The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+bisulfite+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine.">Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BSAS permite focado, precisa quantificação metilação do DNA com recursos de alto rendimento, tanto em número de amostras e número de alvos. Adicionalmente, esta biblioteca utilizando geração tagmentation mediada por transposome requer menos ADN de entrada, é mais rápido e contém menos passos do que as técnicas de corte tradicional e adaptador de ligação subsequentes. Estas melhorias sobre os métodos existentes permitem-nível-base de análise de metilação do DNA precisa de qualquer alvo de interesse. Além disso, BSAS proporciona um novo método para a confirmação de regiões de interesse (regiões de metilação diferencialmente (DMRS), ilhas CpG, regiões reguladoras) que foram identificados por meio de todo o genoma bissulfito 22 ou capturar 23 abordagens. Utilizando as abordagens confirmação ortogonais e mais quantitativamente métodos precisos melhora o rigor analítico de estudos epigenômicos. A profundidade de leitura de alta alcançada com BSAS permite a quantificação precisa em um intervalo de confiança estreito, resulta na quantificação exacta 16. Além disso, a capacidade de executar muitas amostras em um único experimento pode aumentar o tamanho da amostra para confirmação de métodos de genomas inteiros, o que irá aumentar o poder estatístico; uma fraqueza de muitos estudos epigenéticos atuais. Importante, BSAS fornece uma quantificação metilação CpG base-específicos, que permite a geração de hipóteses testáveis ​​para pesquisa epigenética. Hipóteses, tais como o aumento da metilação a um elemento de resposta específica irá resultar numa diminuição da ligação de um factor de transcrição específico. BSAS, combinados com os dados de expressão de mRNA emparelhados, proporciona um método para a obtenção de ambos regulação epigenética e a expressão do mRNA dentro de um único pedaço de tecido ou população de células. Medidas pareadas de regulação e expressão também aumentar o rigor científico e impacto dos resultados. As etapas críticas no âmbito do protocolo BSAS incluem design primer, otimização amplicon, e geração de biblioteca /QC. Viés PCR é introduzida se primers não são projetados corretamente e amplificar em diferentes eficiências 8. O uso de padrões de metilação, tal como gerados enzimaticamente 100% e 0% de citosina metilados padrões, pode ser usada para determinar o grau, se houver, de viés metilação quantificação, e é um bom controlo metodológico para quantificar metilação 16. Da mesma forma, o cuidado deve ser tomado quando otimizando reações de PCR para a geração de um único fragmento amplificado de alta qualidade. Se nenhum amplicon está presente utilizando as diretrizes sugeridas detalhadas no protocolo, a passos de otimização incluem aumento do número de ciclos de PCR ou quantidade de entrada bsDNA. Se houver vários produtos de PCR, incluindo dimeros de iniciadores, a passos de otimização incluem diminuir quantidade de entrada bsDNA, diminuindo as concentrações de entrada molares PCR primers, o aumento da temperatura de recozimento, ou diminuindo PCR número ciclo. Um ou uma combinação destes procedimentos de optimização produz resultados suficientes para gerar uma única higamplicão h-qualidade. Alternativamente, redesenhando primers é uma boa abordagem para conjuntos de iniciadores que não produzem um único amplicon. Para as regiões onde redesign não é adequado ou possível, degenerar conjuntos de iniciadores incluindo ambos podem trabalhar de citosina e timina em locais de CpG em primers para a frente e de adenina e guanina em locais de CpG em primers reversos. No entanto, estes conjuntos de iniciadores necessitam ainda de optimização para garantir que não haja PCR polarização está a ocorrer, um processo fora do âmbito deste protocolo. Bibliotecas de qualidade são extremamente importantes para o sucesso. Certifique-se de que as medidas de QC são realizadas para determinar o tamanho, qualidade e quantidade de bibliotecas antes de seqüenciamento. As reacções de sequenciação são propensos a falhas com o contributo das bibliotecas de baixa qualidade. Viés de metilação quantificação pode ser atenuado através da garantia de que as frequências de metilação estão presentes em ambos frente e verso, sequenciamento lê. Além disso, dezenas de bases alinhando aos locais CpG de qualidade deve ser ≥Q30 em alta confidence na quantificação. Enquanto outros têm mostrado anteriormente pouco ou nenhum viés em reações tagmentation de DNA convertido bissulfito 19, garantindo as métricas acima descritas permite a confirmação da baixa quantificação viés metilação. BSAS atualmente mede a metilação em locais CpG, no entanto, futuras expansões deste método permitirá medidas pareadas de CpG 5-HMC com a adição de medidas experimentais, distinguindo entre 5-MC e 5-HMC como a introdução de perrutenato de potássio antes da conversão bissulfito 24. Isto irá aumentar o impacto de utilidade BSAS, permitindo metilação emparelhados, tanto os dados de expressão 5-mC e 5-HMC, e em ordem para determinar a expressão do gene papéis reguladores de metilação do ADN. Preparação biblioteca transposome-mediada de amplicons de PCR não resultam na diminuição da profundidade de sequenciação nas extremidades de regiões amplificadas. Portanto, regiões de grande interesse deve ser projetado para residir no meio de amplicons. Comosempre, porque BSAS gera sequenciamento ler profundidades de&gt; 1.000 X, a precisão quantitativa de 5-MC medições perto das extremidades das regiões amplificadas permanece elevado.

