Con el apoyo de la NSF 0920060 de subvención, la subvención del NIH DC004395, NHMRC subvención de 1.009.482, Madrid Oficina de Ciencia y la Investigación Médica, y el Passe Garnett y Rodney Williams Memorial Foundation.

1. Reposacabezas Información general <ol><li> Para montar una hecha a la medida de cabeza después, inserte un 1/16 &quot;de acero inoxidable roll-pin perpendicularmente en un agujero perforado en un 3/32&quot; barra de acero inoxidable en forma de cruz. La pieza vertical de la cabeza-mensaje debe ser de aproximadamente 20 mm y la pieza transversal horizontal de aproximadamente 15 mm. Toque un extremo de la varilla vertical para aceptar un tornillo # 1-72. (Fig. 1). </li><li> Durante la cirugía y la grabación, la cabeza posterior está fijado en un latón hecha a la medida o barra de montaje de aluminio con un 1-72 # tornillo (Fig. 2). La pieza larga de la barra de montaje debe ser de 90 mm de largo y 5.10 mm de ancho. La cabeza post encaja en un surco en una extensión de 15 mm de la barra de tiempo que tiene un ángulo de 45 grados. Para evitar la rotación de la cabeza, el travesaño de los puestos de cabeza está ubicado en una pequeña ranura en la parte inferior de la barra de montaje. </li><li> La barra de montaje en la continuación, unido a un bloque de aluminio a la medida de montajeK (Fig. 3). El bloque de montaje es de aproximadamente 30 mm x 30 mm x 25 mm. Este bloque de montaje está unido a un micromanipulador de modo que la posición de la cabeza post puede colocarse con precisión a lo largo de la línea media y en Bregma. El bloque de montaje está hecha de dos piezas encajadas con tornillos. Un recorte en el bloque permite la barra de montaje para deslizarse dentro y se asegura con los tornillos. La barra de montaje es paralelo a la superficie de la mesa. Durante la grabación, asegurar la barra en una costumbre marco estereotáxico (fig. 4). El stereotax está diseñado para montar la barra en la misma posición que en el bloque de montaje durante la cirugía. Esta disposición asegura que el ratón siempre estará alineado con el marco estereotáxico en las sesiones experimentales. </li><li> Cortar una varilla de tungsteno (diámetro .010 &quot;) a aproximadamente 5 mm de longitud, con aproximadamente 1 mm de doblado a 45 °. Esta varilla sirve como el conector de tierra (fig. 1). </li></ol> 2. Al estereotáxicaignment por una craneotomía Nota: Todos los procedimientos que se describen a continuación siguen las técnicas quirúrgicas asépticas y han sido aprobados por el Cuidado de los Animales de la Universidad del Estado de Washington y el empleo y el Comité de Ética Animal del Instituto Garvan. <ol><li> Se anestesia el ratón mediante la colocación de una cámara de inducción con isoflurano al 5%. La falta de una reacción a la cola y / o pizca dedo se asegura de que el animal esté totalmente anestesiado. </li><li> Coloque el ratón en un marco estereotáxico roedores equipado con un adaptador de ratón (Stoelting). Para orientar correctamente el ratón, coloca los dientes en el orificio de la barra de bocado y apriete la pinza de nariz, de manera que quede ajustado. Coloque el ratón lo más recta posible en la barra de bocado y la abrazadera de la nariz. Coloque una mascarilla hecha de un trozo de guante de látex sobre la nariz del ratón, y mantener el isoflurano, el 5% hasta que la velocidad del ratón la respiración es de aproximadamente 1 respiración / seg. Gire el isoflurano al 1,5 - 2,0%. Asegure el cabezal con tque los oídos de los bares con cuidado para no romper la membrana del tímpano. Bares debe ser ajustado, pero no penetra muy profundamente en los canales auditivos. </li><li> Coloque una almohadilla de calefacción debajo del ratón. </li><li> Aplicar ungüento oftálmico para evitar que los ojos se sequen. </li><li> Afeitar el cuero cabelludo de entre las orejas hasta los ojos con una pequeña máquina de afeitar o tijeras de punta fina. </li><li> Limpiar y desinfectar el cuero cabelludo frotando con clorhexidina (o betadine) matorral seguido por el alcohol enjuague repetido 3 veces. </li><li> Para quitar la piel sobre la parte superior del cráneo hacer una incisión a lo largo de la línea media de la parte posterior de la cabeza a los ojos. </li><li> Raspe el periostio a los bordes de la incisión con un bisturí. Si es necesario (dependiendo de destino experimental), cuidadosamente retraer la musculatura en la parte posterior del cuello con fórceps, permitiendo que el músculo se rasga a lo largo fascículos para minimizar el sangrado. Aplicar espuma de gel debajo tejido del cuero cabelludo para reducir al mínimo la humedad y evitar que la piel se mueve sobre el cráneo. </li><li> Seque la superficie del cráneo con un aplicador con punta de algodón humedecido con alcohol isopropílico para mejorar la visualización de puntos de referencia del cráneo. </li><li> Alinear el cráneo a la norma estereotáxica coordenadas 13. Inserte una sonda de punta fina en el soporte del electrodo y colóquelo en el micromanipulador estereotáxica. Una barra de metal afilado funciona bien para este fin (fig. 5). </li><li> Utilizar el punto de identificar Bregma (fig. 5A) y Lambda (fig. 5B) en el cráneo. Mueva la sonda de ida y vuelta entre estos puntos, comprobando que la coordenada lateral-medial para cada ubicación difiere en no más de 50 m. Vuelva a colocar la cabeza, según sea necesario con cuidado aflojando los oídos-bar, cambio de la cabeza y los oídos de las barras laterales, y volviendo a apretar los oídos de las barras. </li><li> Verificar que la altura dorsal-ventral en cada ubicación difiere por no más de 50 micras. Ajuste la altura de la nariz-abrazadera, que se gire el cráneo alrededor del eje de las orejas bares,para nivelar el terreno de juego del cráneo si es necesario. La altura de la oreja-bar también puede ser necesario ajustar. </li><li> Utilizar un atlas 13 para identificar las coordenadas de la diana de interés (fig. 5C) relativa a Bregma. Marcar el cráneo por encima del objetivo (por ejemplo, una &quot;X&quot; o el uso de puntos de tinta china cuatro esquinas de un cuadrado), donde una craneotomía se hará (Fig. 5D). </li></ol> 3. Head-post y la instalación de tierra Pin <ol><li> El uso de gel de grabado para limpiar el cráneo. Use el aplicador para fregar y la propagación de gel de grabado sobre la superficie (10 seg). Lavar con agua y seque por completo. Aplicar la imprimación para cemento dental a la superficie del cráneo usando un aplicador. Extienda el adhesivo con el nuevo aplicador. Cure el adhesivo con una pistola de luz UV (1 ciclo). </li><li> Seleccione una ubicación para la terminal de tierra que es distal al sitio de destino. Cuidadosamente un agujero pequeño en el cráneo con la punta de un bisturí # 65 miniblade lo suficientemente ancha como para la parte corta de la tierra ppara entrar y descansar en las meninges. El conector de tierra debe ser orientado de modo que se está apuntando lejos del bregma y el futuro de cabeza posterior (fig. 6A). </li><li> Asegure la cabeza después de que la barra de montaje, bloquear y adjuntar a la micromanipulador. Al mover el micromanipulador en tres dimensiones, la posición de la cabeza-después de más de Bregma, acaba de tocar el cráneo (Fig. 6B). La base de la cabeza-post deben estar planos sobre el cráneo. </li><li> Uso de las sondas de disección, aplique una pequeña cantidad de cemento dental alrededor de la cabeza-post y el pin de tierra (Fig. 6C). Presione el cemento hacia abajo para asegurar un buen contacto con el cráneo. Nota: No utilice cemento en exceso o que no se endurece de manera uniforme. Cura el cemento con una pistola de luz ultravioleta (3-4 ciclos