Este trabalho foi financiado pela NSF CARREIRA CBET-0747615. Os autores gostariam de agradecer as Dras. Douglas H. Smith e David F. Meaney por sua orientação e apoio.

1. Visão Geral do Sistema biorreator Axon Estique Crescimento <ol><li> Duas abordagens predominantes têm sido utilizadas para aplicar forças experimental para os neurônios. Na primeira abordagem, as forças são aplicadas ao neurônio inteiro (Lu, Franze et al 2006;. Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010). Na segunda abordagem, as forças são aplicadas diretamente para o axônio, puxando o cone de crescimento. Utilizando agulhas de vidro, esta última abordagem tem sido utilizada para a formação de novos modelo axônio (Bernal, Pullarkat et al 2007;. O&#39;Toole, Lamoureux et al 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al 2010), para identificar limiares vigor para alongamento e retração (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992), e analisar agrupamento neurotransmissor nos terminais do axônio (Siechen, Yang et al 2009).. Uma extensão de engenharia de tecido exclusivo deste método foi desenvolvido para produzir grande nervo constrói através de um estiramento Crescimento Axon automatizado (ASG), sistema de biorreatores (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Recentemente, desenvolvemos uma versão em miniatura do sistema de biorreator para estudar ASG microscopicamente em tempo real (Loverde, Ozoka et al. 2011). Aqui, detalhes do protocolo de 9 dias (tabela 1) que usamos atualmente para preparar e executar biorreatores ASG rotineiramente. </li><li> Operação global: O sistema de biorreator ASG é composto por três componentes principais: 1) uma câmara de biorreator com faixas independentes (poços alongada), onde os neurônios são cultivados e esticado, 2) uma tabela de movimento linear automatizado para aplicar forças de alongamento e 3) um motor passo unidade de controlador com software para controlar o crescimento stretch (figura 1). </li><li> Resumidamente, fabricação de protótipos biorreator foi realizada em uma loja de máquina utilizando uma fresadora vertical (Bridgeport, Elmira, NY). Para a biocompatibilidade, a facilidade de esterilização e durabilidade, o biorreator componentes internos foram usinadas a partir de 08/03 polieter &quot;(PEEK). Policarbonato transparente foi utilizada para tampas para permitir a microscopia de luz e de visão de culturas. Resistente à corrosão 316 parafusos de aço inoxidável e hardware completo a montagem (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> A câmara de biorreator é composto de uma estrutura de alongamento que faz três pistas, um bloco ajustável de reboque que manipula células em toda a faixa, e projetando-se varas de reboque para manipulação externa (figura 2). Culturas de neurônios são banhados em descartáveis ​​Aclar substratos cultura reboque apoiado pelo bloco de reboque (figuras 2 e 3). Um substrato lamela descartáveis ​​estacionária atribui à parte inferior do quadro que se estende e abrange todas as três pistas. Antes do alongamento, os neurônios banhado devem estender os processos axonal a partir do substrato de reboque sobre o substrato estacionária via extensão cone de crescimento. A população de axônios que ponte os substratos sofram posteriormente esticar pelo deslocamento do bloco de controle de reboque. </li><li> A tabela de movimento automatizado linear consiste de um motor de passo (HT23-397, Produtos de Movimento Aplicada, Watsonville, CA) e mesa de movimento linear (MIPS-2-10-1.0mm, Sistemas Servo, Monteville, NJ) montado em uma mesa de alinhamento delrin . A câmara de biorreator está sentado dentro da tabela paralela à mesa de movimento linear. As hastes de reboque que se estende desde a câmara de biorreator são fixados na tabela de movimento linear usando um adaptador. </li><li> A etapa motor de acionamento do controlador (Si 2035, Produtos de Movimento Aplicada) é programado usando o software incluído Si programador para controlar a manipulação dos