Apoiado pela NSF concessão 0920060, NIH concessão DC004395, NHMRC concessão 1009482, NSW Escritório de Ciência e Pesquisa Médica, eo Passe Garnett e Rodney Williams Memorial Foundation.

1. Encosto de cabeça Visão <ol><li> Para montar um custom-built cabeça pós-, insira um 1/16 &quot;em aço inoxidável rolo pin-perpendicularmente em um buraco perfurado em 3/32&quot; haste de aço inoxidável para formar uma cruz. A peça vertical da cabeça pós-deve ser cerca de 20 mm ea peça transversal horizontal de cerca de 15 mm. Toque uma extremidade da haste vertical para aceitar um parafuso # 1-72. (Fig. 1). </li><li> Durante a cirurgia e gravação, a cabeça de pós-está protegido num latão construído sob encomenda ou barra de alumínio de montagem com um 1-72 # parafuso (Fig. 2). A peça longo da barra de montagem deve ser cerca de 90 mm de comprimento e 5-10 mm de largura. A cabeça de pós-se encaixa num sulco cortado em uma extensão 15 milímetros para fora da barra de comprimento que é um ângulo de 45 graus. Para impedir a rotação da cabeça, a peça transversal dos aninha cabeça pós-em uma pequena ranhura na parte inferior da barra de montagem. </li><li> A barra de montagem em seguida, ligado a um bloco de alumínio custom-made de montagemk (Fig. 3). O bloco de montagem é de aproximadamente 30 mm x 30 mm x 25 mm. Este bloco de montagem é acoplado a um micromanipulador de modo que a posição da cabeça de pós-pode ser colocado com precisão ao longo da linha média e em bregma. O bloco de montagem é feita de duas peças montadas em conjunto com parafusos. Um recorte no bloco permite que a barra de montagem para deslizar para dentro e ser fixada com os parafusos. A barra de montagem é paralela à superfície da mesa. Durante a gravação, fixar a barra em um quadro estereotáxico personalizado (Fig. 4). O stereotax é concebido para montar a barra na mesma posição como no bloco de montagem durante a cirurgia. Este arranjo assegura que o rato será sempre alinhado com o quadro estereotáxico em sessões experimentais. </li><li> Cortar uma haste de tungsténio (diâmetro 0,010 &quot;) a aproximadamente 5 mm de comprimento, com cerca de 1 milímetro dobrada a 45 °. Esta haste serve como o pino de terra (Fig. 1). </li></ol> 2. Estereotáxica Alignment para Craniotomia Nota: Todos os procedimentos descritos a seguir seguem padrão de assepsia e técnicas cirúrgicas têm sido aprovado pelo Animal Care Washington State University e da Comissão de Uso e o Animal Comitê de Ética do Instituto Garvan. <ol><li> Anestesiar o rato através da colocação de uma câmara de indução com 5% de isoflurano. A falta de uma reacção à cauda e / ou pitada toe assegura que o animal é totalmente anestesiado. </li><li> Posicione o mouse em um quadro estereotáxico roedor equipado com um adaptador de mouse (Stoelting). Para orientar o mouse corretamente, colocar os dentes dentro do buraco da barra de mordida e apertar a braçadeira nariz por isso é confortável. Posicione o mouse o mais reto possível na barra de mordida e pinça o nariz. Colocar uma máscara facial feita a partir de um pedaço de luvas de látex sobre o nariz do rato, e manter o isoflurano em 5% até que a taxa do rato respiração é de aproximadamente 1 respiração / seg. Gire o isoflurano a 1,5 - 2,0%. Proteja a cabeça com tele auriculares bares tomando cuidado para não perfurar o tímpano. Barras deve ser confortável, mas não penetrar muito profundamente nos canais auditivos. </li><li> Coloque uma almofada de aquecimento debaixo do mouse. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para evitar que os olhos sequem. </li><li> Raspar o couro cabeludo de entre as orelhas até os olhos com um barbeador pequeno ou fino de ponto tesoura. </li><li> Limpar e esterilizar o couro cabeludo limpando-o com cloro-hexidine (ou betadine) matagal, seguido pelo álcool lavagem repetido 3 vezes. </li><li> Para remover a pele sobre o topo do crânio fazer uma incisão ao longo da linha média da parte de trás da cabeça para os olhos. </li><li> Raspar o periósteo para as bordas da incisão com um bisturi. Se necessário (dependendo alvo experimental), cuidadosamente retrair a musculatura na parte de trás do pescoço com uma pinça, permitindo que o músculo para rasgar ao longo fascículos para minimizar a hemorragia. Aplicar Gelfoam debaixo tecido do couro cabeludo para minimizar a humidade e impedir que a pele que se move sobre o crânio. </li><li> Seca-se a superfície do crânio com um aplicador com ponta de algodão humedecido com álcool isopropílico, para melhorar a visualização de pontos de referência do crânio. </li><li> Alinhe o crânio a norma estereotáxica coordenadas 13. Introduza uma sonda de ponta fina no porta-eletrodo e anexá-lo ao micromanipulador estereotáxica. Uma haste de metal afiada funciona bem para esta finalidade (Fig. 5). </li><li> Usar o ponto de identificar Bregma (Fig. 5A) e Lambda (Fig. 5B) no crânio. Mover a sonda vai-e-vem entre esses pontos, verificando que a coordenada lateral-medial para cada local é diferente por não mais que 50 um. Reposicionar a cabeça, conforme necessário, cuidadosamente soltando os orelha-bares, deslocando a cabeça e orelha-bares lateralmente, e reapertar os orelha-bares. </li><li> Verificar que a altura dorsal-ventral em cada local difere por não mais do que 50 uM. Ajustar a altura do nariz de fixação, que vai rodar o crânio em torno do eixo dos orelha-bares,para nivelar a altura do crânio, se necessário. A altura da orelha-bar também pode necessitar de ser ajustada. </li><li> Use um atlas 13 para identificar as coordenadas do alvo de interesse (Fig. 5C) em relação ao bregma. Marque o crânio acima da meta (por exemplo, um &quot;X&quot; ou usar tinta nanquim para dot quatro cantos de um quadrado) onde a craniotomia será feita (Fig. 5D). </li></ol> 3. Cabeça e pós-instalação do pino terra <ol><li> Use gel para limpar etch crânio. Use o aplicador para esfregar e espalhar gel etch sobre a superfície (10 seg). Lavar com água e secar completamente. Aplicar o primer para cimento dental para a superfície do crânio utilizando aplicador. Espalhe cola com aplicador novo. Curar o adesivo com um luz UV arma-(1 ciclo). </li><li> Escolha um local para o pino terra que é distal ao local de destino. Cuidadosamente, deu à luz um pequeno buraco no crânio, utilizando a ponta de um bisturi # 65 miniblade apenas larga o suficiente para a extremidade curta da p terrenopara entrar e repousar sobre as meninges. O pino de chão deve ser orientado de modo que é voltada para o lado de bregma e no futuro cabeça pós-(Fig. 6A). </li><li> Fixe a cabeça pós-à barra de montagem e bloquear e anexar ao micromanipulador. Ao mover o micromanipulador em três dimensões, posicionar a cabeça de pós-over Bregma, apenas a tocar o crânio (Fig. 6B). A base da cabeça pós-deve ficar plana sobre o crânio. </li><li> A utilização de sondas de dissecação, aplique uma pequena quantidade de cimento dental ao redor da cabeça e pós-pino terra (Fig. 6C). Pressione o cimento para baixo para assegurar um bom contato com o crânio. Nota: Não use cimento muito ou não vai endurecer uniformemente. Curar o cimento com uma luz UV-gun (3-4 ciclos de vários ângulos). </li><li> Aplicar a segunda fase de cimento e construir-se a base em torno da cabeça de pós-e cobrir