desde múltiples ángulos). </li><li> Aplicar la segunda etapa de cemento y construir la base alrededor de la cabeza post y cubrir las ranuras de la cabeza-posterior (Fig. 6D). </li></ol> 4. Craneotomía <ol><li> Localizar craneotomía marca de referencia, que será parcialmente oscurecido por el cebador. Utilice un bisturí # 65 para marcar un 3 mm x 3 mm cuadrados en torno a este sitio y aplicar una gota de lidocaína para reducir la sensibilidad y reducir al mínimo la hemorragia. </li><li> Haga varias partituras a cada lado de la plaza (hasta 10), teniendo cuidado de no cortar el hueso y en el cerebro (Fig. 7A). </li><li> Una vez que el colgajo óseo se afloja, utilice la punta del bisturí para que levante, dejando intacta la duramadre (Fig. 7B). </li><li> Cubrir con cera de hueso. </li></ol> 5. Después de la cirugía <ol><li> Apague la anestesia con gas y quitar el ratón de marco estereotáxico. </li><li> Utilice un aplicador con punta de algodón para aplicar el ungüento de lidocaína en torno a la piel expuesta para amortiguar la sensación alrededor de la herida. Utilice otro aplicador con punta de algodón para aplicar Neosporin a la piel expuesta. Inyectar el ketoprofeno (5 mg / kg IM o IP basada en la preferencia de cada uno de los veterinarios del IACUC) comoun analgésico después de la cirugía. Ratón en general, estará listo y se desplazan dentro de minutos de interrupción de gas. </li><li> Coloque el ratón en una jaula caliente y el monitor hasta que esté listo para volver a albergar a los animales. </li><li> El animal se debe comprobar en al menos una vez por día después de que se ha recuperado de la cirugía. Esté atento a signos de falta de apetito y / o alcohol y el comportamiento apático. Si el dolor se sospecha, proporcionar ketoprofeno cada 24 horas (misma dosis que al final de post-cirugía) hasta aliviarse. La lidocaína puede ser aplicada localmente en la herida si el animal se rasca o muestra signos de incomodidad. Los animales se recuperan de una cirugía sin complicaciones ni dolor. </li></ol> 6. Grabación y tinte de inyección <ol><li> Espere por lo menos un día después de la cirugía de la cabeza-post antes de usar el ratón para las grabaciones. </li><li> Coloque el ratón en un dispositivo de espuma moldeada de restricción al cuerpo del ratón. El ratón ya se ha adaptado a este dispositivo, reduciendo así su ansiedad. La adaptación típica espara manejar el ratón cada día después del destete y durante aproximadamente una semana antes de la cirugía y experimentos, colocar el ratón en el dispositivo de espuma durante 1-5 minutos. Suspender dispositivo en el marco estereotáxico (fig. 4). </li><li> Segura de cabeza posterior a la barra de montaje, que ahora está fijado al bastidor estereotáxico (fig. 4). </li><li> Conecte el conector de tierra con un cable terminado con un objeto romo de calibre 22 punta de la aguja hipodérmica. </li><li> Retire la cera ósea a lo largo de la craneotomía. Retire dura si es necesario con la punta de un bisturí miniblade. </li><li> Drive electrodo a la localización estereotáxica adecuada y comenzar la grabación (fig. 8). Por sólo registros electrofisiológicos, una variedad de electrodos pueden ser utilizados. La elección del electrodo depende de la localización y el tipo de grabaciones requeridas. La elección del electrodo para las grabaciones de ratón despierto será el mismo que lo que un investigador utiliza en un ratón anestesiado. Por combinados con registros electrofisiológicoscolorante / trazador inyecciones, un electrodo micropipeta se utiliza 10. La micropipeta se llena con el colorante / trazador de elección para que pueda ser inyectado iontoforéticamente al final de los experimentos electrofisiológicos. Electrodos Multibarrel también se puede utilizar de modo que las manipulaciones farmacológicas puede ser hecho. El electrodo multibarrel se monta sobre una micropipeta sola grabación (fig. 8). Estas técnicas son estándar en la literatura y no son diferentes para las grabaciones anestesiados frente despierto. </li><li> Las grabaciones se pueden realizar durante 4-5 horas en el transcurso de 3-4 días consecutivos. </li><li> Al final de la sesión de grabación, el colorante / trazador puede ser inyectado. Porque no hay receptores del dolor en el cerebro, la inyección iontoforético del colorante o trazador en el cerebro es poco probable que cause molestias. Sin embargo, una vez que las propiedades de respuesta electrofisiológicos de la región donde la inyección debe ser hecho se caracterizan, el animal puede ser anestesiados con isoflurano fo la inyección. Esto eliminaría las sensaciones no deseados potenciales. Debido a que el colorante / trazador está ya en la micropipeta, los conductores activos y tierra se puede cambiar desde el registro electrofisiológico puesta a punto para el generador de corriente para inyectar el colorante iontoforéticamente / trazador. Utilizar protocolo adecuado para el tinte / trazador en el electrodo. Retire el animal de la moderación y la contención headpost cuerpo y volver a su jaula. </li><li> Al final del experimento, seguir el protocolo apropiado para la eutanasia y el procesamiento del tejido para recuperar sitio de la inyección y el etiquetado. </li></ol> 7. Los resultados representativos La instalación correcta de la cabeza-puesto permite al experimentador para registrar las respuestas individuales y de unidades múltiples de un ratón anestesiado, despierto durante varios días. El sistema de sujeción permite la estabilidad de los registros electrofisiológicos de las neuronas individuales en el cerebro. Excelente aislamiento de las unidades individuales y las respuestas fuertes testímulos o puede ser grabado desde la estructura del cerebro mismo durante varios días, por ejemplo en el ratón colículo inferior (Fig. 9A días, un; Figura 9B, dos días). Con una buena cabeza posterior a la instalación, cada ratón será siempre alineado con el aparato estereotáxico y el ratón estereotáxica atlas, 13 que resulta en la localización fiable de los núcleos del cerebro en particular. Esta localización fiable permite la inyección de colorantes y trazadores en las estructuras específicas después de varios días de grabación. Por ejemplo, para evaluar descendiendo proyecciones del mesencéfalo auditivo en el tronco cerebral auditivo, biotinilado dextrano amina (diaminobencidina visualizaron utilizando como cromógeno) puede ser inyectado en el ratón colículo inferior (fig. 10A) después electrofisiológicamente identificar propiedades neuronales de respuesta en el sitio de inyección (en la fig. 10A, una neurona se registró con un mejor frecuencia de 51 kHz), y después de la elaboración de tejidos, unetiquetado nterograde en el núcleo coclear dorsal contralateral se ha visualizado y se traza (Fig. 10B). Fotomicrografías de mayor resolución también puede obtenerse a ver los axones anterógradamente etiquetados y terminales (Fig. 10C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig1.jpg" /> Figura 1. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig2.jpg" /> Figura 2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig3.jpg" /> Figura 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig4.jpg" /> Figura 4. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig5.jpg" /> Figura 5. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig6.jpg" /> <strong&gt; Figura 6. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig7.jpg" /> Figura 7. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig8.jpg" /> Figura 8. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig9.jpg" /> Figura 9. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig10.jpg" /> Figura 10.

