Gerar modelos celulares primários ou estruturas organoides é a chave para responder a muitas questões contemporâneas na biologia. Por exemplo, estamos interessados há algum tempo nos mecanismos usados pelos vírus humanos para facilitar a replicação na glândula salivar, pois é um local importante para a transmissão horizontal. O desenvolvimento do sistema baseado em salisphere descrito neste protocolo é um avanço crucial em nossa busca para responder a esses tipos de perguntas.
Esta técnica nos permite gerar células primárias a partir de uma variedade de diferentes amostras de pacientes. Os modelos celulares lembram mais a situação do tipo in vivo, pois as células não são modeladas ou transformadas como muitos tipos de células comumente usados para experimentos in vitro. Usamos este protocolo para gerar células semelhantes da glândula submandibular primária do rato e o protocolo provavelmente seria útil para outros órgãos com estruturas celulares semelhantes.
Dentro de duas a quatro horas após a remoção do paciente, em uma placa de cultura, use tesouras de dissecação esterilizada autoclaved e fórceps cirúrgicos para picar o tecido da glândula salivar em pedaços finos do tamanho de um a dois milímetros. Adicione seis mililitros da solução Dispase/Collagenase ao tecido picado. Em seguida, incubar a 37 graus Celsius por aproximadamente 30 minutos a uma hora.
Interrompa o tecido com uma pipeta sorológica de cinco mililitros 15 a 20 vezes. Incubar a 37 graus Celsius por mais 30 minutos a uma hora. Repita a pipetação e a incubação passo duas a três vezes mais ou até que o tecido se assemelhe a um chorume e possa facilmente passar pela abertura da pipeta.
Para revestir poços com BMM, lentamente pipeta 500 microliters de BMM durante a noite descongelou em cada poço de uma placa de seis poços. Gire lentamente a placa para distribuir uniformemente o BMM sobre os poços. Em seguida, incubar as placas revestidas a 37 graus Celsius por pelo menos 15 minutos antes de usar para permitir que o BMM se solidifique.
Primeiro, transfira a solução Dispase/Collagenase contendo tecido homogeneizado para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave a parede da placa uma vez com seis mililitros de DPBS para transferir as células restantes para o tubo cônico. Em seguida, através de um coador de células de malha de nylon de 70 micrômetros, filtrar o homogeneizar em um novo tubo cônico de 50 mililitros para remover tecido não digerido.
Centrífuga células tensas por cinco minutos a 500 vezes g. Aspire o supernatante. Em seguida, resuspende a pelota de célula em 10 mililitros de 1X RBC lysis buffer.
Incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 20 a 25 mililitros de DPBS para neutralizar o tampão de lise RBC e minimizar a lise das células salivares. Centrifugar por cinco minutos a 500 vezes g.
A pelota de célula branca indica lise completa de toda ABC. Se a pelota tiver cor vermelha, repita o tratamento com tampão de lise RBC. Aspire o supernascer e resuspende a pelota em um a dois mililitros de BEGM e, em seguida, transfira as células resuspended para poços revestidos de BMM.
Incubar a 37 graus Celsius. Uma vez banhadas em BMM, as células se formarão em estruturas esféricas ou salispheres durante um período de dois a três dias. As células podem ser mantidas como salispheres por cerca de cinco a sete dias antes que o BMM comece a se degradar permitindo que as células acessem e aderam ao plástico e cresçam como uma monocamada.
Primeiro, aspire a mídia dos poços e adicione um mililitro de solução Dispase/Collagenase a cada poço. Incubar a 37 graus Celsius por aproximadamente 15 minutos ou até que a BMM tenha dissolvido. Em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e lave poços uma vez com um a três mililitros de DPBS para obter as células restantes.
Centrifugar por cinco minutos a 500 vezes g. Aspire o supernasce e resuspenda a pelota em dois mililitros de Trypsin. Incubar novamente a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Em seguida, adicione ao tubo qualquer mídia completa contendo 10% de soro para neutralizar o Trypsin. Centrifugar por cinco minutos a 500 vezes g. Aspire o supernatante para remover a mídia residual, trippsina e soro e, em seguida, resuspend as células em DPBS.
Centrifugar por cinco minutos a 500 vezes g. Aspire o supernatante e resuspense a pelota em BEGM. Para manter a pelota como esferas, emplaque as células resuspended em pratos de cultura revestidos de BMM solidificados.
Cultura todas as células em uma incubadora umidificada mantida a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco a sete dias antes da subcultura. Alimente-se com begm fresco a cada dois ou três dias. Para proliferar as células como uma monocamada em pratos de cultura plástica, aspire a mídia BEGM do prato e lave uma vez com DBPS para remover a mídia residual.
Adicione dois mililitros de Trippsina e incubar a 37 graus Celsius por 15 minutos ou até que as células tenham se destacado totalmente. Neutralizar trypsin usando quatro mililitros de qualquer mídia completa contendo 10% de soro. Em seguida, incline suavemente o prato e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros.
Lave a placa uma vez com aproximadamente cinco mililitros de DPBS para coletar as células restantes. Centrifugar por cinco minutos a 500 vezes g. Aspire o supernatante.
Para remover a mídia residual, resuspend células em seis a dez mililitros de DPBS. Centrifugar por cinco minutos a 500 vezes g. Aspire o supernatante e resuspend em BEGM.
Em seguida, coloque as células nos pratos de cultura de tecido plástico tratado. Cultura as células em uma incubadora umidificada mantida a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco a sete dias antes da subcultura. Alimente-se com begm fresco a cada dois ou três dias.
Neste protocolo, depois de emplacar células do tecido digerido em BMM por dois a três dias, as células prontamente formaram pequenos aglomerados que continuaram a expandir-se em tamanho de até 15 a 20 células por cluster. As células da salisphere foram banhadas em plástico tratado com cultura celular e cultivadas como uma monocamada onde exibem morfologia consistente com células de origem epitelial. Técnica asséptica adequada e cuidados são necessários para evitar contaminação bacteriana ou fúngica.
Nenhuma quantidade de antibióticos ou antimípticos salvará uma cultura repleta de micróbios. Estamos respondendo perguntas sobre patogênese viral e transmissão. Mas, para outros, isso fornece uma maneira de estudar células salivares humanas para qualquer número de aplicações, como terapias de regeneração tecidual.
Para nós que estudamos o Citomegalovírus humano, essa técnica nos permitiu começar a explorar os mecanismos moleculares que o vírus utiliza para infectar e, finalmente, transmitir para novos hospedeiros. Nada usado neste protocolo é inerentemente perigoso, mas deve-se sempre ter cuidado ao manusear tecido humano e qualquer tipo de reagente químico.