Já faz mais de meio século desde o primeiro relatório de ocorrência natural modificações no DNA na forma de metilação da citosina 1. Metilação da citosina é uma base de citosina nucleótido modificado em que o 5 th de carbono no anel de base tem um grupo metil (5-MC), que ocorre mais frequentemente no motivo dinucleótido CpG em genomas de mamíferos. A presença funcional de 5-mC em promotores de genes está geralmente associada com a repressão transcricional, enquanto que a ausência está associada com a actividade de transcrição 2. Tremendos avanços têm sido feitos em nossa compreensão do papel da metilação do DNA no desenvolvimento 3, propagação transgeracional de perfis epigenéticos 4, a patogênese do câncer de 5,6, e uma série de outras áreas de pesquisa. Muitos desses avanços vieram nos últimos anos, como novas metodologias têm sido desenvolvidas ao perfil de metilação do DNA 7. Com o advento epopularização da próxima geração de técnicas de sequenciamento (NGS) há agora uma série de métodos para o perfil de metilação do DNA através de um genoma inteiro ou grandes regiões do genoma 8. Estas abordagens em aberto a possibilidade de estudos de descoberta que quantificam padrões de metilação de DNA e as diferenças na metilação do DNA. Em adição a estas abordagens hipótese de geração, existe uma necessidade significativa de / ADN alvo testes de hipóteses metilação métodos de quantificação. Pyrosequencing, PCR específica de metilação e sequenciamento Sanger de DNA convertido bissulfito têm sido os métodos mais utilizados para a análise de regiões-alvo (ou seja, uma região promotora de um único gene ou uma ilha CpG) 9-12. Todos estes métodos baseiam-se na conversão de bissulfito, uma reacção química em que a desaminação de citosina não metilados de são convertidos em uracilo de, enquanto citosina metilados de permanecer intacta 13,14. A amplificação por PCR de bisulfite-resultados de ADN convertidas em substituição de uracila de timina com 15 permitindo que a metilação diferencial para ler como uma diferença de base. Embora muito útil, às limitações desses métodos incluem baixa precisão quantitativa, comprimento de leitura curta, e baixo rendimento da amostra. Para lidar com essas limitações, desenvolvemos um método que chamamos Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS) 16. O objectivo deste método é a de ser capaz de analisar regiões genómicas alvo de interesse por um grande número de amostras, com alta precisão quantitativa. BSAS usa elementos de métodos existentes (conversão bissulfito e amplificação PCR específicas da região) e combina-los com simples construção da próxima geração biblioteca (mediada por transposome) 17 e de bancada NGS 18 (Figura 1). Esta abordagem proporciona um método de transferência mais quantitativa e mais elevado para examinar a metilação da citosina em qualquer região de interesse. Aqui apresentamos ométodo em detalhes e descrever abordagens para a resolução de problemas e verificação da qualidade do processo de BSAS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:97px;">Cat #</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 2100 Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G29393AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent RNA 6000 Nano kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon 9200</td>
			<td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt AMPure XP - PCR Purification</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">twin.tech PCR plate 96&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>semi-skirted</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Film</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Foil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Sealer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5390000.024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1-10ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-200ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-1000ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5353000.014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424000.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>24 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>24 indexes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Desktop Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Reagent Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300cycle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProFlex 96-well PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4484075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex 6% TBE DNA gel</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EC6261BOX</td>
			<td>10-well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex TBE Running Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6675</td>
			<td>5X (1 L)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6678</td>
			<td>5X (10 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xcell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
			<td>384well block</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DynaMag-96 Side Skirted</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices/VWR</td>
			<td>89429-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CLC Genomics Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Software for methylation pipeline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAQuick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueLyser II</td>
			<td>Retsch/Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIS hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHG0002-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">384-well Full-Skirted Plate, Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absolute qPCR Seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ DNA Methylation-Lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5030</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZymoTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E2001</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted dna methylation analysis by next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