substratos de reboque. Estiramento axonal é aplicada de forma gradual, tomando uma série de passos pequeno deslocamento espaçadas por tempos de permanência (Pfister, Iwata et al 2004;.. Pfister, Iwata et al 2006). Este sistema controlado por computador fornece a capacidade de programar perfis personalizados para ASG, e é essencial para a experimentação contínua durante vários dias ou semanas. </li></ol> 2. Preparação de biorreator Câmara <ol><li> Preparar os substratos de cultura descartável de reboque e fixos para a cultura neuronal: <ol><li> Substratos cultura reboque são cortadas de 8,5 &quot;x 11&quot; folhas de filme Aclar (33C 2,0 mil, Probe Estrutura, West Chester, PA). Utilizando uma lâmina afiada cortar os substratos de aproximadamente 0,5 x 2,5 cm, ou ligeiramente menor que a largura das vias para permitir que pelo menos 1-2mm clearance de ambos os lados. </li><li> Lixe levemente inferior º 03/01 dos substratos cultura de reboque em ambos os lados com uma lixa 1200-grão fino (McMaster Carr). Lixamento dos substratos de reboque facilita o crescimento de axônios das substratos reboque sobre o substrato lamela estacionário. </li><li> Corte a 5 x 7cm pedaço de Aclar ou usar um No. lamela de vidro uma para servir de substrato estacionária (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). </li><li> ª limpasubstratos cultura e com uma solução diluída Alconox e enxaguar bem com purificada dH 2 O. </li><li> Esterilizar os substratos cultura por imersão em etanol 70% por 30 minutos. Permitir que os substratos para o ar seco dentro de um capuz estéreis de cultura de tecidos. </li></ol></li><li> Limpar a câmara de biorreator com Alconox diluir e autoclave esterilizar dentro de um recipiente de autoclave. Imediatamente após a autoclavagem, a transferência para um capuz estéril e deixar secar ao ar. </li><li> Continuando dentro do capô estéril cola, os substratos de cultura para o biorreator utilizando Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) e ponta de algodão estéril swabs (McMaster Carr): <ol><li> Com as pernas bloco de reboque na posição ereta plena, cola os substratos cultura de reboque para as pernas bloco de reboque na parte não-lixada. Evitar o contacto com a superfície lixada cultura. </li><li> Cola o substrato de cultura estacionária para o fundo da câmara biorreator. </li><li> Retire o excesso de cola e bolsas de ar delicadamente deprimente um cotonete seco contra os substratos colados. </li><li> Desde Silicone ácido acético leaches RTV que é tóxico para os neurônios, o biorreator é deixada para secar sob luz UV dentro do capô para 2 dias inteiros antes de introduzir culturas neuronal. </li></ol></li><li> Inferior das pernas bloco de reboque para conseguir uma sobreposição de 2-3mm entre as pontas dos lixado reboque substratos e no substrato estacionário. Crucial atenção deve ser dada para o tamanho da sobreposição, se ele for muito grande, as pontas dos substratos de reboque pode desviar de substrato estacionário, reduzindo o número de axônios que se estendem a sobreposição (figura 3). </li><li> Posição do bloco de reboque na posição inicial, com as hastes de reboque recolhido dentro do biorreator. Aperte os parafusos de imobilização para evitar o movimento das hastes de reboque antes de esticar o crescimento. </li></ol> 3. Culturas neuronal <ol><li> 1mL piscina de 10 mcg / mL de alto peso molecular poli-d-lisina (cat # 354210, BD, Bedford, MA) no soro livre de mídia na área de interface substrato de cada pista. Permitir que a solução para aderir sem ser perturbado por uma hora em temperatura ambiente. Lave delicadamente 3x com dH 2 O, seguido de um enxágüe final com meios de cultura. Pipetagem deve ser feita na parte de trás das pistas, o mais distante da interface substrato. </li><li> Isolar explantes da raiz dorsal Gânglios (DRGs) de um rato E16 filhote. Usando um microscópio estereoscópico, diluir os explantes em gotas utilizando placas de Petri. Coletar explantes 04/03 utilizando uma pipeta de 100 L e