Os autores gostariam de agradecer à Divisão de Vector Borne-Doenças Animais Branch Resources, especificamente Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O&#39;Brien, e John Liddell para seu cuidado e manutenção dos ratos e coelhos. Gostaríamos também de agradecer a Amy Ullmann, Theresa Russell, e Barbara J. Johnson para suas contribuições para este manuscrito. Finalmente, gostaríamos de reconhecer Alissa Eckert no Gabinete do Diretor Adjunto de Comunicação do CDC para produzir as ilustrações gráficas e Judy Lavelle para dirigir todos os assuntos legais relacionados com a filmagem deste manuscrito.

1. Coleta de hemolinfa para a preparação de slides (Filme 1) <ol><li> Remover suavemente activamente carrapatos de alimentação a partir de um animal e em lugar de peróxido de hidrogénio a 3% tópica durante 5 minutos e, em seguida, em etanol a 70% durante 10 minutos à superfície esterilizar. </li><li> Com uma caneta pap desenhar um círculo sobre uma lâmina de microscópio com revestimento de silano e coloque o carrapato dentro do círculo caneta pap. <ol><li> Silano lâminas revestidas são utilizados para melhor adesão da hemolinfa para a lâmina de microscópio. </li></ol></li><li> Ver o carrapato sob um microscópio de dissecação (1X objetivo, ocular de 10X, a ampliação 3.5X). </li><li> Com cuidado, empurre para baixo no dorso do carrapato com uma pinça para afunilar as pernas do carrapato e imobilizar o carrapato. </li></ol> Nota: Quando imobilizar o carrapato não pressionar muito difícil, porque isso pode prejudicar o intestino ou perfure o carrapato e contaminar a hemolinfa. <ol start="5"><li> Amputar a perna do carrapato ou pernas em diaconjunto e distal com uma ponta fina descartável bisturi. Para determinar a infectividade via hemolinfa apenas 1 perna precisa ser amputado. Para a coleta de hemolinfa sobre uma lâmina várias pernas pode ser amputado. </li></ol> Nota: Não corte a perna muito perto do corpo, porque isso pode causar a contaminação do intestino médio da hemolinfa. <ol start="6"><li> Após a perna ou pernas são cortadas continuar a aplique uma pressão suave dorso do carrapato para a hemolinfa para secretar fora das pernas para o slide. Mova suavemente o carrapato em torno sobre o slide para espalhar a hemolinfa. </li></ol> 2. Remoção completa da glândula salivar (Filmes 2 e 3) <ol><li> Spot de vários pools 25 ul de tampão fosfato salino (PBS) numa lâmina de microscópio e colocar uma carraça em uma das piscinas PBS. </li><li> Ver o carrapato sob um microscópio de dissecação (1X objetivo, ocular de 10X, a ampliação 3.5X). </li><li> Estabilizar o carrapato com pinça ponta finas, segurando o capitulum base (partes da boca) ou a parte traseira da carraça. </li><li> Inserir a pinça de ponta fina na parte traseira do carrapato e fatiar o carrapato é dorso que expõem os órgãos. Se desejado, o intestino médio pode ser removido neste momento e transferido para um pool de fresco de PBS numa lâmina de microscópio ou para um tubo de microcentrífuga contendo PBS. </li><li> Encontre o par de glândulas salivares (uva-como clusters) localizados bilateralmente ao lado das pernas do carrapato. Se as glândulas salivares não são visíveis entre os detritos carrapato mover a porção de carraça principal, ainda contendo as glândulas salivares, a um pool de fresco de PBS para reduzir a ruptura ea perda das glândulas salivares. </li></ol> Nota: No início de uma alimentação, as glândulas salivares são mais difíceis de localizar, porque não são tão desenvolvido como comparado com mais tarde na alimentação. <ol start="6"><li> Retire as glândulas salivares do carrapato com uma pinça com pontas finas e coloque em uma piscina nova de PBS. </li><li> Wiª pinça de ponta fina transferir as glândulas salivares para outro limpo piscina PBS 25 ul, repita esta etapa de lavagem 3-4 vezes mais para remover todos os microrganismos externos e os restos do carrapato. </li></ol> Nota: Lave os aglomerados de glândulas salivares com cuidado para reduzir a perda e ruptura das glândulas salivares individuais. <ol start="8"><li> Colocar as glândulas em uma piscina limpa de PBS numa lâmina de silano revestido ou em um tubo de microcentrífuga contendo PBS. </li></ol> 3. Coleta de saliva (Movie 4) <ol><li> Retire com cuidado fêmeas adultas do coelho ou outro host usando uma pinça com pontas finas, pouco antes que eles saem totalmente ingurgitadas, cerca de 5-7 dias pós-fixação. </li><li> Respeite o carrapato quase ingurgitadas em uma extremidade de uma lâmina de microscópio com fita adesiva. A fita deve ser colocado cerca de ¾ do caminho para cima do dorso do carrapato em direção à cabeça, deixando capitulum o carrapato base (partes da boca) exposta.