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	<li>Evans, E. F., Nelson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+responses+of+single+neurones+in+the+cochlear+nucleus+of+the+cat+as+a+function+of+their+location+and+the+anaesthetic+state.">The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state.</a> Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+classes+in+the+dorsal+cochlear+nucleus+and+its+output+tract+in+the+chloralose-anesthetized+cat.">Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat.</a> J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).</li><li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthetics+change+the+excitation/inhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus.">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).</li><li>Young, E. D., Brownell, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+tones+and+noise+of+single+cells+in+dorsal+cochlear+nucleus+of+unanesthetized+cats.">Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats.</a> J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).</li><li>Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+properties+of+neurons+in+two+parts+of+the+primary+motor+cortex+of+the+awake+rat.">Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat.</a> Brain Res. , 333-3173 (1985).</li><li>Westby, G. W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+floating+microwire+technique+for+multichannel+chronic+neural+recording+and+stimulation+in+the+awake+freely+moving+rat.">A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).</li><li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+sensitive+to+combinations+of+information-bearing+elements+of+biosonar+signals+in+the+mustache+bat.">Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat.</a> Science. 200, 778-781 (1978).</li><li>O'Neill, W. E., Suga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+range-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat.">Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 69-73 (1979).</li><li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonic-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat.">Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 270-274 (1979).</li><li>Portfors, C. V., Felix, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2nd+Spectral+integration+in+the+inferior+colliculus+of+the+CBA/CaJ+mouse.">2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse.</a> Neuroscience. , 136-1159 (2005).</li><li>Felix, R. A., Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory,+inhibitory+and+facilitatory+frequency+response+areas+in+the+inferior+colliculus+of+hearing+impaired+mice.">Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice.</a> Hear Res. 228, 212-229 (2007).</li><li>Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-representation+of+species-specific+vocalizations+in+the+awake+mouse+inferior+colliculus.">Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus.</a> Neuroscience. 162, 486-500 (2009).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2007).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