placa na borda do substrato cultura lixado reboque. Cuidados devem ser tomados para a placa de explantes na borda do substrato de reboque utilizando uma pequena poça de mídia. Até 1 ml de meio de cultura por pista é suficiente para evitar a evaporação por várias horas, limitando o movimento dos explantes. Formulação de mídia: Neurobasal com B-27 + 0,5 mM L-Glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-glicose (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) e 20 mM FDU + inibidores Uridina 20 mM de mitose (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Anexar a tampa e transferir o biorreator para uma incubadora por 1 hora ou até que as células aderem. </li><li> Preencher o biorreator com meios de cultura no ponto mais distante explantes para evitar deslocamento. Incubar o biorreator para um mínimo de 5 dias, enquanto neurônios estender os processos axonal sobre o substrato estacionário. </li></ol> 4. Axon Crescimento Estique <ol><li> O biorreator sofre procedimentos de preparação final dentro de um capuz estéril: <ol><li> Preencha reservatórios dentro do biorreator com tampão fosfato salina para umedecer a câmara e evaporação limite de meios de cultura. No nosso sistema, as paredes recinto escavado servem como reservatórios. Alternativamente, tampas pequeno prato de Petri podem ser colocados em cada lado do bloco de reboque em cima das pistas cultura. </li><li> Substituir os meios de cultura e ocupam as ruas de capacidade. Pipetagem deve ser feita na parte de trás das pistas, o mais distante da interface substrato. </li></ol></li><li> Banco do biorreator dentro da tabela de movimentos automatizados linear. Se o experimento for executado dentro de uma incubadora, não deve ser umidificado devido ao potencial de corrosão da tabela de movimentos automatizados linear. </li><li> Aperte o adaptador da haste de reboque para as varas de reboque. </li><li> Si usando software programador jog o palco da tabela de movimento linear para se alinhar com o adaptador da haste de reboque e fixá-la ao palco. Por conveniência, prepare seqüências Programador Si com antecedência, a fim de manipular o estágio em incrementos específicos. </li><li> Solte os parafusos de imobilização na câmara de biorreator para permitir a livre circulação do bloco de reboque. </li><li> Estiramento é aplicada de forma gradual, iniciando uma série de passos pequeno deslocamento espaçadas por tempos de permanência (Pfister, Iwata et al. 2006). Nosso paradigma começa por tomar 2 passos mM cada 172 segundo,resultando em um trecho de um milímetro net durante 24 horas. Depois de um dia, a taxa de alongamento pode ser ramped, aumentando ou diminuindo o deslocamento do tempo de permanência (tabela 2). </li><li> Uma vez ASG é iniciada, as mudanças de mídia geralmente não são necessários. Ao longo do tempo, no entanto, meios de cultura em geral gira ácida e é evidente por uma mudança de cor amarelada. Se a experimentação é necessária mais, a velha mídia nunca é totalmente drenado, mas apenas parcialmente alterada, a fim de minimizar o trauma de axônios flutuante. </li></ol> 5. Resultados representativos: Processos axonal pode sofrer estiramento crescimento notavelmente rápido e robusto. Inicialmente, o processo começa com um período de alongamento lento (≤ 1mm/day), que consiste de pequenos deslocamentos freqüentes. Nas primeiras 24 horas de alongamento, Mecanotransdução de vias de crescimento neuronal ocorre, segundo o qual os neurônios começam Além do cilindro de axônio. No prazo de 24 horas de ASG contínua, os axônios mostram uma crescente tolerância em relação a deslocamentos maiores e mais freqüentes. Em geral, os axônios podem suportar um aumento na taxa de trecho da 1mm/day cada 12-24 horas (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Aumento da taxa de estiramento muito cedo, no entanto, pode levar a um crescimento mais rápido dos axônios selecionar, mas também levar a oclusão patológica que causa a desconexão. Trecho de crescimento axônios têm a