</li><li> Sempre que a fita se encontra com o bordo anterior do dorsal superfície carrapatos uL de solução de pipeta 5 pilocarpina 5% (em metanol). Permitir a fita para o pavio pilocarpina sobre o carrapato do dorso, sem permitir que a pilocarpina para entrar em contato com o carrapato capitulum base. </li><li> Montar uma peça de non-toxic massa de modelar para a lâmina de microscópio aproximadamente uma polegada de peças bucais do carrapato. </li><li> Usando finas fórceps com pontas romper a ponta de um tubo capilar 28 puxado para o diâmetro desejado. </li><li> Ver capitulum o carrapato com base em um microscópio de dissecação. </li><li> Suavemente encaixar hypostome do carrapato para dentro do tubo capilar puxado permitindo que os palpos maxilares a residir no exterior do tubo capilar. </li><li> Pressione a extremidade oposta do tubo capilar na argila para segurar o tubo capilar no lugar. </li><li> Coloque o carrapato montado salivando dentro de uma câmara escura, com umidade elevada (por exemplo, uma caixa de isopor com tampa forrada com pap molhado<html> toalhas de ER). Inclinar a lâmina de modo que os pontos hypostome para o fundo do recipiente, permitindo que a gravidade para ajudar na recolha de saliva. </li><li> Colocar o recipiente à temperatura ambiente. </li><li> Acompanhar de perto os carrapatos salivando para a primeira hora, e recolher saliva, como é gerado por expulsando-o para fora dos tubos capilares com uma lâmpada de pipeta de Pasteur. Após a primeira hora, vá acumulação cada hora durante pelo menos 4 horas. Continuar a coleta de saliva como ele é gerado. </li></ol> Nota: aquisição de saliva pode ser interrompida uma vez bastante saliva são coletadas para o estudo que está sendo executada. <ol start="12"><li> Se os carrapatos não estão salivando ou se mais saliva é necessária, salivação pode ocasionalmente ser induzida com o uso do tubo capilar para massagear a hypostome. </li><li> Adicionar 0,1 volumes de cocktail inibidor de protease para a saliva e armazenar a -80 ° C até serem necessários. </li></ol> 4. Os resultados representativos e_content &quot;&gt; Movie 1 demonstra como a realização de uma ninfa parcialmente alimentado I. scapularis e amputar as pernas para coletar hemolinfa sobre uma lâmina de microscópio. Uma vez que a perna ou pernas amputadas um líquido claro é secretada (Figura 1A e 1B). Se o intestino é rompida na hemolinfa parece turvo como é sai da perna amputada (s) (Figura 1C e 1D). A extracção de glândulas salivares após a ninfa tem alimentado durante 48 ou 72 horas é demonstrado nos filmes 2 e 3. Após a marcação é perfurada há geralmente uma grande quantidade de detritos (consistindo de traqueia, malpighiano túbulos, sangue, tecido conjuntivo, etc), para impedir a perda ou a ruptura das glândulas salivares mover o carrapato a um pool de fresco de PBS. As Figuras 2A e 2B mostram onde as glândulas salivares estão localizadas após a ninfa foi cortado e aberto Figura 2C mostra removido aglomerados de glândulas salivares numa piscina de PBS. Coleta de saliva criada a partir de I. scapularis fêmeas adultas i<html> s mostrado na filme 4 e figura 3. Um carrapato salivando em um tubo capilar é observado em filme 5. Este método de coleta da saliva usada para estimular a salivação de pilocarpina e pode render mais de 20 ul de saliva por carrapato fêmea adulta. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3894/3894fig1.jpg" /> Figura 1. Estruturas rotuladas de uma ninfa scapularis I.. Filme 1. Ixodes scapularis coleção hemolinfa. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie1.avi">Clique aqui para assistir filme</a> . <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3894/3894fig2.jpg" /> Figura 2. Não contaminadas (A &amp; B) e contaminado (C &amp; D) hemolinfa exalando da perna da ninfa. Filme 2. Extração da glândula salivar de um 48 horas alimentados I. ninfa scapularis.pload/3894/3894movie2.avi &quot;&gt; Clique aqui para assistir filme. Filme 3. Extração da glândula salivar de um 72 horas alimentados I. ninfa scapularis. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie3.avi">Clique aqui para assistir filme</a> . <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3894/3894fig3.jpg" /> Figura 3. Glândulas salivares Ixodes scapularis ninfa. (A &amp; B) Exemplos de glândulas salivares em um 72 horas alimentados ninfa, antes da extração. (C) removido do cluster da glândula salivar. Movie 4. Coleta de saliva criado a partir de um adulto I. carrapato fêmea scapularis. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie4.avi">Clique aqui para assistir filme</a> . <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3894/3894fig4.jpg" /> Figura 4. Coleta de saliva de adultos de I. scapularis t mulheresicks. (A e B) Assinale montado sobre uma lâmina com a sua hypostome no final puxado do tubo capilar, com o fim unpulled do tubo capilar realizada por argila de modelagem. (C &amp; D) câmara úmida contendo salivando adulto I. scapularis carrapatos fêmeas. Filme 5. Ixodes scapularis carrapato fêmea salivando em um tubo capilar. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie5.avi">Clique aqui para assistir filme</a> .