La ventaja del sistema de sujeción de cabeza después de experimentos electrofisiológicos y neuroanatómicos en el ratón es que los experimentos pueden llevarse a cabo con ratones anestesiados, despierta, la eliminación de la contaminación potencial de respuesta debido a las drogas anestésicas. Además, la puesta en marcha se puede utilizar en varios días para permitir el uso de animales más eficiente. La mayoría de los componentes de la cabeza-post están disponibles fuera de la pl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Gel de Etch para la limpieza de cráneo antes de cemento dental </td><td> Henry Schein </td><td> 101-5396 </td><td> 12/pk con 1,2 ml jeringas </td></tr><tr><td> Manual para cemento dental </td><td> Kerr Optibond </td><td> 25881 </td><td> 8 ml botella </td></tr><tr><td> Adhesivo para el cemento dental </td><td> Kerr Optibond </td><td> 25882 </td><td> 8 ml botella </td></tr><tr><td> Aplicadores para cemento dental </td><td> Kerr Optibond </td><td> 24680 </td><td> 200/pk </td></tr><tr><td> Cemento dental </td><td> Carisma, Heraeus Kulzer </td><td> 66000085 </td><td> Vuelva a llenar la jeringa 4gm </td></tr><tr><td> Tungsteno Rod (perno de tierra) </td><td> Los sistemas AM </td&gt; <td> 717200 </td><td> 0,010 &quot;de diámetro </td></tr><tr><td> Economía UV curado de luz </td><td> Henry Schein </td><td> CU-80 </td><td></td></tr><tr><td> Jefe post </td><td> Construido en la casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Barra de montaje </td><td> Construido en la casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bloque de montaje </td><td> Construido en la casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Marco estereotáxico </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 902 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse y el adaptador de ratas recién nacidas </td><td> Stoelting </td><td> 51625 </td><td></td></tr><tr><td> Deltaphase Pad isotérmico </td><td> Braintree Scientific, Inc. </td><td> 39DP </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of an awake mouse for recording neural responses and injecting tracers

