מחקר זה נתמך על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה DFG תחת מספר מענק FO 315/4-1 וDFG SFB 688.

1. בידוד של המוח Microvessels <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחד להשתמש בהכנה 09:55 עכברי ילוד מהמין (3-5 ימים ישנים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עכבר על פי המלצות מקומיות IACUC / וטרינר, להסיר את המוח באופן מיידי, והעברה לצלחת הפטר שמכילה את הפתרון הבא: 15 מ&quot;מ (Hepes pH 7.4), 153 המ&quot;מ NaCl, KCl 5.6 מ&quot;מ, 2.3 המ&quot;מ CaCl 2 x 2H 2 הו, 2.6 המ&quot;מ MgCl 2 x 6H 2 O,% 1 (w / v) BSA (להלן כלמאגר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלא אם צוין אחרת, כל נהלי הבידוד צריכים להתבצע בטמפרטורת חדר (RT) (22-24 ° C) מתחת למכסת מנוע הזרימה למינרית. חותך את המוח (מוח בלי מוח קטן וגזע מוח), לאחר הסרת קרומי המוח ושברי נימים, במאגר באמצעות אזמל סטרילי. פיפטה הרקמה שברים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מ&quot;ל עד שלא יופיעו גושים. להעביר את ההשעיה לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל וצנטריפוגה XG ב 250 למשך 5 דקות בRT. </li></ol> הערה: קרום מוח יכול להיות מזוהה כקרומים דקים ושקופים על פני השטח של רקמת המוח. ניתן להסיר אותם בזהירות עם מלקחיים סטרילית. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס את הגלולה במאגר המ&quot;ל 4.5 עם 1.5 מ&quot;ל של 0.75% (w / v) collagenase / dispase (רוש) ודגירה במשך 45 דקות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים (לעתים רועד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין את לוחות 12-גם על ידי ציפוי ארבע בארות בקולגן IV (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​הומס בחומצה אצטית 50 מ&quot;מימ). אפשר לדבוק לשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את מערכת העיכול על ידי תוספת של 15 מ&quot;ל החיץ א resuspend קר כקרח הגלולה ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG עבור 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר המיאלין, יוסיף 10 25% מ&quot;ל (w / v) BSA (Sigma, טוהר&gt; 98%) וצנטריפוגה XG ב 1000 עבור 20 דקות ב 4 ° C. BSA 25% צריך להיות מומס ב1x PBS (Paa מעבדות) ומסונן דרך f 0.2 מיקרומטרilter). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשליך בזהירות את supernatant, לפזר את הגלולה במאגר 10 מ&quot;ל ולהעביר לצינור פלקון חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT. גלולת כתוצאה מכילה את תאי האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמי צלחת קולגן IV-12-המצופית היטב עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 4 מ&quot;ל של מדיום גידול (DMEM המכיל 10% FCS, 50U/ml פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין) וצלחת השעית התא לשתי בארות, 2 מ&quot;ל לכל באר. הוסף puromycin לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ודגירה במשך 45 דקות על 37 מעלות צלזיוס בתא תרבות חממה. שלב זה מאפשר הסרת תאים במהירות דבקות הערה:. Puromycin מתווסף ל24 שעות. רק המוח ECs יכול לעכל אותו, לסוגי תאים אחרים puromycin הוא רעיל 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה בינוני 2 מ&quot;ל מכילים תאים שאינם דבקים-מצעד 1.14 לשתי בארות טריות (בארות אלה מכילות שבריר EC). מלא את הבארות עם תאים דבקו מבקעמ &#39;1.14 במדיום טרי מ&quot;ל 2 (בארות אלה מכילים סוגים אחרים של תאים פיברובלסטים, למשל, האסטרוציטים, וניתן לגדל במקביל ומשמשות להשוואות של המורפולוגיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי הבינוני ביום המחרת. </li></ol> 2. מנציח את תאי אנדותל כלי הדם במוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח GP + E-86 (ניאו GPENeo) 15 פיברובלסטים, מפרישי וירוס שכפול לקוי עם אונקוגן polyoma אמצע T במדיום DMEM FCS המכיל 10% חום מומת, 50U/ml פניצילין / סטרפטומיצין, ו2 מ&quot;ג / המ&quot;ל G418 ( . Paa מעבדות) בצלוחיות מצופות ג&#39;לטין הערה: transfection אונקוגן T אמצע Polyoma גורם יתרון צמיחה של מעל ECs הלא ECS-מובילה לmonolayer הומוגנית של תאי אנדותל עם מורפולוגיה 4 עד 6 שבועות של התרבות. GPENeo אינו זמין באופן מסחרי וניתן להשיג כחומר ציבורי משותף (עיין בפרסומים מקוריים 4,16). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש במדיום המכיל וירוס עבור<html> הנצחה, לטפח את תאי GPENeo במדיום G418-חינם עבור 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 10 מ&quot;ל של GPEneo supernatant ולהוסיף Polybrene (hexadimethrine רומיד) (Sigma) לריכוז סופי של מיקרוגרם 8 / מ&quot;ל, לעקר דרך 0.45 מיקרומטר מסנן כדי להסיר את הברים הסלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום גידול מתרבויות EC הוכנו בחלק 1 ולהוסיף 2 מ&quot;ל של תערובת GPEneo supernatant / Polybrene לתוך הבארות. חזור על אותו למחרת באמצעות תערובת טריה GPEneo supernatant / Polybrene הערה:. Polybrene משמשת כדי להפוך את הנקבוביות בקיר התא כדי להקל את הזיהום בחלקיקים הנגיפיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את GPEneo תערובת supernatant / Polybrene למחרת, לשטוף את תאי פעמים עם PBS ולשמור את התאים במדיום הגידול המשתנים כל 3 ימים. לאחר המפגש, לפצל את התאים 01:02 על צלחות קולגן IV מצופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, (cEND) קווי אנדותל מוחיים יציבים סלולריים יש לקבל כעבור 4-5 שבועות. </li></ol>&quot;&gt; 3. טיפוח דואר תאי האנדותל כלי הדם במוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר את התאים מcryoaliquot באמבט מים והעברה ב15 מ&quot;ל-פלקון עם 10 בינוניים מראש התחמם מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, להעביר את הכדור בבקבוק קולגן IV המצופה T 25 סנטימטרי 2 תא התרבות עם מדיום גידול מחומם מראש (צפיפות תאים לציפוי צריכה להיות לפחות 1x 10 4 תאים / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בינוני למחרת ולאחר שהתאים הגיעו למפגש (בדרך כלל לאחר 5 ימים) לפצל את התאים. </li></ol> 4. פיצול תאי cEND (הערה: פיצול צריך להיעשות רק פעם בשבוע, יש להימנע מפיצול גבוה יותר מאשר 1:4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, לשטוף את התאים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של טריפסין-EDTA פתרון החם (Paa מעבדות) (75 סנטימטר 2 בקבוק T), דגירה על 37 מעלות צלזיוס ולחכות עד ששכבת תאים מפוזרת (בדרך כלל בתוך 5 עד 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 המ&quot;ל oמדיום גידול f, פיפטה מעלה ומטה, ומעביר לבקבוק קולגן IV מצופה חדש. </li></ol> 5. הקפאת cEND התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את השעית התא כמתואר בשלב 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה ב 250 XG למשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא הגלול (המתקבל מ 2 סנטימטר בקבוק 1 T 75) במדיום הקפאת מ&quot;ל 6 (95% צמיחה בינונית, 5% DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלק את השעית התא לארבע 1.5 המ&quot;ל cryo-aliquots הערה:. Cryo-aliquot אחד יכול להיות seeded על 2 סנטימטר בקבוק T 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את-aliquots cryo תחת טמפרטורת אדי חנקן נוזלית. </li></ol> cEND מדיום גידול: 450 המ&quot;ל DMEM, 10% FCS, 10 מיליליטר L-גלוטמין, 2% MEM-קיט, 2% NEAA, פירובט 10 מיליליטר נתרן, 50 U / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין 6. נציג