayıklamak. Yumurta çıkarma başlamadan önce, kontaminasyonu önlemek için sıcak su ile iyice çalışma alanı yıkayın. Ayrıca sıcak suda yıkayın bir blender, iki kova, bir tel örgü desteği, lastik tokmak, 425 üç elekler, 90 ve 25 mikron diyafram, bir Mezür ve makas. </li><li> 425, 90 ve 25 mikron diyafram: aşağıdaki sırayla yukarıdan aşağıya doğru elekler biriktirin. Yumurta altındaki 25 mikron elek üzerinde toplanır. Bir lavabo desteklenen bir hasır üzerinde elekler koyun. Çalışma ile çözüme toplamak için hasır altında bir kova koyun. </li><li> Inokulum kaynağı olarak kullanılan hastalıklı bitki (ler) üstleri, kesin ve atın. Dikkatlice pottan bitki çıkarın. Su dolu bir kovaya daldırma kökleri yıkayın. Çalıştırmak altında başka kökleri durulayıntoprak parçacıkları köklerinden yıkanmasını kadar su ning. </li><li> Küçük parçalar halinde makasla kökler kesilir. Kazık kök atın. </li><li> Kapaklı bir büyük plastik kavanoza tek bir bitki kıyılmış kök koyun, kökleri kapağı ve kapağı kapatmak için yeterli% 10 çamaşır suyu ekleyin. </li><li> 2 dakika kökleri içeren kavanozu çalkalayın. </li><li> Jar açın ve üst elek üzerine kökleri dökün ve bir sisleme nozul takılı bir hortumla yıkayın. Tüm çamaşır suyu kokusu bitene kadar iyi yıkanmalıdır. Elek gözeneklerin tıkanmasını önlemek için elekler kenarlarına dokunun bir çekiç kullanın. </li><li> Üst elek kaldırın ve ikinci elek üzerinde enkaz durulayın. </li><li> İkinci elek çıkarın ve son elek yumurta içerir ince enkaz toplamak. Bir şişe su bir yumuşak akışı ile, elek bir yana enkaz taşıyın. Su minimum miktarda temiz bir behere enkaz ve yumurta toplayın. </li><li> Elek bir kez daha su içinde toplanankaçmış olabilecek yumurta toplamak için 25 mikron elekten kova. Su ile iyice durulayın ve aynı behere koyunuz. </li><li> Üst elek bitki artıkları atın ve basınçlı su ile iyice üç elekler yıkayın. Bu gözenek boyutu bozabilir olarak elekler örgü parçası dokunmayın. </li></ol> 4. Kuluçka Nematodu Yumurta <ol><li> Hat temiz bir metal Kimwipe kağıt bir kaç kat sepeti ve bir cam petri sığmaktadır. Sepeti ve tabağın tabanına arasında 1 cm mesafe bırakın. </li><li> Tel sepet içinde kağıda çıkarılan nematod yumurtaları dökün. Tel sepet alt su yüzeyine çarpar ama suya batırılır değil ki yeterince sıvı ekleyin. Plastik bir kapak ile üst kapak. </li><li> Her gün su buharlaşmasını kontrol ve sepet altında su temas böylece petri biraz su ekleyin. Bu kurumasını yumurta önleyecektir. </li><li> Her gün, wa toplamakBir behere Petri gelen J2S içeren ter. Derhal kullanılmadığı takdirde, bir akvaryum pompası tarafından üretilen bir laboratuvar hava veya hava ile oda sıcaklığında toplanan inokulum havalandırır. 2 gün içinde gazlı inokulum kullanın. J2S 6-8 günlük bir süre boyunca ayarlamak kuluçka elde edilebilir. </li></ol> 5.. Tencere veya Tepsiler ve Enfeksiyon Değerlendirilmesinde Domates Kök Enfeksiyon <ol><li> Bir sayma slayt veya çanak J2S sayısını saymak için toplanan nematod üç alikotları kullanın, ortalamasını ve aşılama için istenen hacmi belirler. Genellikle 3000 J2S tencere ve fide tepsiler yetiştirilen bitkiler için 500 J2S bitki başına kullanılır. </li><li> Düşük hızda bir manyetik karıştırma plaka üzerinde inokulum karıştırın. </li><li> Eğer bitkiler aşılamak önce, toprağı nemli ama çok ıslak olmadığından emin olun. Pot aşılama için (Şekil 2, bir kalem yardımıyla her domates kök sistemi etrafında kum yaklaşık yarım kap derinliği üç delik açmak </strong&gt;). Bir pipet kullanarak üç delik içine J2S sunarak her bitkinin inoküle. Daha sonra, delikler kapsamaktadır. </li><li> Tepsilerde yüksek verimlilik ekranlar için, toprağa J2S teslim etmek için bir pipetter boyunca 5 ml pipet ucu (Şekil 3) yapıştırılmış tarafta delikli bir modifiye kapalı uçlu iğne kullanın. Alternatif olarak, nematod adım 5.3 olarak teslim edilebilir. </li><li> 24-27 bir sera bitkileri korumak ° C altı ila sekiz hafta boyunca. Miracle-Gro ile ayda iki kez