Es bien conocido que la anestesia altera las propiedades neuronales de respuesta en diversas regiones del cerebro. 13. En el sistema auditivo, las propiedades fundamentales de respuesta de las neuronas del tronco cerebral como el umbral, la especificidad de frecuencia, y las bandas laterales inhibidoras se alteran de manera significativa bajo anestesia 1-2. Estas observaciones se le solicite fisiólogos a buscar formas de grabar a partir de las neuronas individuales, sin los efectos contaminantes de la anestesia. Un resultado fue una preparación descerebración, donde se secciona el tronco cerebral completamente en el nivel del mesencéfalo 4. Los inconvenientes de esta preparación es una cirugía formidable, la eliminación de bajar las proyecciones del cerebro anterior, y una incapacidad para utilizar la estimulación sensorial para examinar las estructuras por encima del cerebro medio. Una estrategia diferente ha sido la implantación de conjuntos de electrodos crónicamente a grabar a partir de neuronas individuales y grupos de múltiples unidades, mientras el animal está despierto y / o se comporta de 5,6 </sup&gt;. Estas técnicas sin embargo, no son compatibles con la inyección de colorantes trazadores después primera electrofisiológicamente caracterizar una estructura del cerebro. Para evitar la alteración de las propiedades neuronales de respuesta con los anestésicos durante la grabación de las propiedades electrofisiológicas de respuesta de las neuronas individuales, hemos adaptado una técnica reposacabezas utilizado durante mucho tiempo en los murciélagos 7-9 al ratón 10-12. Usando este método, somos capaces de llevar a cabo registros electrofisiológicos durante varios días en el ratón anestesiado. Al final de las sesiones de grabación, podemos inyectar un colorante de reconstruir posiciones de los electrodos y los sitios de grabación o se inyecta un trazador de manera que las rutas hacia y desde los lugares de grabación se puede determinar. Este método permite también grabaciones aisladas de neuronas individuales durante varios días sin que los anestésicos de uso.

