Esta pesquisa foi apoiada pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG sob o número concessão FO 315/4-1 e SFB DFG 688.

1. Isolation of Brain microvasos <ol><li> Para cada preparação utilizar 5-10 ratinhos neonatais de ambos os sexos (3-5 dias de idade). </li><li> Euthanize um rato de acordo com locais IACUC / veterinário recomendações, remover o cérebro imediatamente, e transferir para um prato de Petri contendo a solução seguinte: 15 mM de Hepes (pH 7,4), 153 mM de NaCl, 5,6 mM de KCl, 2,3 mM CaCl 2 x 2H 2 O, 2,6 mM MgCl 2 x 6H 2 O, 1% (w / v) BSA (daqui em diante referido como tampão A). </li><li> Salvo indicação em contrário, todos os procedimentos de isolamento deve ser efectuado à temperatura ambiente (RT) (22-24 ° C), sob a câmara de fluxo laminar. Cortar o cérebro (cérebro sem cerebelo e tronco cerebral), após remoção das meninges e fragmentos capilares, em tampão A, utilizando um bisturi esterilizado. Pipetar o tecido fragmenta cima e para baixo usando uma pipeta de 10 ml até não aglomerados aparecer. Transferir a suspensão para um tubo Falcon de 50 ml e centrifugar a 250 xg durante 5 min à TA. </li></ol> Nota: Meninges pode ser identificado como membranas finas, transparentes na superfície do tecido cerebral. Eles podem ser removidos cuidadosamente com uma pinça estéril. <ol start="4"><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Dissolve-se o sedimento em 4,5 ml de tampão A com 1,5 ml de 0,75% (w / v) de colagenase / dispase (Roche) e incubar durante 45 min a 37 ° C num banho de água (ocasionalmente agitação). </li><li> Ao mesmo tempo, preparar as placas de 12 poços por revestimento de quatro poços com colagénio IV (0,1 mg / ml dissolvido em 50 mM de ácido acético). Deixa-se aderir durante 1 hora. </li><li> Parar a digestão através da adição de 15 ml de tampão gelado A. Ressuspender o pellet cuidadosamente. </li><li> Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 10 min a RT. </li><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Para remover a mielina, adicionam-se 10 ml de 25% (w / v) de BSA (Sigma, pureza&gt; 98%) e centrifuga-se a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. 25% de BSA deve ser dissolvido em 1x PBS (PAA Laboratories) e filtrada através de 0,2 f ^ Milter). </li><li> Cuidadosamente descarte do sobrenadante, dissolve-se o sedimento em 10 mL de tampão A e transferir para um tubo Falcon novo. </li><li> Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 5 min à TA. O sedimento resultante contém as células endoteliais. </li><li> Lavar duas vezes o colagénio IV revestido placa de 12 poços com PBS. </li><li> Ressuspender o sedimento em 4 ml de meio de crescimento (DMEM contendo FCS a 10%, 50U/ml de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina) e de placa de suspensão celular em dois poços, 2 ml em cada poço. Adicionar a puromicina a uma concentração final de 4 | ig / ml e incubar durante 45 min a 37 ° C numa incubadora de cultura de células. Este passo permite a remoção de células aderentes rapidamente Nota:. Puromicina é adicionado, durante 24 horas. Apenas o cérebro ECs podem metabolizá-la, para outros tipos de células puromicina é tóxico 14. </li><li> Transferir o meio de 2 ml, contendo células não aderentes a partir da etapa 1,14 em dois poços frescas (estes poços contêm a fracção CE). Encher os poços com células aderidas de step 1,14 com 2 ml de meio fresco (estes poços conter outros tipos de células, por exemplo, f ibroblastos, astrócitos e podem ser cultivadas em paralelo e utilizado para comparação da morfologia). </li><li> Alterar o meio no dia seguinte. </li></ol> 2. Imortalizando o cérebro células endoteliais microvasculares <ol><li> Cultivar a GP + E-86 (Neo GPENeo) 15 fibroblastos, que segregam um vírus deficiente em replicação com polioma oncogene T em meio DMEM contendo 10% de FCS inactivado pelo calor, 50U/ml de penicilina / estreptomicina e 2 mg / ml de G418 ( . PAA Laboratories) em frascos revestidos de gelatina Nota: Polyoma meio de transfecção oncogene T faz com vantagem o crescimento de células endoteliais sobre os não-CEs que conduz a uma monocamada homogénea de células com morfologia endotelial 4 a 6 semanas de cultura. GPENeo não estão disponíveis comercialmente e pode ser obtido como material público compartilhado (consulte publicações originais 4,16). </li><li> Para usar o meio contendo vírus para<html> imortalização, cultivar as células GPENeo em meio isento de G418 por 24 h. </li><li> Remover 10 ml do sobrenadante e adicionar GPEneo Polybrene (brometo Hexadimetrina) (Sigma) a uma concentração final de 8 mg / ml, esterilizar por filtro de 0,45 um para remover os fragmentos celulares. </li><li> Remover o meio de crescimento das culturas da CE preparados na Parte 1 e juntar 2 ml de sobrenadante GPEneo mistura / Polybrene nas cavidades. Repetir no dia seguinte utilizando um fresco GPEneo mistura sobrenadante / Polybrene Nota:. Polybrene é usado para fazer os poros na parede da célula para facilitar a infecção com as partículas virais). </li><li> Remover o sobrenadante GPEneo mistura / Polybrene no dia seguinte, lava-se as células duas vezes com PBS e manter as células em meio de crescimento em mudança a cada 3 dias. Após confluência, as células divididas 1:2 no colagénio IV placas revestidas. </li><li> Tipicamente, estáveis ​​endoteliais cerebrais linhas (CEND) células devem ser obtidas 4-5 semanas mais tarde. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Cultivando as células cerebrais microvasculares endoteliais <ol><li> Descongelar as células de cryoaliquot em banho de água e transfere-se 15 ml-Falcon com 10 ml de meio de pré-aquecido. </li><li> Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 5 min à TA. </li><li> Remover meio, transferir o sedimento em a revestido de colagénio IV T 25 cm2 frasco de cultura de células pré-aquecida com meio de crescimento (densidade celular para revestimento deve ser de pelo menos 1 x 10 4 células / ml). </li><li> Alterar meio no dia seguinte e depois de as células alcançaram a confluência (normalmente após 5 dias) dividir as células. </li></ol> 4. A divisão de células-CEND (Nota: A divisão deve ser feita apenas uma vez por semana, evitar a divisão Superior 1:4). <ol><li> Remover meio, lavar as células com PBS. </li><li> Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA aquecido solução (PAA Laboratories) (T 75 cm2 do frasco), incubar a 37 ° C e esperar até que as células da camada é dispersa (geralmente dentro de 5 a 15 min). </li><li> Adicionar 5 ml omeio de crescimento f, pipetar cima e para baixo, e transferir para um novo colágeno IV revestido frasco. </li></ol> 5. A congelação das células CEND <ol><li> Obter a suspensão de células, tal como descrito no passo 4 </li><li> Centrifugar a suspensão a 250 xg durante 5 min à TA. </li><li> Ressuspender o sedimento de células (obtidas a partir de 1 75 centímetros T 2 frasco) em 6 ml de meio de congelação (95% de meio de crescimento, 5% DMSO). </li><li> Dividir a suspensão de células em 1,5 ml de quatro crio-se alíquotas Nota:. Uma alíquota de crio-podem ser semeadas no frasco T 25 cm 2. </li><li> Armazenar os crio-alíquotas sob vapor de nitrogênio líquido a temperatura. </li></ol> CEND meio de crescimento: 450 ml de DMEM, FCS a 10%, 10 ml de L-glutamina, 2% de MEM-Kit, 2% de NEAA, 10 piruvato natrium ml, 50 U / ml de penicilina / estreptomicina 6. Resultados representativos As células CEND cerebEND e foram caracterizados por imunomarcações de um endotelialnd BBB marcadores, bem como por meio de medições de resistência eléctrica transendotelial (TEER) e permeabilidade. O CEND cerebEND e tinha uma morfologia semelhante à de culturas primárias de cérebro ECs, com as monocamadas de células compactadas alongadas que exibiram inibição de crescimento a confluência. As células expressaram níveis detectáveis ​​de bem claudina-5 occludin e VE-caderina proteínas que estavam localizados nas junções célula-célula, como se mostra por meio de imunofluorescência (Figura 3) 4,5. A cultura de células em soro CEND reduzida meio conduziu a um aumento na TEER (de 150 Ωcm 2 na presença de 10% de soro a 500 Ωcm 2 na presença de 2% de soro), que foi potenciada pela adição de hidrocortisona (800 Ωcm 2), ou a insulina (1.000 Ωcm 2) 4. As monocamadas de CEND cultivadas em soro reduzido, médio, durante 21 dias teve TEER de 900 Ωcm 2 (Figura 4). TEER foi medida utilizando um conjuntocontendo eletrodos atual passes e tensão de medição (Instrumentos de Precisão mundo). Para comparação, o primário microvascular cerebral ECs tem sido relatada a ter