as ranhuras da cabeça pós-(Fig. 6D). </li></ol> 4. Craniotomia <ol><li> Localizar a craniotomia marca de referência, que será parcialmente obscurecido pelo primer. Use um bisturi # 65 para marcar um milímetro quadrado 3 x 3 mm em torno deste local e aplicar uma gota de lidocaína para reduzir a sensibilidade e para minimizar a hemorragia. </li><li> Fazer pontuações múltiplas de cada lado do quadrado (tantos quanto 10), tendo cuidado para não cortar o osso e no cérebro (Fig. 7A). </li><li> Uma vez que a aba de osso fica solto, utilizar a ponta do bisturi para erguer-la para cima, deixando a dura-máter intacta (Fig. 7B). </li><li> Cubra com cera de osso. </li></ol> 5. Pós-operatório <ol><li> Desligue anestesia gás e retire o mouse a partir do quadro estereotáxico. </li><li> Use um aplicador com ponta de algodão para aplicar pomada de lidocaína em torno de pele exposta para amortecer a sensação em torno da ferida. Use outro aplicador com ponta de algodão para aplicar Neosporin para a pele exposta. Injectar cetoprofeno (5 IM mg / kg ou IP com base na preferência de individuais veterinários IACUC) comoum analgésico pós-operatório. Rato será geralmente levantam e se movimentam dentro dos minutos de interrupção de gás. </li><li> Local rato em uma gaiola quente e monitor até que ele está pronto para retornar ao alojamento dos animais. </li><li> O animal deve ser verificada em pelo menos uma vez por dia depois de ter recuperado de uma cirurgia. Preste atenção aos sinais de má alimentação e / ou beber e comportamento apático. Se a dor é suspeita, fornecer cetoprofeno a cada 24 horas (mesma dose que no final do pós-cirurgia) até aliviada. A lidocaína pode ser aplicado localmente sobre a ferida se o animal está se coçando ou mostra sinais de desconforto. Animais tipicamente recuperar de uma cirurgia sem complicações ou dor. </li></ol> 6. Injeção de gravação e Dye <ol><li> Aguarde pelo menos um dia depois de cabeça pós-cirurgia antes de usar o mouse para as gravações. </li><li> Coloque o rato em um dispositivo de contenção de espuma moldada ao corpo do mouse. O rato já foi adaptado a este dispositivo, reduzindo assim a sua ansiedade. Adaptação típica élidar com o mouse todos os dias após o desmame, por cerca de uma semana antes da cirurgia e experiências, coloque o mouse no dispositivo de espuma durante 1-5 minutos. Suspender dispositivo no quadro estereotáxico (Fig. 4). </li><li> Seguro cabeça pós-a barra de montagem, que agora é fixado à armação estereotáxico (Fig. 4). </li><li> Ligue para o pino de aterramento com um fio encerrado com um contundente ponta da agulha hipodérmica calibre 22. </li><li> Remover cera de osso sobre a craniotomia. Remover dura-máter, se necessário, usando a ponta de um bisturi miniblade. </li><li> Conduz eléctrodo para o local adequado estereotáxico e iniciar a gravação (Fig. 8). Por apenas gravações electrofisiológicos, uma variedade de eléctrodos podem ser usados. A escolha do eléctrodo é dependente da localização e do tipo de gravações requeridas. A escolha do eléctrodo para as gravações de rato desperto será o mesmo que o que um pesquisador utiliza em um rato anestesiado. Para combinados com gravações eletrofisiológicascorante / traçador injeções, um eletrodo de micropipeta é utilizada 10. A micropipeta é preenchido com o corante / traçador de escolha de modo que ele pode ser injectado iontoforéticamente no final das experiências electrofisiológicos. Eléctrodos Multibarrel também pode ser utilizado de modo a que as manipulações farmacológicas podem ser feitas. O eléctrodo multibarrel é montado de uma micropipeta de gravação única (Fig. 8). Estas técnicas são padrão na literatura e não são diferentes para as gravações anestesiados contra acordado. </li><li> As gravações podem ser feitas para 4-5 horas durante 3-4 dias consecutivos. </li><li> No final da sessão de gravação, o corante / traçador pode ser injectado. Como não existem receptores da dor no cérebro, a injecção iontoforético do corante ou traçador para o cérebro é pouco provável que cause desconforto. No entanto, uma vez que as propriedades electrofisiológicas de resposta da região onde a injecção é para ser feita são caracterizados, o animal pode ser anestesiados com isoflurano fou a injecção. Isso eliminaria todas as sensações possíveis indesejados. Porque o corante / traçador já está na micropipeta, os eléctrodos activos e moído pode ser ligada a partir da gravação electrofisiológico set-se ao gerador de corrente para injectar o corante iontoforéticamente / traçador. Use protocolo apropriado para a tintura / marcador no eletrodo. Retire o animal do contenção e moderação headpost corpo e voltar para sua gaiola. </li><li> No final da experiência, seguir o protocolo apropriado para a eutanásia e processamento de tecidos para recuperar local da injecção e rotulagem. </li></ol> 7. Os resultados representativos Instalação bem-sucedida da cabeça pós-permite que o experimentador para gravar as respostas individuais e multiunidade de um mouse, não anestesiados acordado durante vários dias. O sistema de retenção permite estáveis ​​gravações eletrofisiológicas de neurônios individuais no cérebro. Excelente isolamento de unidades individuais e respostas fortes testímulos O podem ser gravado a partir da estrutura do cérebro mesmo durante vários dias, por exemplo, no colículo inferior do rato (Fig. dia, 9A um; Figura 9B, dia dois). Com uma instalação pós-cabeça boa, cada rato será sempre alinhado com o aparelho estereotáxico eo mouse estereotáxica atlas, 13, resultando na localização de confiança de núcleos cerebrais particular. Esta localização permite fiável para injecção de corantes e traçadores em estruturas específicas após dias de gravação múltiplas. Por exemplo, para avaliar descendente projecções a partir do mesencéfalo auditivo para o tronco cerebral auditivo, biotinilado dextrano amina (diaminobenzidina usando visualizada como cromogénio) pode ser injectado no rato colículo inferior (Fig. 10A) após electrofisiologicamente identificar propriedades resposta neuronal no local da injecção (na fig. 10A, um neurónio foi gravado com uma melhor frequência de 51 kHz), e após o processamento de tecidos, umarotulagem nterograde no núcleo dorsal contralateral coclear pode sido visualizou e representado (Fig. 10B). As fotomicrografias com maior resolução pode também ser obtida para ler axónios anterogradamente rotulados e terminais (Fig. 10C). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig1.jpg" /> Figura 1. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig2.jpg" /> Figura 2. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig3.jpg" /> Figura 3. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig4.jpg" /> Figura 4. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig5.jpg" /> Figura 5. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig6.jpg" /> <strong&gt; Figura 6. <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig7.jpg" /> Figura 7. <img alt="A Figura 8" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig8.jpg" /> Figura 8. <img alt="A Figura 9" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig9.jpg" /> Figura 9. <img alt="A Figura 10" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig10.jpg" /> Figura 10.