תוצאות תאי cEND וcerebEND התאפיינו immunostainings של אנדותלnd BBB סמנים כמו גם על ידי מדידות של התנגדות transendothelial החשמלית (TEER) וחדירות. CEND וcerebEND היה מורפולוגיה דומה לתרבויות העיקריות של המוח ECs, עם monolayers של תאים מוארכים צפופים שהוצגו עיכוב גדילה במפגש. התאים בטאו רמות גם לגילוי של claudin-5, occludin וחלבוני VE-cadherin שהיו נקודות בצומת תאי תאים, כפי שמוצגות על ידי immunofluorescence (3 איור) 4,5. תאי cEND culturing במדיום סרום מופחת הובילו לעלייה בTEER (מ 150 Ωcm 2 בנוכחות של 10% בסרום עד 500 Ωcm 2 בנוכחות של 2% סרום), שpotentiated על ידי התוספת של הידרוקורטיזון (800 Ωcm 2) או אינסולין (1000 Ωcm 2) 4. Monolayers של cEND תרבית במדיום סרום מופחת במשך 21 ימים היה TEER של 900 Ωcm 2 (איור 4). TEER נמדד באמצעות הרכבההמכילים אלקטרודות נוכחי גניבה ומתח מדידה (מכשירי Precision עולם). לשם השוואה, כלי דם המוח העיקרי ECs דווח לי ערכי TEER של 200-600 Ωcm 2 ושורת תאי עכבר זמינה מסחרי bEnd.3 היו ערכי TEER של 100-140 Ωcm 2 (לסקירה האחרונה לראות אבוט 2005 וטות et אל., 2011 17,18). בנוסף, המעבר של מקרומולקולות, כגון שאינם טעון FITC-dextrans של המונים מולקולריים 4, 10, 70 ו 500 KDA, או fluorescein (300 דא) על פני monolayer של cEND ב2% בינוניים בידול FCS מעל 4 שעות היה ירידה לעומת תאי ביקורת מנוהלים במדיום גידול המכיל 10% FCS: שטף paracellular הופחת ל 30% מתאי בקרה לfluorescein, עד 26% לFITC-dextrans 10 ו 70 kDa, ושטף הופחת ל -4.5% מתאי בקרה לFITC Dextrtan-500 kDa. בדומה לTEER ערכים, החדירות היו ברמה הנמוכה ביותר בתאים בתרבית בנוכחות gluc4 ocorticoids (GC). במחקרים נוספים, זיהו את גני מטרת glucocorticoid, occludin, claudin-5 וVE-cadherin בהאנדותל כלי דם במוח 4,7,9. טיפול GC הוביל לעלייה בביטוי של חלבונים אלו, והארגון מחדש של VE-cadherin לcytoskeleton. הרגולציה הישירה GC בתיווך של חלבונים ההדוקים הצומת occludin וclaudin-5 מופיעה דרך אלמנטי תגובה GC באזורי אמרגן 4,7,19. בנוסף, claudin-5 זוהו כמטרת אסטרוגן רומן ב10 האנדותל בכלי דם. בבסיס תפקוד האנדותל מחלות רבות ושונות. אנו תרבית cEND תחת חמצן / חסך (OGD) תנאי גלוקוז. OGD הוביל לשיבוש תפקוד BBB, שניתן לשחזר לאחר טיפול משולב עם GC והמעכב 12 לקייד הפרוטאזום. תנאי OGD הביאו לעלייה חזקה בספיגת הגלוקוז ובביטוי של transpor גלוקוזters בcerebEND, אשר יכול להיות מוחלש על ידי התוספת של MK801, מעכב הלא תחרותי של NMDA קולטן 13. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> איור 1. מורפולוגיה של תאי מוח כלי דם (אנדותל cEND) בשבוע אחד אחרי בידוד. תמונות מיקרוסקופ אור נלקחה תחת (ב) הגדלת 6x () ו15x. מושבות האי נוצרו-של תאי האנדותל גלויות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> איור 2. מורפולוגיה של תאי אנדותל כלי דם במוח (cEND) חודש לאחר בידוד והנצחה. תמונות מיקרוסקופ אור נלקח תחת גדלת 15x. Monolayer מחובר, הומוגנית אנדותל תא ניתן לצפות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> איור 3. microvascul המוח הונצחתאי האנדותל ar מפורש claudin-5, occludin וVE-cadherin. תאי CEND גדלו על coverslips קולגן IV המצופה ומוכתמים בנוגדנים נגד claudin-5 (א), occludin (B) וVE-cadherin (C). התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ Axioscop2 Zeiss מתחת לעדשות 40X. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> איור 4. מדידת ההתנגדות חשמלית transendothelial (TEER) של monolayer cEND. CEND גדלה על מסנני transwell IV מצופים קולגן (0.4 מיקרומטר גודל נקבובי). לאחר שהגיע למפגש, התאים נשמרו במדיום המכיל 2% FCS. TEER נמדד לאחר 7, 14 ו 21 ימים באמצעות הרכבה המכילה אלקטרודות נוכחי גניבה ומתח המדידה.