valores de TEER 200-600 Ωcm 2 e uma linha celular de ratinho comercialmente disponíveis bEnd.3 tinham valores de TEER 100-140 Ωcm 2 (para revisão recente veja Abbot 2005 e Toth et al., 2011 17,18). Além disso, a passagem de macromoléculas, tais como a não-carregada de FITC-dextrano de massas moleculares 4, 10, 70 e 500 kDa, ou de fluoresceína (300 Da) através da monocamada de CEND em meio de 2% de FCS a diferenciação ao longo de 4 horas foi reduzida em comparação com as células de controlo mantidas em meio de crescimento contendo FCS a 10%: fluxo paracelular foi reduzida para 30% das células de controlo para a fluoresceína, a 26% para FITC-dextrano 10 e 70 kDa, e de fluxo foi reduzido para 4,5% de células de controlo de FITC -dextrtan 500 kDa. Semelhante a TEER valores, a permeabilidade era no nível mais baixo, em que as células cultivadas na presença de glicocorticoids 4 (GC). Em outros estudos, identificamos os genes alvo de glicocorticóides, occludin, claudina-5 e VE-caderina no endotélio vascular cerebral 4,7,9. GC tratamento conduziu a um aumento na expressão destas proteínas e para o rearranjo de VE-caderina com o citoesqueleto. O regulamento GC-mediada direta da junção apertada proteínas occludin e claudina-5 aparece através de elementos de resposta GC em suas regiões promotoras 4,7,19. Além disso, claudina-5 foi identificado como um alvo em estrogénio novel vascular endotélio 10. Endoteliais subjacente disfunção muitas doenças diferentes. Nós cultivadas sob o CEND oxigênio / glicose privação (POG) condições. OGD levou à interrupção da função BBB, o que pode ser reconstituído após o tratamento combinado com o inibidor de proteassoma GC e bortezomib 12. OGD condições levou a um forte aumento da captação de glicose e na expressão de Transpor glucoseters em cerebEND, que pode ser atenuado pela adição de MK801, um inibidor não competitivo de NMDA do receptor-13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Figura 1. Morfologia das células endoteliais microvasculares cerebrais (CEND) uma semana após o isolamento. Imagens de microscopia de luz foram tomadas sob a 6x (A) e 15x de ampliação (B). As colónias formadas ilha de células endoteliais são visíveis. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Figura 2. Morfologia do cérebro células endoteliais microvasculares (CEND) um mês após o isolamento e imortalização. Imagens de microscopia de luz foram tomadas sob a ampliação 15x. A confluentes, monocamada de células endoteliais homogénea pode ser observado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Figura 3. Microvascul cérebro imortalizadoar as células endoteliais expressam claudina-5, occludin e VE-caderina. CEND células foram cultivadas em colagénio IV revestidos lamelas e coradas com anticorpos contra claudina-5 (A), occludin (B) e VE-caderina (C). As imagens foram feitas usando um microscópio Zeiss Axioscop2 sob a ampliação 40x. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Figura 4. Medição da resistência eléctrica transendotelial (TEER) das CEND monocamada. CEND foram cultivadas em filtros de colagénio IV revestidos Transwell (tamanho de poro de 0,4 um). Depois de atingir a confluência, as células foram mantidas em meio contendo FCS a 2%. TEER foi medido após 7, 14 e 21 dias por meio de um conjunto que contém os eléctrodos de corrente e de tensão de passagem de medição.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O processo descrito pode ser utilizado para o isolamento de microvascular CEs a partir de diferentes estirpes de ratinho, bem como a partir de diferentes estirpes de ratinho knock-out para estudar as alterações específicas na função do endotélio vascular. Como um método de imortalização utilizou-se a transformação com oncoproteína de poliomavírus murino, Polioma meio antigénio T. Ele transforma rapidamente imaturos células endoteliais in vivo e in vitro 20,21,22. Outros métodos de imortalização das células endoteliais descritos na literatura incluem, por exemplo, a imortalização com antigénio T grande de SV40 do Simian Virus vacuolar 40 23, o produto do gene E1A do adenovírus 24 ou sobre-expressão da subunidade catalítica da telomerase humana 3. A imortalização com PymT é específico para a ECs murino imaturo, que permite a obtenção de uma cultura CE homogénea