<ol>
	<li>Evans, E. F., Nelson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+responses+of+single+neurones+in+the+cochlear+nucleus+of+the+cat+as+a+function+of+their+location+and+the+anaesthetic+state.">The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state.</a> Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+classes+in+the+dorsal+cochlear+nucleus+and+its+output+tract+in+the+chloralose-anesthetized+cat.">Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat.</a> J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).</li><li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+change+the+excitation/inhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus.">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).</li><li>Young, E. D., Brownell, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+tones+and+noise+of+single+cells+in+dorsal+cochlear+nucleus+of+unanesthetized+cats.">Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats.</a> J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).</li><li>Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+properties+of+neurons+in+two+parts+of+the+primary+motor+cortex+of+the+awake+rat.">Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat.</a> Brain Res. , 333-3173 (1985).</li><li>Westby, G. W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+floating+microwire+technique+for+multichannel+chronic+neural+recording+and+stimulation+in+the+awake+freely+moving+rat.">A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).</li><li>Suga, N., O'Neill, W. 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E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonic-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat.">Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 270-274 (1979).</li><li>Portfors, C. V., Felix, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2nd+Spectral+integration+in+the+inferior+colliculus+of+the+CBA/CaJ+mouse.">2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse.</a> Neuroscience. , 136-1159 (2005).</li><li>Felix, R. A., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory,+inhibitory+and+facilitatory+frequency+response+areas+in+the+inferior+colliculus+of+hearing+impaired+mice.">Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice.</a> Hear Res. 228, 212-229 (2007).</li><li>Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-representation+of+species-specific+vocalizations+in+the+awake+mouse+inferior+colliculus.">Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus.</a> Neuroscience. 162, 486-500 (2009).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2007).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