tendência para formar pacotes, assemelhando-se a arquitetura dos fascículos. Utilizando protocolos atuais, a central, parte estiramento cresceu de feixes de axônios não têm aderências ao substrato de cultura. Somente o inicialmente aderido, segmentos proximal e distal do trecho de crescimento axônios permanecer solidários com os substratos cultura. Assim, a porção central do trecho axônios cresceu flutuar livremente, e são sensíveis a interrupção devido ao manuseio. Para uma variedade de razões, algumas axônios não pode crescer à taxa estiramento aplicada. Por exemplo, um neurônio DRG com dois processos axonal, sendo que ambos estão passando por trecho, pode não ser capaz de traduzir proteínas suficientes e crescer ao ritmo estiramento aplicada. Axônios que não pode acomodar o trecho será aplicada fina seguinte efeito de Poisson. Trecho subsequente vai levar a oclusão dos axônios, montagem inibindo, levando a desconexão patológica. A maioria dos axônios, no entanto, são capazes de sofrer ASG com sucesso e apenas uma pequena percentagem de axônios submeter a esse processo de poda-like. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" /> Figura 1. Esticar Axon sistema biorreator Crescimento. (A) da câmara cultura biorreator e mesa de movimento automatizado linear, (B) Passo motor de acionamento do controlador e software de programação Si. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" /> Figura 2. Chamber Cultura biorreator. Este cartoon retrata a câmara de biorreator de cima com a tampa removida. A posição do bloco de reboque reflete o estágio final do axônio crescimento estiramento. Estiramento axônios crescido pode ser visto em feixes dentro da pistas cultura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" /> Figura 3. Cultura da Interface Plating substrato. Este cartoon retrata os componentes do mecanismo de reboque dentro de cada faixa do biorreator de visão lateral. (Top) sobreposição correta dos substratos cultura de reboque e estacionários. (Bottom) se sobrepõem excessivo dos substratos de reboque e estacionária faz com que a ponta do substrato de reboque para enrolar. Filme 1. Penhora de Substratos Cultura para biorreator Câmara. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Clique aqui para assistir ao vídeo</a> Filme 2. Plating de DRG explantes sobre substratos de reboque. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Clique aqui para assistir ao vídeo</a> Filme 3. SiProgrammer uso. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Clique aqui para assistir ao vídeo</a> Movie 4. Extensão Crescimento Cone em Substrato estacionária. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Clique aqui para assistir ao vídeo</a> Filme 5. Axon Crescimento Stretch. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Clique aqui para assistir ao vídeo</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Dia </td><td> Passo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Esterilização e Secagem </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Colagem e Montagem </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Coatings &amp; Plating Cultura Neuronal</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Iniciar Crescimento estiramento </td></tr></tbody></table> Tabela Schedule Experimento 1.. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Tempo [hr] </td><td> Taxa de esticar [mm / dia] </td><td> Dwell Time [s] </td><td> Comprimento total [mm] </td><td> Tempo estiramento total [dias] </td></tr><tr><td> Pretensão </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Trecho </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Trecho </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Trecho </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Trecho </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Trecho </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Schedule Taxa de Stretch. Todas as etapas do estiramento são 2 m em deslocamento (10 passos motor de passo = estiramento M 2).