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Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

Caracterización electrofisiológica de las respuestas neuronales es importante para entender la función del cerebro y para guiar la colocación de los tintes para el rastreo vía. Sin embargo, muchos estudios se realizan en animales anestesiados. Para entender la función del cerebro sin anestesia, hemos desarrollado un método para registrar las propiedades neuronales de respuesta e inyectar tintes en el ratón despierto.

Preparación de un ratón para la grabación de Despierta respuestas neuronales y de inyección de trazadores

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.3K vistas.  Johns Hopkins University. Caracterización electrofisiológica de las respuestas neuronales es importante para entender la función del cerebro y para guiar la colocación de los tintes para el rastreo vía. Sin embargo, muchos estudios se realizan en animales anestesiados. Para entender la función del cerebro sin anestesia, hemos desarrollado un método para registrar las propiedades neuronales de respuesta e inyectar tintes en el ratón despierto.

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Investigación

Neurociencias

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

La detección de la hipoxia Microrregional en corteza cerebral de ratón por la imagen de dos fotones de fluorescencia endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

Neural Circuito de grabación de una cucaracha sistema nervioso intacto

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Fabrication of High Contact-Density, Flat-Interface Nerve Electrodes for Recording and Stimulation Applications

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic applications. This protocol describes a fabrication technique of a modified cylindrical nerve cuff electrode to meet these criteria. Minimum computer-aided design and manufacturing (CAD and CAM) skills are necessary to consistently produce cuffs with high precision (contact placement 0.51 &#177; 0.04 mm) and various cuff sizes. The precision in spatially distributing the contacts and the ability to retain a predefined geometry accomplished with this design are two criteria essential to optimize the cuff&#39;s interface for selective recording and stimulation. The presented design also maximizes the flexibility in the longitudinal direction while maintaining sufficient rigidity in the transverse direction to reshape the nerve by using materials with different elasticities. The expansion of the cuff&#39;s cross sectional area as a result of increasing the pressure inside the cuff was observed to be 25% at 67 mm Hg. This test demonstrates the flexibility of the cuff and its response to nerve swelling post-implant. The stability of the contacts&#39; interface and recording quality were also examined with contacts&#39; impedance and signal-to-noise ratio metrics from a chronically implanted cuff (7.5 months), and observed to be 2.55 &#177; 0.25 k&#8486; and 5.10 &#177; 0.81 dB respectively.

This article provides a detailed description on the fabrication process of a high contact-density flat interface nerve electrode (FINE). This electrode is optimized for recording and stimulating neural activity selectively within peripheral nerves.

Fabricación de alta densidad, Contacto-Interface plana Electrodos nerviosas para aplicaciones de registro y estimulación

Many attempts have been made to manufacture multi-contact nerve cuff electrodes that are safe, robust and reliable for long term neuroprosthetic ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Construcción de un hiperimpulsor mejorado del tetrodo múltiples de grabación Neural a gran escala en comportarse ratas

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Grabación óptica de campo ancho de un solo fotón en cortes cerebrales con tinte sensible al voltaje

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...