Soutenu par la NSF subvention 0920060, NIH DC004395, NHMRC subvention 1009482, NSW Bureau de la science et de la recherche médicale, et la Passe Garnett et Rodney Williams Memorial Foundation.

1. Vue d&#39;ensemble d&#39;appui-tête <ol><li> Pour assembler un custom-built tête-post, insérer un 1/16 &quot;en acier inoxydable rouleau broches perpendiculairement dans un trou percé dans un 3/32&quot; tige en acier inoxydable pour former une croix. La pièce verticale de la tête-poste doit être d&#39;environ 20 mm et la pièce transversale horizontale d&#39;environ 15 mm. Appuyez sur une extrémité de la tige verticale à accepter une vis n ° 1-72. (Fig. 1). </li><li> Au cours de la chirurgie et l&#39;enregistrement, la tête-poste est fixée dans un laiton sur-mesure ou la barre de montage en aluminium avec un 1-72 # vis (Fig. 2). Le long morceau de la barre de montage devrait être d&#39;environ 90 mm de long et 5-10 mm de large. Le chef-poste s&#39;inscrit dans une rainure dans une extension de 15 mm au large de la longue barre qui est incliné à 45 degrés. Pour empêcher la rotation de tête, la traverse des niché tête de la poste dans une petite rainure sur le bas de la barre de montage. </li><li> La barre de montage en ensuite attaché à un bloc en aluminium sur mesure de montagek (fig. 3). Le bloc de montage est d&#39;environ 30 mm x 30 mm x 25 mm. Ce bloc de montage est fixé à un micromanipulateur afin que la position de la tête-poste ne peut être correctement placé le long de la ligne médiane et à Bregma. Le bloc de montage est fait de deux pièces emboîtées avec des vis. Un coupe-circuit dans le bloc permet à la barre de montage de glisser à l&#39;intérieur et être fixé avec les vis. La barre de montage est parallèle à la surface de la table. Pendant l&#39;enregistrement, fixer la barre dans un cadre personnalisé stéréotaxique (fig. 4). Le stereotax est conçu pour monter la barre dans la même position que dans le bloc de montage pendant la chirurgie. Cette disposition assure que la souris sera toujours aligné sur le cadre stéréotaxique à travers des sessions expérimentales. </li><li> Couper une tige de tungstène (diamètre 0,010 &quot;) à environ 5 mm de longueur, avec environ 1 mm coudé à 45 °. Ce tige sert de broche de terre (fig. 1). </li></ol> 2. Stéréotaxique Alignment pour craniotomie Remarque: Toutes les procédures décrites ci-dessous suivent standards techniques chirurgicales aseptiques et ont été approuvés par le soin des animaux l&#39;État de Washington University et le Comité d&#39;utilisation et l&#39;animal Comité d&#39;éthique de l&#39;Institut Garvan. <ol><li> Anesthésier la souris en plaçant dans une chambre d&#39;induction avec 5% d&#39;isoflurane. L&#39;absence d&#39;une réaction à la queue et / ou pincement de l&#39;orteil en sorte que l&#39;animal est entièrement anesthésié. </li><li> Placez la souris dans un cadre stéréotaxique rongeurs équipé d&#39;un adaptateur pour souris (Stoelting). Pour orienter la souris correctement, placer les dents à l&#39;intérieur du trou de la barre de morsure et serrer la pince le nez de sorte qu&#39;il soit bien ajusté. Placez la souris aussi droite que possible dans la barre de morsure et pince nez. Placez un masque fait à partir d&#39;un morceau de gants en latex sur le nez de la souris, et de garder l&#39;isoflurane à 5% jusqu&#39;à ce que le taux de respiration de la souris est d&#39;environ 1 respiration / sec. Tourner l&#39;isoflurane à 1,5 - 2,0%. Fixer la tête en utilisant til l&#39;oreille-bars en faisant attention à ne pas percer le tympan. Bars devrait être tendu mais pas pénétrer trop profondément dans les conduits auditifs. </li><li> Placez un coussin chauffant sous la souris. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique pour éviter que les yeux de se dessécher. </li><li> Rasage du cuir chevelu d&#39;entre les oreilles jusqu&#39;à les yeux avec un rasoir petite ou d&#39;une amende de point ciseaux. </li><li> Nettoyer et stériliser le cuir chevelu en les essuyant avec du chlore et de hexidine (ou bétadine) gommage suivi par l&#39;alcool rinçage répété 3 fois. </li><li> Pour enlever la peau sur le dessus du crâne faire une incision le long de la ligne médiane de l&#39;arrière de la tête aux yeux. </li><li> Grattez le périoste sur les bords de l&#39;incision avec un scalpel. Si nécessaire (en fonction de la cible expérimentale), soigneusement retirer la musculature à l&#39;arrière du cou avec une pince, permettant au muscle de se déchirer le long de fascicules à minimiser les saignements. Appliquer gelfoam dessous du tissu pour réduire au minimum le cuir chevelu d&#39;humidité et d&#39;empêcher la peau de se déplacer sur le crâne. </li><li> Sécher la surface du crâne avec un coton-tige imbibé d&#39;alcool isopropylique pour améliorer la visualisation des points de repère du crâne. </li><li> Aligner le crâne à la norme stéréotaxique coordonnées 13. Insérez une sonde à pointe fine dans le porte-électrode et l&#39;attacher à la micromanipulateur stéréotaxique. Une tige de métal aiguisé fonctionne bien à cet effet (Fig. 5). </li><li> Utilisez le point d&#39;identifier Bregma (Fig. 5A) et Lambda (Fig. 5B) sur le crâne. Déplacez la sonde va-et-vient entre ces deux points, en vérifiant que la coordonnée latérale-médiale pour chaque emplacement ne diffère pas de plus de 50 um. Repositionner la tête, au besoin en prenant soin de desserrer les boucles d&#39;oreilles bars, déplacement de la tête et des oreilles-bars latéralement, et en resserrant les oreilles-bars. </li><li> Vérifiez que la hauteur dorso-ventral à chaque emplacement ne diffère pas de plus de 50 um. Réglez la hauteur du nez-clamp, qui fera tourner le crâne autour de l&#39;axe des oreilles-bars,pour niveler la hauteur du crâne, si nécessaire. La hauteur de l&#39;oreille-bar peut aussi être nécessaire d&#39;ajuster. </li><li> Utilisez un atlas de 13 à identifier les coordonnées de la cible d&#39;intérêt (Fig. 5C) par rapport à Bregma. Marquez le crâne au-dessus de la cible (par exemple, un «X» ou d&#39;utiliser l&#39;encre de Chine pour dot quatre coins d&#39;un carré), où une craniotomie sera faite (Fig. 5D). </li></ol> 3. Chef-poste et d&#39;installation Broche de terre <ol><li> Utilisez gel de mordançage pour nettoyer le crâne. Utilisez l&#39;applicateur de frotter et de diffuser gel de mordançage sur la surface (10 sec). Laver à l&#39;eau et sécher complètement. Appliquer l&#39;apprêt de ciment dentaire à la surface du crâne à l&#39;aide de l&#39;applicateur. Fais adhésif avec nouvel applicateur. Cure de l&#39;adhésif avec une lumière UV-gun (1 cycle). </li><li> Choisir un emplacement pour la broche de terre qui est distale du site cible. Soigneusement portait un petit trou dans le crâne avec la pointe d&#39;un scalpel n ° 65 miniblade juste assez large pour l&#39;extrémité courte de la p-chausséepour entrer et se reposer sur les méninges. La broche de terre doit être orienté de sorte qu&#39;il est dirigée vers l&#39;extérieur à partir Bregma et le futur tête-après (Fig. 6A). </li><li> Fixer la tête-poste à la barre de montage et de bloquer et de joindre à la micromanipulateur. En déplaçant le micromanipulateur en trois dimensions, la position de la tête-post sur ​​Bregma, touchant tout juste le crâne (figure 6B). La base de la tête-post doit reposer à plat sur ​​le crâne. </li><li> En utilisant des sondes de dissection, appliquez une petite quantité de ciment dentaire autour de la tête-poste et la broche de terre (Fig. 6C). Appuyez sur le ciment vers le bas pour assurer un bon contact avec le crâne. Remarque: Ne pas utiliser de ciment trop ou il ne sera pas durcira de façon égale. Cure du ciment avec une lumière UV-gun (3-4 cycles à partir d&#39;angles multiples). </li><li> Appliquer la deuxième étape de ciment et construire la base autour de la tête-après et couvrent les rainures de la tête-après (Fig. 6D). </li></ol> 4. Craniotomie <ol><li> Localisez la