gübrelemek için devam edin. </li><li> Enfeksiyon değerlendirilmesi için, dikkatle tencere gelen bitkiler kaldırmak ve kökleri (as adım 3.3 &#39;de açıklandığı gibi) yıkayın. </li><li> 15 dakika boyunca, 1 mg / L erioglaucine içinde kökler daldırarak mavi yumurta kütleler leke. </li><li> Su kökleri durulayın ve bireysel kök sistemine lekeli yumurta kitleler sayarak değerlendirmek. Bir ışıklı masa büyüteci yumurta kitlelere görselleştirmek yardımcı olmak için kullanılabilir. </li><li> Elenmiş bitkiler daha g için gerekli iseenetic çalışmaları, değerlendirme için kökleri yıkamadan önce üstleri kesmeyiniz. Yumurta kitleler boyama ve sayım sonrası, bir serada, organik toprak fide nakli terlemeyi azaltmak için yoğun üstleri budamak ve korumak. </li></ol> 6. Torbalar ve Enfeksiyon Değerlendirilmesinde Börülce Kök Enfeksiyon <ol><li> Nematod inokulum sayın ve daha önce açıklandığı gibi bir manyetik karıştırma plaka üzerinde karıştırın. </li><li> Yatay bir yüzey üzerinde asılı klasörler ve yerden torbalar çıkarın. 5 ml 1500 J2S ile birlikte her bir kılıf inoküle. Torba plastik kapağını kaldırın ve köklerin yüzeyi üzerinde eşit biçimde nematodlar dağıtmak. </li><li> Işık dışarıda karanlık kağıt kaplı aşılama, 24 saat sonra bir yatay konumda torbalar tutun, daha sonra büyüme odasında asılı klasörleri geri dönün. </li><li> Tablo 1; yarım gücü Hoagland çözümü (Hoagland ve Arnon, 1950 ile bir kez ya da günde iki kez gerektiği gibi su bitkileri, </strong&gt;) gübre bir yanıt elde edilinceye kadar, tipik olarak gelişmiş yeşillik yeşillendirilmesi ve daha dinç sürgün büyümesi. Genellikle bitkilerin üst üste yarım gücü Hoagland 3 gün ile sulandırılmıştır. Daha sonra su ile torbalar nemli tutmak. </li><li> Yaklaşık 30 gün (dağılım 28-35 gün) aşılama sonra, 75 mg / L erioglaucine 10-20 ml kadar her kese süzülür. Gecede yatay konumda boya ile sular altında torbalar tutun. </li><li> Torbalar boşaltın ve ışıklı masa büyüteci altında yumurta kitleler sayarak kök sistemleri değerlendirmek. </li><li> Ekranlı bitkiler ve genetik çalışmalar veya ıslah çalışmaları için gerekli ise, dikkatli bir serada saksıda organik toprak kağıt, nakil gelen kökleri çekin ve korumak. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Açıklanan iki sistemleri için nematodu aşılar için domates ve börülce bitkilerin uygun bir aşamada şekillerde gösterilmiştir1 ve 2. Buna ek olarak, domates ve börülce arasında iyi enfekte kökler örnekler Şekil 4 ve 5 de gösterilmiştir. Çoğu hastalık direnci ekranlarda olduğu gibi, enfeksiyon oranı ortalama hesaplamak için nematod aşılama için genotip için en az 6-10 bitkilerin kullanılması tavsiye edilir. Bitkiler arasındaki nematod enfeksiyonu farklılık, aynı genotip, üniforma tesis büyüklüğü ve doğru miktarda ve inokulum teslim kullanılarak azaltılabilir. Tepsiler ve büyüme torbaların kullanımı küçük bir büyüme alanı bitkilerin binlerce yüz tarama sağlar. Büyüme torbalar da çamaşır kökleri (Şekil 4) gerek olmadan kök-ur nematod enfeksiyonlarının hızlı ve etkili tahribatsız değerlendirme sağlar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> Şekil 1. Iki haftalık börülce bitki kese yetişen ve kök-ur nema için hazıraşılama Tode. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> Şekil kök-ur nematodu aşılama için 2. Üç haftalık domates bitkisi hazır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> Şekil 3. Nematodların yüksek verimlilik inokülasyon için kullanılan modifiye bir iğne ve pipet. Bir iğne alt imzalandı ve deliklerin üç set bir lazer ışını kullanarak iğne sondaj gerçekleştirmiştir. Daha sonra, değiştirilen bir iğnenin bir 5 ml pipet ucu yapıştırılmış edildi. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> Şekil 4. Kök-ur nematodları ile enfekte bir domates kök sistemi. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> Şekil 5. 30 gün sonrası aşılama büyüdü erioglaucine ile boyanmış yumurta kitlesi olan bir börülce kök sistemi28 ° C.