BSAS lê correctamente alinhado com a sequência de referência convertido será semelhante Figura 5. Dinucleótidos CpG podem ser claramente identificadas e estados de metilação pode ser estimado por observação chamadas de base nos locais de CpG na mapeado lê. Por exemplo, com controles de metilação, 0% de metilação resultará em toda a lê mapeados para locais contendo CpG (Figura 5A) do T. Os controlos 100% de metilação resultará em todo o lê lê mapeados para locais de CpG que contêm de C (Figura 5B). A determinação quantitativa da frequência de citosina (C / C + T) nos locais CpG produz a frequência de metilação na amostra original. Um representante curva padrão gerada a partir de controlos de metilação do genoma inteiro (n = 3 / relação de metilação) mostra linearidade da metilação, bem como a quantificação de precisão na quantificação em cada proporção de metilação (Figura 6). Como um exemplo deste método, no total, RNA e DNA foram co-iso<html> lada do cerebelo e da retina do rato (n = 4 / grupo). Expressão rodopsina, selectivamente expressa em tecido da retina, foi medida utilizando qPCR. A expressão foi detectada apenas em retina (Figura 7A). Usando BSAS, os níveis de metilação de CpG foram quantificados na região do promotor da rodopsina. Níveis de metilação cumulativos em toda a região do promotor foram&gt; 80% no cerebelo em comparação com &lt;15% na retina (p &lt;0,001, t-teste paramétrico) (Figura 7B). BSA benefícios metilação de quantificação de metilação específico do local, e quantificação dos níveis de metilação podem ser comparadas com base na CpG-específica em qualquer dada região genómica. Níveis de metilação de CpG em todo o promotor rodopsina foram significativamente mais elevadas em amostras de cerebelo quando comparado com as amostras de retina (p &lt;0,001, t-teste paramétrico em cada sítio CpG) (Figura 7C). 1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Esquemática do método BSAS Neste método, o ADN genómico é o bissulfito convertido para modificar as citosinas unmethylation para uracilos. Posteriormente, durante a PCR estes uracilos são alterados para timinas. Amplificação PCR está orientado para as regiões de interesse e altamente enriquece por apenas essas sequências. Os amplicons de PCR resultantes são transformados em bibliotecas de dupla indexação por meio de um processo simples tagmentation. Posteriormente, as bibliotecas são sequenciados em um sequenciador de bancada próxima geração eo seqüenciamento leituras são mapeados para o in silico convertido sequência de referência e por cento de metilação da citosina do é determinado de um modo específico-base. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Em silico conversão bissulfito de região de interesse Qualquer região de interesse de qualquer referência genômica pode ser selected para in silico conversão bissulfito. Citosinas não CpG são substituídos com timina da sequência de referência. Citosinas CpG permanecem citosinas na bissulfito convertido referência. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Primers colocação Primer Bisulfite PCR são projetados contra um in silico bissulfito convertido sequência de referência. Primers devem ser concebidos de modo que não se sobreponham dinucleï¿½idos CG ou concebidas ao lado dinucleï¿½idos CG. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> Figura 4: Exemplos de amplicons altas e pobres PCR qualidade e bibliotecas de sequenciamento vestígios electroferograma representativos e show de gel (A) amplicon ideal para a geração de biblioteca mediada por transposome com um único alto.concentração do produto. (B) da biblioteca gerada a partir deste amplicão mostra alta concentração e distribuição uniforme de tamanho. (C) Fraca amplicons de PCR de qualidade pode ser baixo em tamanho, concentração, e contêm vários produtos e / ou dimeros de iniciadores. Estes amplicons de má qualidade vai levar a (D) falhou geração biblioteca com baixa concentração e baixa distribuição de tamanho. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> Figura 5: Exemplos de saídas de sequenciamento de controles de metilação. (A) Em silico convertido sequenciamento de referência com locais CpG destacadas em vermelho. 0% de controle de metilação mapeados lê à região, demonstrando timinas selecionados (realce ganância) de mapeamento em sites CpG. Controle (B) 100% metilação mapeados lê mostrar (no destaque azul) mapeamento da citosina em locais CpG. Figura 6:. A metilação quantificação através de uma série de controlos de metilação controlos de metilação do genoma inteiro misturados em proporções de metilação (n = 3 / razão) entre 0% e 100% foram quantificadas usando BSAS. Traçando quantificação de espera em relação quantificada demonstra linearidade de controle de metilação quantificação. Em todos os controles, houve alta precisão na metilação quantificação. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> Figura 7: Exemplo de metilação do DNA e a expressão do gene análise emparelhado a partir de amostras de tecido. (A) A rodopsina expressão relativa de ARNm a partir do cerebelo de rato e tecido da retina. (B) A rodopsina metilação média promotor quantificada por BSAS entre cerebelo e da retina ADN (*** p &lt;0,001, t-teste paramétrico). &lt;strong&gt; níveis de metilação C) específicas do local CpG em todo promotor rodopsina (-244 a 6, em relação ao local de início da transcrição [TSS]) no cerebelo mouse e DNA retina.

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Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

targeted-dna-methylation-analysis-by-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K visualizações.  University of Oklahoma College of Medicine. Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.