craniotomie marque de référence, qui sera partiellement masqué par l&#39;amorce. Utiliser un scalpel # 65 pour marquer un carré de 3 mm x 3 mm autour de ce site et appliquez une goutte de la lidocaïne pour réduire la sensibilité et de minimiser les saignements. </li><li> Assurez-scores multiples de chaque côté de la place (jusqu&#39;à 10), en faisant attention de ne pas couper à travers l&#39;os et dans le cerveau (Fig. 7A). </li><li> Une fois le volet osseux devient lâche, utilisez la pointe du scalpel pour le soulever, laissant intacte la dure-mère (figure 7B). </li><li> Couvrir avec de la cire d&#39;os. </li></ol> 5. Post-chirurgie <ol><li> Éteignez l&#39;anesthésie au gaz et enlever la souris à partir du cadre stéréotaxique. </li><li> Utilisez un coton-tige à appliquer la pommade de lidocaïne autour peau exposée pour amortir la sensation autour de la plaie. Utilisez un autre coton-tige à appliquer Neosporin à la peau exposée. Injecter le kétoprofène (5 mg / kg IM ou IP en fonction des préférences individuelles des vétérinaires du IACUC) queun analgésique post-opératoire. Souris sera généralement lever et se déplacer à quelques minutes de l&#39;arrêt de gaz. </li><li> Placer la souris dans une cage au chaud et le moniteur jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit prêt à retourner au logement des animaux. </li><li> L&#39;animal doit être vérifié au moins une fois par jour après qu&#39;il a récupéré d&#39;une intervention chirurgicale. Surveillez les signes de la mauvaise alimentation et / ou d&#39;eau potable et le comportement apathique. Si la douleur est suspectée, de fournir kétoprofène toutes les 24 heures (même dose que à la fin de post-chirurgie) jusqu&#39;à ce que soulagés. La lidocaïne peut être appliqué localement sur la plaie, si l&#39;animal se gratte ou montre des signes d&#39;inconfort. Animaux généralement récupérer de la chirurgie sans complications ou de la douleur. </li></ol> 6. Injection d&#39;enregistrement et de Dye <ol><li> Attendez au moins un jour après la tête après chirurgie avant d&#39;utiliser la souris pour les enregistrements. </li><li> Placez la souris sur un dispositif de retenue de la mousse moulée sur le corps de la souris. La souris a déjà été adapté à cet appareil, réduisant ainsi son inquiétude. L&#39;adaptation est typiquepour manipuler la souris tous les jours après le sevrage et pendant environ une semaine avant la chirurgie et des expériences, placez la souris dans le dispositif de la mousse pendant 1-5 minutes. Suspendre dans le dispositif de cadre stéréotaxique (fig. 4). </li><li> Sécurisé tête-poste à la barre de montage, qui est maintenant fixée au cadre stéréotaxique (fig. 4). </li><li> Connectez-vous à la broche de terre avec un fil terminé par un objet contondant de calibre 22 pointe de l&#39;aiguille hypodermique. </li><li> Retirer la cire d&#39;os au cours de la craniotomie. Retirez-mère, si nécessaire en utilisant la pointe d&#39;un scalpel miniblade. </li><li> Entraînement électrode à l&#39;emplacement approprié stéréotaxique et commencer l&#39;enregistrement (Fig. 8). Pour seulement les enregistrements électrophysiologiques, une variété d&#39;électrodes peuvent être utilisées. Le choix d&#39;électrode est dépendante de l&#39;emplacement et le type d&#39;enregistrements requis. Le choix de l&#39;électrode pour les enregistrements de la souris se réveillent sera la même chose que ce qu&#39;un chercheur utilise dans une souris anesthésiée. Pour combinées avec des enregistrements électrophysiologiquescolorant / traceur injections, une électrode micropipette est utilisé à 10. La micropipette est rempli avec le colorant / traceur de choix de façon à pouvoir être injecté par iontophorèse à la fin de expériences électrophysiologiques. Électrodes Multibarrel peut également être utilisé afin que les manipulations pharmacologiques peuvent être faites. L&#39;électrode multibarrel est monté sur une micropipette d&#39;enregistrement unique (fig. 8). Ces techniques sont standard dans la littérature et ne sont pas différentes pour les enregistrements anesthésiés par rapport éveillé. </li><li> Les enregistrements peuvent être réalisés pendant 4-5 heures sur 3-4 jours consécutifs. </li><li> À la fin de la session d&#39;enregistrement, le colorant / traceur peut être injecté. Parce qu&#39;il n&#39;ya pas de récepteurs de douleur dans le cerveau, l&#39;injection iontophorétique de la teinture ou le traceur dans le cerveau est susceptible de provoquer l&#39;inconfort. Cependant, une fois les propriétés de réponse électrophysiologique de la région où l&#39;injection doit être faite sont caractérisés, l&#39;animal pourrait être anesthésiés avec l&#39;isoflurane fou l&#39;injection. Cela permettrait d&#39;éliminer toutes les sensations possibles indésirables. Parce que le colorant / traceur est déjà dans la micropipette, les fils actifs et la terre peut être commuté de l&#39;enregistrement électrophysiologique set-up pour le générateur de courant à injecter du colorant iontophorèse / traceur. Utiliser le protocole approprié pour la teinture / traceur dans l&#39;électrode. Retirer l&#39;animal de la contrainte et à la retenue headpost corps et revenir à sa cage. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, suivre le protocole approprié pour l&#39;euthanasie et le traitement des tissus pour récupérer au site d&#39;injection et de l&#39;étiquetage. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs Une installation réussie de la tête-post permet à l&#39;expérimentateur pour enregistrer les réponses simples et plusieurs unités d&#39;un non anesthésié, la souris éveillée sur plusieurs jours. Le système de retenue permet à la stabilité des enregistrements électrophysiologiques de neurones isolés dans le cerveau. Excellente isolation des unités uniques et des réponses fortes tstimuli o peuvent être enregistrées à partir de la structure du cerveau même sur plusieurs jours, par exemple dans la souris colliculus inférieur (fig. 9A, le premier jour; figure 9B, deux jours). Avec une bonne tête après l&#39;installation, chaque souris sera toujours alignée sur l&#39;appareil de stéréotaxie et la souris stéréotaxique atlas, 13 résultant de la localisation fiable de noyaux du cerveau en particulier. Cette localisation permet fiables pour l&#39;injection de colorants et des traceurs dans les structures spécifiques après des jours d&#39;enregistrement multiples. Par exemple, pour évaluer en ordre descendant saillies du mésencéphale auditive à l&#39;tronc cérébral, biotinylé dextrane aminé (visualisée en utilisant comme chromogène diaminobenzidine) peut être injecté dans la souris colliculus inférieur (fig. 10A) après l&#39;identification des propriétés électrophysiologiques de réponse neuronales au niveau du site d&#39;injection (dans la Fig. 10A, un neurone a été enregistrée avec une meilleure fréquence de 51 kHz), et après le traitement des tissus, uneétiquetage nterograde dans le noyau cochléaire controlatéral dorsale peut être visualisé et tracée (Fig. 10B). Photomicrographies à plus haute résolution peut également être obtenu pour afficher les axones marqués antérograde et des bornes (Fig. 10C). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig1.jpg" /> Figure 1. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig2.jpg" /> Figure 2. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig3.jpg" /> Figure 3. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig4.jpg" /> Figure 4. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig5.jpg" /> Figure 5. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig6.jpg" /> <strong&gt; Figure 6. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig7.jpg" /> Figure 7. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig8.jpg" /> Figure 8. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig9.jpg" /> Figure 9. <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig10.jpg" /> Figure 10.