<ol>
	<li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway.">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li><li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea.">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li><li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.,+including+a+new+technique.">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li><li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid.">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li><li>Matkin, O. A., Chandler, P. A., Baker, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U.C.-type+soil+mixes.+In:+The+U.C.+system+for+producing+healthy+container-grown+plants.">The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. 23, 68-85 (1957).</li><li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature.">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li><li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita.">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li><li>Perry, R. N., Moens, M., Starr, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root-Knot Nematodes. , (2009).</li><li>Starr, J. L., Cook, R., Bridge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Resistance to Parasitic Nematodes. , (2002).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Oldukça enfektif inokulum ve uygun gelişim aşamasında bitkileri kullanarak hazırlanması: Başarılı bir nematod ekran için iki önemli adım vardır. Kök-ur nematodu yumurta açılma oranı 5 arasında oldukça değişken ve aralıkları - 50%. Bu nedenle kapak ve yüksek infektif J2S optimum seviyeleri elde etmek için, yakın ilgi ve kuluçkalık yumurta çıkarma işlemlerine ödenmelidir. Yumurta en az bir süre için ağartıcı maruz edilmeli ve ağartıcı kök karışımından de yıkanır edilmelidir. Kuluçka sırasında yumurta, yumurta içeren bulamaç suya edilmemelidir. Buna ek olarak, yumurtadan yavru toplanır yatan Petri tabağı içine dökülüp yumurta önlemek. Kuluçka işlemi sırasında yumurta dökülmesini önlemek için bir yolu kağıt bozabilecek olarak Kimwipe doğrudan su eklemek değildir. Bunun yerine Petri kabı doğrudan su ekleyin. En iyi sonuç için, taze yumurtadan J2S kullanın. Eğer hatch oranı düşüktür ve daha inokulum gerektirir, J2S uzun bir süre için 15 ° C&#39;de saklanabilir. Aşılama öncesi nematodların canlandırmak için oda sıcaklığında saklanan inokulum ısıtın. Ancak, hatta 15 yaşında uzun süre J2S saklamiyoruz ° C hasret J2S verimli enfekte olmayacak gibi. Genç fidanlar kök-ur nematodu aşılama için en iyi gelişim aşaması vardır. Ancak, bu J2S için giriş noktaları olarak kök uçları yeterli sayıda sağlayan yeterli bir kök sistemi oluşumu ile dengeli olmalıdır. Optimal bitki gelişimi durumu korunması da ekranlar için önemlidir. Özel poşetler içinde büyüyen bu aşırı sulanma bitkilerin kaçının. Torbalar Aşırı sulama, mantar gibi büyüme teşvik ve kök sağlık azaltabilir, kese dibinde su birikintileri ile gösterilir. Testler daha nematod enfeksiyonunun değerlendirilmesi ve yumurta / kök sistemi ve yumurta sayısının hesaplanmasında her ikisi ile / gram freSH kök gerçekleştirilebilir. Domates testlerde, bireysel kökler tartılır ve çıkarılan yumurta gibi inokulum hazırlanması (bölüm 3) nitelendirdi. Bitki örneklerinin çok sayıda işlerken, bireysel kök sistemleri yumurta çıkarılması için bir blender kullanılarak yumuşatılır olabilir. Yumurta sayısı en azından üç alikots içinde sayılır ve taze kök sistemi yumurta / gram hesaplanan edilmelidir. Kese testlerde, kök sistemi, kağıt ekleme çıkardı tartılır ve yumurta elde edilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Compound </td>
			<td>Concentration </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2 &bull; 4 H2O</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamp-ene Fe EDTA 13.0%</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>46 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 &bull; 4H2O</td>
			<td>9 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>0.00076 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &bull; 5H2O</td>
			<td>0.00032 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24 &bull; 4H2O</td>
			<td>0.00016 &mu;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Reagents for Hoagland's solution.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent </td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalogue number </td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erioglaucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC22973-0250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro for tomato</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>18-18-21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmocote</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedling growth pouches</td>
			<td>Mega International</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 25 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3886</td>
			<td>US standard #500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 90 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3880</td>
			<td>US standard #170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 425 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3871</td>
			<td>US standard #40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine mix</td>
			<td>Sun Gro Horticulture Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 2. Table of specific reagents and equipment.