a partir de ratinhos neonatais em curto espaço de tempo. Imortalização altera as propriedades das células e poos resultados obtidos com os e linhas celulares imortalizadas, deve ser comparada com as células primárias ou com as experiências in vivo com ratinhos. PymT CE imortalizada foi descrito para expressar níveis elevados de actividade fibrinolítica resultantes de aumento da produção de activador do plasminogénio tipo urocinase-e diminuição da produção de activador do plasminogénio inibidores 25. A comparação directa de PymT bEND5 linha celular imortalizada com primário CEs revelou que tanto em modelos in vitro BBB são adequados para estudos de adesão de células T 26. As linhas celulares estabelecidas de acordo com o processo descrito pode ser utilizado no número de passagem baixa para manter as propriedades de barreira pela expressão elevada de BBB e CE proteínas juncionais, como as células perdem estas propriedades durante o envelhecimento. Assim, após a perda de propriedades de barreira, a preparação de uma nova linha de células deve ser considerada. Densidade de plaqueamento de células deve ser elevada para os ECs, como este é crítica para a proliferação de células. Isto deve ser considerado durante o processo de isolamento, bem como a manutenção do ECs imortalizado. Cada linha de células de novo deve ser testada para as suas propriedades de barreira e de possíveis contaminantes, com outros tipos de células. Monocamadas EC podem ser coradas com anti-antigénio músculo galactocerebrósido, anti-glial fibrilar ácida e proteína anti-liso como anticorpos primários para excluir a contaminação com oligodendrócitos, astrócitos e pericitos 4,27. Para impedir a contaminação pela vasculatura meningal, a expressão da trombomodulina pode ser testado, o que é expresso em todos os leitos vasculares com a excepção do cérebro 28. Curiosamente, as linhas celulares imortalizadas microvasculares endoteliais isoladas de diferentes regiões do cérebro diferem nas suas propriedades de barreira e de susceptibilidade a estímulos pró-inflamatórios. Como um exemplo, as linhas de células cerebrais e cerebelares CEND cerebEND podem ser mencionados 4,5. CerebEND mostrou, em comparaçãopara CEND, menores níveis de expressão dos principais componentes da junção apertadas claudina-1 e occludin. No entanto, os níveis de claudina-3 e -12 foram maiores no cerebEND. A função da barreira de células cerebEND sofreu muito mais sob o tratamento com o mediador inflamatório, TNFa do que as propriedades de barreira de células CEND fez 5. Vulnerabilidade cerebelar superior a estímulos inflamatórios, podem ser observados in vivo em doentes com esclerose múltipla e na sua experimental do modelo animal, a encefalomielite auto-imune 29. Estes resultados interessantes mostrar a necessidade de gerar e caracterizar indivíduo em modelos in vitro de diferentes regiões do cérebro, de modo a melhorar o direccionamento da droga futuro para o cérebro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Pureza&gt; 98% </td></tr><tr><td> colágeno IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 ug / ml em 50 mM de ácido acético </td></tr><tr><td> Colagenase / Dispase </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetil-sulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal de Vitelo (FCS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15110-1333 </td><td> concentração final de 10%, inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutamina </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Armazenamento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Armazenamento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Piruvato de Na- </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomicina (G418) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Os aminoácidos não essenciais (AEN) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> O armazenamento a 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Armazenamento: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (brometo Hexadimetrina) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> 0,8 mg / ml em PBS, a armazenagem à temperatura de -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, EDTA a 0,02% em PBS </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