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	<li>Evans, E. F., Nelson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+responses+of+single+neurones+in+the+cochlear+nucleus+of+the+cat+as+a+function+of+their+location+and+the+anaesthetic+state.">The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state.</a> Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+classes+in+the+dorsal+cochlear+nucleus+and+its+output+tract+in+the+chloralose-anesthetized+cat.">Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat.</a> J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).</li><li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+change+the+excitation/inhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus.">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).</li><li>Young, E. D., Brownell, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+tones+and+noise+of+single+cells+in+dorsal+cochlear+nucleus+of+unanesthetized+cats.">Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats.</a> J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).</li><li>Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+properties+of+neurons+in+two+parts+of+the+primary+motor+cortex+of+the+awake+rat.">Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat.</a> Brain Res. , 333-3173 (1985).</li><li>Westby, G. W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+floating+microwire+technique+for+multichannel+chronic+neural+recording+and+stimulation+in+the+awake+freely+moving+rat.">A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).</li><li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+sensitive+to+combinations+of+information-bearing+elements+of+biosonar+signals+in+the+mustache+bat.">Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat.</a> Science. 200, 778-781 (1978).</li><li>O'Neill, W. E., Suga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+range-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat.">Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 69-73 (1979).</li><li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonic-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat.">Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 270-274 (1979).</li><li>Portfors, C. V., Felix, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2nd+Spectral+integration+in+the+inferior+colliculus+of+the+CBA/CaJ+mouse.">2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse.</a> Neuroscience. , 136-1159 (2005).</li><li>Felix, R. A., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory,+inhibitory+and+facilitatory+frequency+response+areas+in+the+inferior+colliculus+of+hearing+impaired+mice.">Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice.</a> Hear Res. 228, 212-229 (2007).</li><li>Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-representation+of+species-specific+vocalizations+in+the+awake+mouse+inferior+colliculus.">Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus.</a> Neuroscience. 162, 486-500 (2009).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2007).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