<ol>
	<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113 (2011).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937 (2008).</li><li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872 (2005).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).</li><li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli.">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37 (2006).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific.">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).</li><li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter.">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19 (2009).</li><li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND.">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937 (2007).</li><li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells.">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139 (2008).</li><li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium.">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298 (2010).</li><li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis.">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293 (2010).</li><li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081 (2011).</li><li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen/glucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells.">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44 (2012).</li><li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279 (2005).</li><li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells.">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203 (2002).</li><li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+function+of+the+blood-brain+barrier:+incomplete+presentation+of+protein+(auto-)antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro.">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757 (1990).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5 (2005).</li><li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery.">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107 (2011).</li><li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element.">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39 (2008).</li><li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses.">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125 (1994).</li><li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases.">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100 (1994).</li><li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation.">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327 (2001).</li><li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521 (1990).</li><li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells.">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101 (1994).</li><li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435 (1990).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315 (2010).</li><li>Skaper, S. D., Conn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurosciences. 2, 1303 (1990).</li><li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin,+an+endothelial+anticoagulant+protein,+is+absent+from+the+human+brain.">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362 (1986).</li><li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis.">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ההליך המתואר יכול לשמש לבידוד של כלי הדם ECS מזנים שונים של עכברים, כמו גם מזנים שונים עקום החוצה עכברים כדי ללמוד את השינויים הספציפיים בתפקוד האנדותל בכלי דם. כדרך להנצחה הייתי שינוי עם oncoprotein של polyomavirus העכברי, אנטיגן T Polyoma האמצע. זה הופך את תאי האנדותל בשלה במהירות in vivo ו במבחנה 20,21,22. שיטות אחרות להנצחה של ECs תוארו בספרות כוללות למשל הנצחה עם האנטיגן SV40 גדול T של וירוס Vacuolating קופי 40 23, גן ​​מוצר אדנווירוס 24 E1A או ביטוי יתר של המקטע הקטליטית של telomerase האנושי 3. ההנצחה עם PymT היא ספציפית לECs הבוסר העכברי, המאפשר קבלת תרבות EC הומוגנית מעכברים ילודים בזמן קצר. הנצחה משנה את התכונות של התאים והתוצאות שהושגו עם דואר שורות תאים הנציחו יש להשוות גם עם תאים ראשוניים או בניסויי in vivo בעכברים. PymT EC הונצח תואר להביע רמות גבוהות של פעילות fibrinolytic הנובעות מייצור מוגבר של urokinase סוג plasminogen activator וירידה בייצור של plasminogen activator 25 מעכבים. השוואה ישירה של PymT הונצחה קו bEND5 תא עם ECS הראשונית עלה, כי הן במודלים חוץ גופיית BBB מתאימים גם ללימודי