high and low throughput screens with root-knot nematodes meloidogyne spp.

Kök-ur nematodları (cinsi Meloidogyne) zorunlu bitki parazitlerdir. Bunlar son derece Polifag ve ekonomik açıdan en önemli bitki paraziti nematod biri kabul edilir. Yumurta bir kez tüy dökerler mikroskopik ikinci etap juvenil (J2), enfektif aşamasıdır. J2S, yumurtaları kırmayı bir su filmi içinde toprakta serbestçe hareket ve uygun bitki türlerinin kök uçları bulun. Bir yemleme sitesi kurmak ve onların stileleri kullanarak beslenmesi başlatırsak bitki kök nüfuz sonra, vasküler silindir doğru göç ederler. Çok hücreli besleme sitesi sitokinez olmadan karyokinesis (mitoz tekrarlanır) yapılan hücrelerden oluşur &#39;dev hücreler&#39; olarak adlandırılan birkaç genişlemiş multinükleer hücreler oluşur. Komşu pericycle hücreleri bölmek ve büyüklüğü tipik bir safra veya kök düğüm, kök-ur nematod enfeksiyonunun karakteristik belirti yol vererek büyütmek. Sonra beslenme başlanır, J2S sedanter ve un halineyetişkin olmak için üç ek molts dergo. Yetişkin kadın kök yüzeyi üzerinde veya altında jelatinimsi bir matris içinde 150-250 yumurta bırakır. Yumurtadan yeni enfektif J2S yumurtadan çıkar ve yeni bir döngü başlayacak. Kök-ur nematodu ömrü 26-28 az 4-6 hafta içinde tamamlanır ° C Burada kök-ur nematodları ve yüksek işlem deneyleri için iki yöntem ile saksıda yetiştirilen bitkiler, bulaştırmak için geleneksel protokolü sunarız. İkinci tür börülce ve fasulye gibi büyük tohum bitkilerinden için ise ilk yüksek verimli yöntem, domates gibi küçük tohumları ile bitkiler için kullanılır. Büyük tohum az besin takviyesi ile genişletilmiş fide büyümeyi desteklemektedir. İlk yüksek çıktı assay ikinci bir test bitkilerin toprağın yokluğunda torbalar içinde yetiştirilen ederken tepsilerde kum yetiştirilen fideler kullanmaktadır. Fide kılıf çekirdek veya fidelerinin yerleştirildiği bir 2-cm-derin çukur oluşturmak için üst kısmında katlandığında, bir 15.5 x 12.5cm kağıt fitil yapılmıştır.kağıt fitil şeffaf plastik poşet içinde bulunan. Bunlar büyüme poşetler şeffaf bir torba yüzeyinin altında, kök ve yumurta seri üretim incitici nematod enfeksiyonu semptomları, doğrudan gözlem sağlar. Her iki yöntem de üretim geçme ya tohumu, fenotipleme sonra, elenmiş bitkilerin kullanımına izin verir. Poşet rafları düzenlenen plastik asılı klasörlerde saklanır çünkü büyüme torbaların kullanımının bir avantajı küçük bir yer gereksinimi olduğunu.

Watch this Scientific Journal Video about High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp. at JoVE.com

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Kök-ur nematodları ile ekran bitkiler için iki farklı yöntem tarif edilmiştir. Açıklanan yaklaşımlar ıslah programlarında bu bitkilerin kullanımı kolaylaştıran bir zarar vermeden nematodlar ile yüksek verimlilik ekranlar yer alıyor.

Kök-ur Nematod ile Yüksek ve Düşük Throughput Ekranlar Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

27.8K Görüntüleme.  University of California, Riverside. Kök-ur nematodları ile ekran bitkiler için iki farklı yöntem tarif edilmiştir. Açıklanan yaklaşımlar ıslah programlarında bu bitkilerin kullanımı kolaylaştıran bir zarar vermeden nematodlar ile yüksek verimlilik ekranlar yer alıyor.

Video: High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...