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Biotechnol. 2, 381-386 (2000).</li><li>Estrada-Pena, A., Jongejan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ticks+feeding+on+humans:+a+review+of+records+on+human-biting+Ixodoidea+with+special+reference+to+pathogen+transmission.">Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission.</a> Exp. Appl. Acarol. 23, 685-715 (1999).</li><li>Nuttall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-tick-host+interactions:+Borrelia+burgdorferi+and+TBE+virus.">Pathogen-tick-host interactions: Borrelia burgdorferi and TBE virus.</a> Zentralbl Bakteriol. 289, 492-505 (1999).</li><li>Jones, L. D., Hodgson, E., Nuttall, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+infectivity+of+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi+derived+from+Ixodes+scapularis+salivary+glands+and+midgut.">Differential infectivity of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi derived from Ixodes scapularis salivary glands and midgut.</a> J. Med. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+tick+oral+secretions+obtained+by+three+different+collection+methods.">Composition of tick oral secretions obtained by three different collection methods.</a> J. Med. Entomol. 10, 198-201 (1973).</li><li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolymph+test.+A+technique+for+detection+of+rickettsiae+in+ticks.">Hemolymph test. A technique for detection of rickettsiae in ticks.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 1010-1014 (1970).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

A coleta de hemolinfa do carrapato, glândulas salivares e saliva é importante no estudo da transmissão de patógenos transmitida por carrapatos, a divulgação, prevalência, proliferação e persistência, tanto carrapato e do exército 6,11-13,20,23,29. Existem várias maneiras de dissecar um carrapato 30,31. No entanto, ao coletar as glândulas salivares é fundamental para dissecar o carrapato corretamente para as glândulas salivares não são rompidas ou perdido em restos do carrapato. Uma...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> O peróxido de hidrogênio </td><td> Pescador </td><td> H312-500 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Acros </td><td> 61509-5000 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Bioproducts Boston </td><td> BM-2205 </td></tr><tr><td> Dumont Fino fórceps (3C) </td><td> Pescador </td><td> NC9906085 </td></tr><tr><td> Silano tratados lâminas de microscópio </td><td> Bioworld </td><td> 42763007-1 </td></tr><tr><td> Caneta Pap </td><td> Bioworld </td><td> 21750008-1 </td></tr><tr><td> Super geada mais lâminas de microscópio </td><td> Pescador </td><td> 12-550-18 </td></tr><tr><td> Pilocarpina </td><td> Sigma </td><td> P6503-5G </td></tr><tr><td> Cocktail inibidor de protease </td><td> Sigma </td><td> P2714 </td></tr><tr><td> # 11 bisturi descartável </td><td> Pena </td><td> 2975 # 11 </td></tr><tr><td> Massa de modelar não tóxica </td><td&gt; Fisher </td><td> S17307 </td></tr><tr><td> Os tubos capilares </td><td> Perseguição científica Glass, inc </td><td> 40A502 </td></tr></tbody></table>

