Assim, a análise do genoma da metilação de DNA com a plataforma de LA para aberração complexa da metilação de DNA no genoma humano pode fornecer informações importantes de biomarcadores epigenéticos em câncer gastrointestinal. Embora esta plataforma de LA para aberração complexa da metilação de DNA no genoma humano, é ótima em termos de custo e cobertura genômica. Então, demonstrando o procedimento será Hirotaka Momose, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para começar, prepare 10 micrômetros de seções incorporadas de parafina fixas em formalina não manchadas. Coloque os slides em um suporte de lâmina de vidro e encha-os com soro fisiológico, certificando-se de que todo o tecido na lâmina está submerso. Deixe os slides em xileno por 15 minutos, depois despeje o xileno enquanto segura os slides com uma ponta de pipeta para que eles não caiam.
Despeje mais xileno no mesmo nível de antes e repita a incubação. Despeje o xileno e encha o porta-slides com 100% de etanol, certificando-se de que todo o tecido na lâmina está totalmente submerso. Deixe os slides no etanol por três minutos, depois substitua o etanol por etanol fresco e deixe-os incubar por mais dois minutos.
Despeje o etanol e remova os slides. Coloque-os cuidadosamente de frente para cima em uma toalha de papel limpa e deixe-os secar por 10 minutos. Encha um tubo de polipropileno de uso único de 1,5 mililitro com 80 microliters de tampão de lise e coloque uma ponta de pipeta limpa no tampão.
Identificar tecidos cancerígenos da área tumoral mais adequados para macrodisseção de acordo com a seção manchada de H&E apropriada, em seguida, macrodissto o tecido cancerígeno com base na seção marcada. Pegue uma lâmina de barbear limpa e raspe suavemente o tecido do câncer do slide tentando mantê-lo inteiro. Use a ponta da pipeta para transferir o tecido raspado para o frasco tampão de lise.
Repita este processo com o resto dos slides. Depois de todo o tecido estar no tubo, use a ponta para ter certeza de que o tecido estava totalmente submerso e não está preso à parede. Adicione 20 microliters de uma protease serina relacionada à subtilisina ao frasco e gire suavemente para misturar.
Coloque o frasco em um bloco de calor de 55 graus Celsius por pelo menos quatro horas ou durante a noite, certificando-se de obter um pouco de vórtice após duas horas. Realize o tratamento de bissulfito em 45 microliters do tecido digerido usando um kit de conversão de bisulfato de acordo com as instruções do fabricante. Adicione cinco microliters de tampão de diluição à amostra e incuba-a a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Enquanto isso, prepare o reagente de conversão de bissulfito adicionando 750 microliters de água destilada e 210 microliters de tampão de diluição a um tubo de reagente de conversão ct. Misture os tubos por vórtice por 10 minutos, depois adicione 100 microliters do reagente de conversão ct preparado a cada amostra e misture por inversão. Incubar as amostras no escuro a 50 graus Celsius por 12 a 16 horas.
Após a incubação, coloque as amostras no gelo por 10 minutos. Adicione 400 microliters de tampão de ligação e misture cada amostra por pipetação para cima e para baixo. Carregue cada amostra em uma coluna de spin e coloque a coluna em um tubo de coleta de dois mililitros.
Centrifugar as amostras a toda velocidade por um minuto e descartar o fluxo. Adicione 200 microliters de tampão de lavagem a cada coluna e gire a toda velocidade por um minuto e, em seguida, descarte o fluxo-through. Adicione 200 microliters de tampão de desselgação a cada coluna e deixe as colunas ficarem em temperatura ambiente por 15 minutos.
Após a incubação, gire as colunas a toda velocidade por um minuto e descarte o fluxo. Lave a coluna duas vezes com 200 microliters de centrifugação de tampão de lavagem por um minuto a toda velocidade após cada lavagem. Adicione 46 microliters de água destilada a cada coluna e coloque-a em um novo tubo de polipropileno de uso único de 1,5 mililitro.
Gire os tubos por dois minutos para elutar o DNA e descartar a coluna. O DNA está pronto para a análise. Use o DNA modificado de bisulfato como modelo para PCR específico de metilação quantitativa para avaliar a metilação da região promotora em cada análise genética.
Combine os reagentes conforme descrito no manuscrito do texto e use um instrumento PCR em tempo real de 96 poços para executar o protocolo termociclístico. As características de 48 pacientes com câncer gástrico na coorte de treinamento são mostradas aqui. A idade mediana dos pacientes foi de 74 anos e a coorte incluiu 38 homens e 10 mulheres.
Primeiro, todas as 48 amostras foram carregadas para identificação de outliers. Duas amostras deram picos superiores a dois desvios padrão deslocados dos outros e essas amostras foram removidas. O mapa de calor resultante foi dividido em dois grupos baseados na alta e baixa metilação.
Este mapa de calor permite a visualização das 50 principais sondas dentro de 1.500 pares base do local de início transcricional na análise diferencial de metilação. O tipo de câncer e a presença de metástase do linfonodo emergiram como fatores preditivos independentes significativos quando os fatores patológicos clínicos foram utilizados como covariáveis na análise multivariada. Finalmente, o gene EPB41L3 foi fortemente associado à codificação da coorte de treinamento em grupos de alta e baixa metilação na análise de microarray.
Os resultados da análise de microarray para EPB41L3 na coorte de teste foram validados com PCR específico da metilação quantitativa. Os RMVs de EPB41L3 em tecidos PGC foram significativamente maiores do que os de câncer gástrico remanescente na análise univariada. Da mesma forma, os RMVs em amostras com metástase linfática foram significativamente maiores do que aqueles sem metástase linfática.
Assim, a identificação no tecido de câncer mais adequada para a macrodisseção de acordo com a seção manchada de H&E apropriada é necessária para executar com sucesso este protocolo.