L&#39;avantage du système appuie-tête-poste pour des expériences électrophysiologiques et neuroanatomiques chez la souris, c&#39;est que les expériences peuvent être réalisées avec non anesthésiés, les souris éveillées, élimination de la contamination potentielle due à la réponse des médicaments anesthésiques. En outre, la mise en place peut être utilisé sur plusieurs jours pour permettre une utilisation plus efficace des animaux. La plupart des composants pour la tête-ap...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Gel de mordançage pour le nettoyage du crâne avant de ciment dentaire </td><td> Henry Schein </td><td> 101-5396 </td><td> 12/pk avec des seringues 1,2 ml </td></tr><tr><td> Guide à l&#39;intention du ciment dentaire </td><td> Kerr OptiBond </td><td> 25881 </td><td> 8 bouteilles ml </td></tr><tr><td> Colle pour ciment dentaire </td><td> Kerr OptiBond </td><td> 25882 </td><td> 8 bouteilles ml </td></tr><tr><td> Applicateurs de ciment dentaire </td><td> Kerr OptiBond </td><td> 24680 </td><td> 200/pk </td></tr><tr><td> Ciment dentaire </td><td> Charisme, Heraeus Kulzer </td><td> 66000085 </td><td> Recharge Seringue 4gm </td></tr><tr><td> Rod tungstène (Broche de terre) </td><td> Systèmes AM </td&gt; <td> 717200 </td><td> 0,010 &quot;de diamètre </td></tr><tr><td> Lampe de polymérisation UV Economie </td><td> Henry Schein </td><td> CU-80 </td><td></td></tr><tr><td> Chef-post </td><td> Construit en interne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Barre de montage </td><td> Construit en interne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bloc de montage </td><td> Construit en interne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cadre stéréotaxique </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 902 </td><td></td></tr><tr><td> Souris et l&#39;adaptateur rat nouveau-né </td><td> Stoelting </td><td> 51625 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaPhase Pad isotherme </td><td> Braintree Scientific, Inc </td><td> 39DP </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers

Il est bien connu que l&#39;anesthésie modifie les propriétés de réponse de neurones dans différentes régions du cerveau. 13. Dans le système auditif, les propriétés fondamentales de la réponse neurones du tronc cérébral, y compris seuil, la spécificité de fréquence, et des bandes latérales inhibitrices sont modifiées de façon significative sous anesthésie 1-2. Ces observations invité physiologistes à chercher des moyens d&#39;enregistrer à partir de neurones isolés, sans les effets contaminants de l&#39;anesthésie. Un résultat a été une préparation décérébrée, où le tronc cérébral a été complètement sectionné au niveau du mésencéphale 4. Les inconvénients de cette préparation sont une chirurgie redoutable, l&#39;élimination de descendre les projections de l&#39;prosencéphale, et une incapacité à utiliser la stimulation sensorielle d&#39;examiner les structures au-dessus du mésencéphale. Une stratégie différente a été d&#39;implanter des réseaux d&#39;électrodes de façon chronique à enregistrer à partir de neurones isolés et des grappes plusieurs unités alors que l&#39;animal est éveillé et / ou de se comporter 5,6 </sup&gt;. Ces techniques ne sont cependant pas compatible avec l&#39;injection de traceurs colorants après la première électrophysiologiquement caractériser une structure du cerveau. Pour éviter toute altération des propriétés de réponse de neurones avec des anesthésiques lors de l&#39;enregistrement des propriétés de réponse électrophysiologique de neurones isolés, nous avons adapté une technique utilisée depuis longtemps appuie-tête des chauves-souris à la souris 7-9 10-12. En utilisant cette méthode, nous sommes en mesure de procéder à des enregistrements électrophysiologiques sur plusieurs jours chez la souris non anesthésié. A la fin des sessions d&#39;enregistrement, on peut alors injecter un colorant à reconstruire les positions d&#39;électrodes et des sites d&#39;enregistrement ou d&#39;injecter un traceur afin que les voies vers et à partir des loci d&#39;enregistrement peut être déterminée. Cette méthode permet de bien isolées enregistrements d&#39;un seul neurone sur plusieurs jours sans que les anesthésiques utilisation.