A vantagem do sistema de apoio de cabeça pós-para experimentos eletrofisiológicos e neuroanatômicas em rato é que os experimentos podem ser realizados com anestesiados, ratos acordados, eliminando a contaminação potencial de resposta devido à drogas anestésicas. Além disso, a configuração pode ser usada durante vários dias para permitir o uso de animais mais eficiente. A maioria dos componentes para a pós-cabeça estão disponíveis off-the-shelf. Apenas a cabeça pós-montagem...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Gel de Etch para a limpeza do crânio antes de cimento dental </td><td> Henry Schein </td><td> 101-5396 </td><td> 12/pk com 1,2 mL seringas </td></tr><tr><td> Primer para o cimento dental </td><td> Kerr Optibond </td><td> 25881 </td><td> 8 mL </td></tr><tr><td> Adesivo para cimento dental </td><td> Kerr Optibond </td><td> 25882 </td><td> 8 mL </td></tr><tr><td> Aplicadores para cimento dental </td><td> Kerr Optibond </td><td> 24680 </td><td> 200/pk </td></tr><tr><td> Cimento dentário </td><td> Carisma, Heraeus Kulzer </td><td> 66000085 </td><td> Refil Seringa 4GM </td></tr><tr><td> Rod Tungsténio (pino terra) </td><td> Sistemas de AM </td&gt; <td> 717200 </td><td> 0,010 &quot;de diâmetro </td></tr><tr><td> Economia de luz de cura UV </td><td> Henry Schein </td><td> CU-80 </td><td></td></tr><tr><td> Cabeça de pós- </td><td> Construído em casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Barra de montagem </td><td> Construído em casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bloco de montagem </td><td> Construído em casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 902 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse e adaptador de ratos neonatos </td><td> Stoelting </td><td> 51625 </td><td></td></tr><tr><td> Deltaphase Pad isotérmico </td><td> Braintree Scientific, Inc. </td><td> 39DP </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers

É bem conhecido que a anestesia altera as propriedades de resposta neurais em várias regiões do cérebro. 13. No sistema auditivo, as propriedades fundamentais de resposta de neurônios do tronco cerebral como a tolerância, a especificidade, freqüência e bandas laterais inibitórias são alteradas de forma significativa sob anestesia 1-2. Estas observações levaram os fisiologistas a buscar maneiras de gravar a partir de neurônios sem os efeitos contaminantes da anestesia. Um resultado foi uma preparação descerebrada, onde o tronco cerebral foi completamente seccionado ao nível do mesencéfalo 4. As desvantagens desta preparação é uma cirurgia formidável, a eliminação de descer projeções do cérebro anterior, e uma incapacidade de usar a estimulação sensorial para examinar as estruturas acima do mesencéfalo. Uma estratégia diferente foi a implantação de eletrodos cronicamente a gravar a partir de neurônios isolados e aglomerados multiunidade enquanto o animal está acordado e / ou comportar 5,6 </sup&gt;. Estas técnicas, contudo, não são compatíveis com injecção de corantes marcador após primeira electrofisiologicamente caracterizando uma estrutura do cérebro. Para evitar alterar as propriedades de resposta neural com anestésicos durante a gravação de propriedades eletrofisiológicas de resposta de neurônios individuais, nós adaptamos uma técnica de apoio de cabeça há muito usado em morcegos 7-9 ao mouse 10-12. Usando este método, somos capazes de realizar gravações eletrofisiológicas durante vários dias no rato não anestesiados. No final das sessões de gravação, então podemos injectar um corante para reconstruir as posições de eléctrodos e os locais de gravação ou de injectar um traçador de modo que as vias de e para os loci de gravação pode ser determinada. Este método permite assim isolado gravações único neurónio durante vários dias sem os anestésicos de uso.

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Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

Caracterização eletrofisiológica das respostas neuronais é importante para compreender o funcionamento do cérebro e para orientar a colocação de corantes para caminho traçado. No entanto, muitos estudos são realizados em animais anestesiados. Para entender o funcionamento do cérebro sem anestesia, foi desenvolvido um método para registrar propriedades resposta neuronal e injetar corantes no rato acordado.

Preparação de um mouse Awake para gravar as respostas neurais e injetando Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

preparation-an-awake-mouse-for-recording-neural-responses-injecting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.3K visualizações.  Johns Hopkins University. Caracterização eletrofisiológica das respostas neuronais é importante para compreender o funcionamento do cérebro e para orientar a colocação de corantes para caminho traçado. No entanto, muitos estudos são realizados em animais anestesiados. Para entender o funcionamento do cérebro sem anestesia, foi desenvolvido um método para registrar propriedades resposta neuronal e injetar corantes no rato acordado.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Neurociência

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

Neural Circuit gravação de um Sistema Nervoso Barata Intacta

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.

Fabricação de alta Contact densidade, eletrodos nervosas Plano de Interface para gravação e estimulação Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Construção de um Hyperdrive melhorado de multi Tetrode para gravação Neural em grande escala em comportar-se ratos

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Gravação ótica do único-fóton do largo-campo em fatias do cérebro usando a tintura tensão-sensível

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...