<ol>
	<li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+axons.">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li><li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons.">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li><li>Dennerll, T. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons:+continuous+mechanical+tension.">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+The+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li><li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation.">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li></ol>

O alongamento ex-vivo de células neuronais mecânica é patenteado sob Patentes dos EUA # 6264944 e # 7429267.

Dois passos críticos devem ser observados durante a preparação de biorreatores. Primeiro, uma sobreposição ótima na interface substrato é necessária para garantir que os axônios podem cruzar sobre o substrato estacionário. Aclar que é excessivamente onduladas ou imperfeitos não deve ser utilizado (figura 3). Para otimizar a sobreposição, confirme que o substrato de reboque é lixada uniformemente e em contato com o substrato parado uniformemente sobre uma área de contato 2-3mm de comprimento. A sobreposição deve ser otimizado antes de cada experiência com cuidado de ajustar a altura das pernas de reboque. Segundo, enquanto que prevê fixação de neurônios, revestimentos substrato sustentar consideráveis ​​forças sheering causada pelo deslocamento da tensão biorreator e contráteis dos axônios (Heidemann e Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). Substratos deve ser lavada cuidadosamente com água esterilizada antes e após o revestimento de lisina. Revestimentos devem ser aplicados a partir de alíquotas recém-descongelado e espalhar mais uniformemente possível. Importante, os substratos não deve ser movido ou perturbado durante o período de adesão. Nas etapas subseqüentes, evitar o contato com os substratos durante a galvanização, e pipeta todas as soluções a partir da extremidade mais distante das pistas de distância da interface substrato. Tolerâncias nas conexões de cada componente biorreator pode se manifestar na forma de folga. Durante o período inicial de ASG, folga no sistema é evidente como o movimento da tabela de movimento automatizado linear ocorre sem movimento do bloco de reboque. Slack pode variar por experiência, mas é tipicamente &lt;1 mm em nossa experiência. Por esta razão, uma &quot;tensão pré-&quot; fase de eliminação de folga 1mm/day, por um dia, precede o cronograma ASG durante o qual as partes biorreator envolver e começar o movimento dos substratos de reboque. Solução de problemas pode ser necessário se a etapa de deslocamento da tabela de movimento linear automatizado não coincide com o deslocamento do bloco de reboque após a fase de pré-tensão é completa. Assíncrona, deslocamentos imprecisa do bloco de reboque estão associados com &#39;stiction &quot;ou atrito estático dentro do hardware de reboque e flexão do adaptador. Para evitar esses problemas ocorram, o movimento do bloco de reboque deve ser verificado com a mão, depois da montagem, para o movimento quase sem esforço suave. Se ligação ocorre, o conjunto de reboque deve ser liberado antes da experimentação. Rigidez suficiente de que o adaptador é necessário também assegurar precisos, deslocamentos síncrona não são superados por stiction do hardware de reboque.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do componente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Poliéter (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Feitos biorreator câmara </td></tr><tr><td> Policarbonato </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Feitos biorreator tampa do compartimento </td></tr><tr><td> Motor de passo </td><td> Produtos de movimento aplicado, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Tabela de movimento linear </td><td> Sistemas Servo, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1,0 milímetros </td><td></td></tr><tr><td> Passo controlador de acionamento do motor </td><td> Produtos de movimento aplicado, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Estrutura Probe Inc., West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Reboque cultura substratos </td></tr><tr><td> No. 1 lamela </td><td> Brain Research Labs, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Substrato de cultura estacionária </td></tr><tr><td> Silicone RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Cotonetes </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduction of neuronal growth

Durante a pré-sináptica desenvolvimento embrionário, os processos neuronais percorrer curtas distâncias para alcançar os seus objectivos através de cone de crescimento. Com o tempo, somata neuronal são separados de seus terminais de axônios devido ao crescimento esquelético do organismo ampliação (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al 1992). Este Mecanotransdução induz a um modo secundário de crescimento neuronal capaz de acomodar alongamento contínuo do axônio (Bray, 1984; Heidemann e Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al 1995;. Pfister, Iwata et al 2004).. Axon Crescimento Stretch (ASG) é possivelmente um fator central na maturação de curto processos embrionárias nos nervos longos e tratos de substância branca característica do sistema nervoso adulto. Para estudar ASG in vitro, nós engenharia biorreatores para aplicar tensão aos processos de curto axonal de culturas neuronal (Loverde, Ozoka et al. 2011). Aqui, detalhe que os métodos que usamos para preparar biorreatores e conduta ASG. Em primeiro lugar, dentro de cada faixa que se estende do biorreator, os neurônios são banhados em cima de um substrato micro-manipulada de reboque. Em seguida, regenerar neurônios seus processos axonal, via extensão cone de crescimento, em um substrato estacionário. Finalmente, o crescimento do estiramento é realizado por reboque os corpos celulares banhados a distância dos terminais do axônio aderida ao substrato estacionária; recapitulando o crescimento do esqueleto após o alargamento do cone de crescimento. Os trabalhos anteriores mostraram que a ASG de embriões de ratos neurônios dos gânglios da raiz dorsal são capazes de as taxas de crescimento sem precedentes até 10mm/day, alcançando comprimentos de até 10 centímetros, enquanto que ao mesmo tempo, resultando em maior diâmetro axonal (Smith, Wolf et al 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Isto está em contraste dramático com extensão regenerativa crescimento cone (na ausência de estímulos mecânicos), onde as taxas de crescimento 1mm/day média com a regeneração de sucesso limitado a comprimentos de menos de 3cm (Fu e Gordon, 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). Assim, um estudo mais aprofundado da ASG pode ajudar a revelar os mecanismos de crescimento desregulado que limitam a regeneração, na ausência de estímulos mecânicos.