saliva, salivary gland, and hemolymph collection from ixodes scapularis ticks

Carrapatos são encontrados em todo o mundo e afligem os seres humanos com muitas doenças transmitidas por carrapatos. Os carrapatos são vetores de patógenos que causam a doença de Lyme e transmitida por carrapatos febre recorrente (Borrelia spp.), Febre maculosa (Rickettsia rickettsii), erliquiose (Ehrlichia chaffeensis e E. equi), anaplasmose (Anaplasma phagocytophilum), encefalite (tick- vírus da encefalite transmitida), babesiose (Babesia spp.), Colorado febre do carrapato (Coltivirus), e tularemia (Francisella tularensis) 1-8. Para ser adequadamente transmitida para o anfitrião destes agentes infecciosos diferencialmente regulam a expressão gênica, interagir com as proteínas de carrapatos, e migram através do carrapato 3,9-13. Por exemplo, o agente da doença de Lyme, Borrelia burgdorferi, adapta-se através da expressão diferencial de genes para as fases de festa e fome de ciclo enzoótico do carrapato 14,15. Além disso, como carrapatos um Ixodes consome umafarinha de sangue Borrelia replicar e migrar do intestino para a hemocele, onde eles viajam para as glândulas salivares e são transmitidos para o host com a saliva expelida 9,16-19. Como um carrapato se alimenta do hospedeiro geralmente responde com uma resposta hemostática e inata imunológico forte 11,13,20-22. Apesar destas respostas de acolhimento, I. scapularis pode se alimentar por vários dias porque a saliva do carrapato contém proteínas que são imunomoduladores, agentes líticos, anticoagulantes, e fibrinolysins para ajudar o carrapato alimentando 3,11,20,21,23. As atividades imunomoduladoras possuídos pela saliva do carrapato ou extrato de glândula salivar (SGE) facilitar a transmissão, a proliferação e disseminação de inúmeros carrapatos patógenos 3,20,24-27. Para entender melhor como carrapatos agentes infecciosos causam a doença é essencial para dissecar alimentando ativamente carrapatos e coletar a saliva do carrapato. Este protocolo de vídeo demonstra técnicas de dissecação paraa recolha de hemolinfa e à remoção das glândulas salivares de alimentação activamente I. scapularis ninfas após 48 e 72 horas pós posicionamento do mouse. Nós também demonstramos a coleta da saliva de uma fêmea adulta I. carrapato scapularis.

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Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

A coleta de hemolinfa do carrapato infectado, glândulas salivares e saliva é importante estudar como a transmitida por carrapatos patógenos causam doenças. Neste protocolo, demonstramos como coletar glândulas salivares e hemolinfa de alimentação<em&gt; Ixodes scapularis</em&gt; Ninfas. Nós também demonstramos a coleta da saliva da fêmea<em&gt; I. scapularis</em&gt; Adultos.

A saliva, glândula salivar, e Coleta de hemolinfa de carrapatos Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

29.2K visualizações.  Centers for Disease Control and Prevention. A coleta de hemolinfa do carrapato infectado, glândulas salivares e saliva é importante estudar como a transmitida por carrapatos patógenos causam doenças. Neste protocolo, demonstramos como coletar glândulas salivares e hemolinfa de alimentação Ixodes scapularis Ninfas. Nós também demonstramos a coleta da saliva da fêmea I. scapularis Adultos.