As células epiteliais e endoteliais (CE) são a construção de barreiras paracelular que protegem o tecido a partir do ambiente externo e interno. A barreira hemato-encefálica (BHE), constituído por CE, astrócitos finais pés, pericitos e a membrana basal é responsável pela protecção e homeostase do parênquima cerebral. Modelos in vitro BBB são ferramentas comuns para o estudo da estrutura e função da BHE a nível celular. Um número considerável de diferentes modelos in vitro BBB foram estabelecidos por pesquisa em diferentes laboratórios até à data. Normalmente, as células são obtidas a partir de bovinos, suínos, rato ou ratinho tecido cerebral (discutido em detalhe na revisão por Wilhelm et al. 1). Amostras de tecido humano estão disponíveis apenas em um número restrito de laboratórios ou empresas 2,3. Embora as preparações de células primárias são demorados e as culturas de EC pode variar de lote para lote, o estabelecimento de imortalizada CE lines é o foco de interesse científico. Aqui, apresentamos um método para estabelecer um imortalizado cérebro microvascular linha CE do cérebro de rato neonatal. Descreve-se o procedimento de listagem passo-a-passo a reagentes e soluções utilizados. O método estabelecido pelo nosso laboratório permite o isolamento de uma linha celular imortalizada endotelial homogénea dentro de 4-5 semanas. As linhas de células cerebrais microvasculares endoteliais denominado CEND 4 (a partir de córtex cerebral) e cerebEND 5 (a partir de córtex cerebelar), foram isolados de acordo com este procedimento no laboratório Förster e têm sido eficazmente utilizados para explicação de diversos processos fisiológicos e patológicos no BBB. Usando CEND cerebEND e demonstrámos que as células respondem a glucocorticóides 4,6-9 e estrogénio-tratamento 10, bem como a pró-infammatory mediadores, tais como TNFalfa 5,8. Além disso, estudou-se a patologia de múltiplas sclerosis 11 e hipóxia 12,13 na CE-nível. O CEND e linhas cerebEND pode ser considerado como uma boa ferramenta para o estudo da estrutura e função das respostas celulares, BBB de ECs a diferentes estímulos ou interacção da CE com linfócitos ou células cancerosas.

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Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Este método descreve como isolar e imortalizar células endoteliais microvasculares de cérebro de rato. Descreve-se um protocolo de passo-a-passo a partir da homogeneização do tecido cerebral, as etapas de digestão, a semeadura e imortalização das células. Normalmente, leva cerca de cinco semanas, para se obter uma homogeneidade, linha celular imortalizada microvascular endotelial.

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

18.7K visualizações.  University of Wurzburg. Este método descreve como isolar e imortalizar células endoteliais microvasculares de cérebro de rato. Descreve-se um protocolo de passo-a-passo a partir da homogeneização do tecido cerebral, as etapas de digestão, a semeadura e imortalização das células. Normalmente, leva cerca de cinco semanas, para se obter uma homogeneidade, linha celular imortalizada microvascular endotelial.

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Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Neurociência

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

Explantes Cocleares Neonatais Totais como Modelo In vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Medição da resistência transendotelial para avaliar a integridade da barreira celular

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Autor em destaque: Aplicações da detecção TEER para avaliar a integridade da barreira celular 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...