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Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Um método de engenharia de tecido exclusivo foi desenvolvido para alongar as fibras nervosas numerosos na cultura recapitulando crescimento estiramento do axônio, uma forma de crescimento do sistema nervoso através do qual os nervos alongados em conjunto com o crescimento do corpo aumentando.

Axon Crescimento Stretch: O Mecanotransdução do Crescimento Neuronal

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K visualizações.  New Jersey Institute of Technology. Um método de engenharia de tecido exclusivo foi desenvolvido para alongar as fibras nervosas numerosos na cultura recapitulando crescimento estiramento do axônio, uma forma de crescimento do sistema nervoso através do qual os nervos alongados em conjunto com o crescimento do corpo aumentando.

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Síntese Nanostar ouro com um método de crescimento de sementes de Prata Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Bioengenharia

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodologia Elastografia por Ressonância Magnética para a Avaliação de engenharia de tecidos Crescimento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis para dissociar os efeitos de Mecanotransdução Sugestões

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Electrospinning Fator de Crescimento Releasing Microesferas em fibrosa Andaimes

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Estudando a estequiometria do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico em células intactas utilizando Microscopia Correlativo

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Projetar filmes de silício poroso como portadores do fator de crescimento do nervo

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and multidirectional shear stresses have all been postulated to stimulate a pro-atherosclerotic phenotype in endothelial cells, whereas high magnitude and unidirectional or uniaxial shear are thought to promote endothelial homeostasis. These hypotheses require further investigation, but traditional in vitro techniques have limitations, and are particularly poor at imposing multidirectional shear stresses on cells. 
One method that is gaining increasing use is to culture endothelial cells in standard multi-well plates on the platform of an orbital shaker; in this simple, low-cost, high-throughput and chronic method, the swirling medium produces different patterns and magnitudes of shear, including multidirectional shear, in different parts of the well. However, it has a significant limitation: cells in one region, exposed to one type of flow, may release mediators into the medium that affect cells in other parts of the well, exposed to different flows, hence distorting the apparent relation between flow and phenotype. 
Here we present an easy and affordable modification of the method that allows cells to be exposed only to specific shear stress characteristics. Cell seeding is restricted to a defined region of the well by coating the region of interest with fibronectin, followed by passivation using passivating solution. Subsequently, the plates can be swirled on the shaker, resulting in exposure of cells to well-defined shear profiles such as low magnitude multidirectional shear or high magnitude uniaxial shear, depending on their location. As before, the use of standard cell-culture plasticware allows straightforward further analysis of the cells. The modification has already allowed the demonstration of soluble mediators, released from endothelium under defined shear stress characteristics, that affect cells located elsewhere in the well.

This protocol describes a coating method to restrict endothelial cell growth to a specific region of a 6-well plate for shear stress application using the orbital shaker model.

Segmentando o crescimento de células endoteliais em placas de 6-bem em um agitador orbital para estudos mecanobiológicos

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...