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Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

La caractérisation électrophysiologique des réponses neuronales est important pour comprendre le fonctionnement du cerveau et pour guider la mise en place de colorants pour voie de traçage. Cependant, de nombreuses études sont réalisées chez des animaux anesthésiés. Pour comprendre le fonctionnement du cerveau sans anesthésie, nous avons développé une méthode pour enregistrer les propriétés de réponse de neurones et d&#39;injecter des colorants chez la souris éveillée.

Préparation d&#39;une souris Awake pour l&#39;enregistrement des réponses de neurones et l&#39;injection de traceurs

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.3K vues.  Johns Hopkins University. La caractérisation électrophysiologique des réponses neuronales est important pour comprendre le fonctionnement du cerveau et pour guider la mise en place de colorants pour voie de traçage. Cependant, de nombreuses études sont réalisées chez des animaux anesthésiés. Pour comprendre le fonctionnement du cerveau sans anesthésie, nous avons développé une méthode pour enregistrer les propriétés de réponse de neurones et d'injecter des colorants chez la sou...

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Réponses Analyse des souris neurones sensoriels olfactifs Utilisation de l&#39;enregistrement Electroolfactogram Air-phase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Recherche

Neurosciences

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

La détection de l&#39;hypoxie dans le cortex de souris microrégionale cérébrale par imagerie à deux photons de fluorescence endogène NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l&#39;évaluation subséquente de la régénération par l&#39;analyse du Mont muscle entier

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

Des circuits neuronaux enregistrement à partir d&#39;un cancrelat système nerveux Intact

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

Neural activité Propagation dans un hippocampe Préparation déplié avec un pénétrant Micro-réseau d&#39;électrodes

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracellulaires enregistrement de l&#39;activité neuronale Combiné avec Microiontophoretic Application des substances neuroactifs chez la souris Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Méthode électrophysiologique de réponses d&#39;enregistrement intracellulaire tension de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.

Fabrication de haute Contactez-Density, Flat-Interface Electrodes nerveuses pour l&#39;enregistrement et de stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Enregistrement optique à grand champ à un seul photon dans des tranches de cerveau à l'aide de teinture sensible à la tension

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...