הידבקות תא T 26. שורות התאים הוקמו בהתאם לנוהל שתואר ניתן להשתמש במספר מעבר נמוך כדי לשמור על נכסי מכשול על ידי ביטוי גבוה של חלבוני junctional BBB ו-EC, כמו תאים מאבדים מאפיינים אלה במהלך ההזדקנות. לכן לאחר אובדן נכסי מכשול, ההכנה של שורת תאים חדשה צריכה להיחשב. צפיפות תאי ציפוי צריכה להיות גבוהה לECs, כמו זו היא קריטית לשגשוג תאים. זה יש לבחון במהלך הליך הבידוד, כמו גם תחזוקה של ECs הונצח. כל שורת תאים חדשה צריכה להיבדק על נכסי המכשול ולמזהמים אפשריים עם סוגי תאים אחרים. monolayers EC ניתן מוכתם בחומץ חלבון אנטי galactocerebroside, אנטי גליה fibrillary ואנטי חלק אנטיגן שרירים כמו נוגדנים ראשוניים שלא לכלול את הזיהום עם oligodendrocytes, האסטרוציטים וpericytes 4,27. כדי לשלול זיהום על ידי מערכת כלי דם meningal, הביטוי של thrombomodulin ניתן לבדוק, שבא לידי ביטוי בכל ערוצי כלי הדם, למעט המוח 28. מעניין, את הקווים הנציחו כלי דם אנדותל התאים שאזורי מוח שונים נבדלים בתכונות וגם ברגישות שלהם לגירויי המכשול פרו דלקתיים. כדוגמה, שורות תאי המוח והמוח קטן cEND cerebEND ניתן לציין 4,5. CerebEND הראה, בהשוואהלcEND, רמות ביטוי נמוכות יותר של רכיבי צומת ההדוקים העיקריים claudin-1 וoccludin. עם זאת, ברמות של claudin-3 ו -12 היו גבוהות יותר בcerebEND. תפקוד המחסום של תאי cerebEND סבל הרבה יותר תחת טיפול עם המתווך הדלקתי, TNFα ממאפייני המכשול של תאי cEND עשו 5. פגיעות מוח קטנות יותר לגירויים דלקתיים, ניתן להבחין בחי בחולי טרשת נפוצה ובניסיוני מודל החיה שלה אוטואימונית Encephalomyelitis 29. ממצאים מעניינים אלה עולים הצורך ביצירה ואפיון פרטני במודלים חוץ גופייה לאזורים שונים של מוח, על מנת לשפר את תרופת עתיד מיקוד לתוך המוח.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שור אלבומין (BSA) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A7906 </td><td> טוהר&gt; 98% </td></tr><tr><td> קולגן IV </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C5533 </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בחומצה אצטית 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> רוש </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> המדיום של Dulbecco העדכון של הנשר (DMEM) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> sulfoxide דימתיל (DMSO) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> עוברי עגל בסרום (FCS) </td><td> מעבדות Paa </td><td> A15110-1333 </td><td> ריכוז סופי של 10%, חום מומת (30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס) </td></tr&gt; <tr><td> L-גלוטמין </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> אחסון: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> אחסון: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-פירובט </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> נאומיצין (G418) </td><td> מעבדות Paa </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> חומצות האמין שאינם חיוניות (רח&quot;ל) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> אחסון ב 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / סטרפטומיצין </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> אחסון: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> נאגר מלוח פוספט (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine רומיד) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 107689 </td><td> 0.8 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS, אחסון ב -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0.05%, 0.02% EDTA ב PBS </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

תאי אפיתל ואנדותל (EC) בונים מחסומי paracellular אשר להגן על הרקמות מהסביבה החיצונית והפנימית. מחסום דם המוח (BBB) ​​בהיקף של EC, בסוף הרגליים, pericytes astrocyte וקרום הבסיס הוא אחראי להגנה והאיזון של parenchyma המוח. במודלים חוץ גופיית BBB הם כלים משותפים ללימוד המבנה והתפקוד של BBB ברמה התאית. מספר לא מבוטל של דגמים שונים במבחנת BBB הוקם במשך מחקר במעבדות שונות עד היום. בדרך כלל, את התאים מתקבלים ממקור הבקר, חזיר, עכברוש רקמת מוח או עכבר (נדון בהרחבה בביקורת על ידי וילהלם et al. 1). דגימות רקמה אנושיות הן זמינות רק במספר מצומצם של מעבדות או חברות 2,3. בעוד הכנות ראשוניות של תא הן זמן רבים ותרבויות EC יכולות להיות שונות מיצווה כדי תצווה, ההקמה הונצחה EC ליןes הוא מוקד העניין מדעי. כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת קו הונצח מוח כלי דם EC ממוח עכבר ילוד. אנו מתארים את רישום צעד אחר צעד הליך ריאגנטים ופתרונות בשימוש. השיטה שהוקמה על ידי המעבדה שלנו מאפשרת בידוד של קו הומוגני הונצח אנדותל תא בתוך ארבעה עד חמישה שבועות. שורות תאי אנדותל כלי הדם במוח המכונות cEND 4 (מקליפת מוח) וcerebEND 5 (מקליפת המוח הקטנה), היינו מבודדים על פי נוהל זה במעבדת פורסטר ויש יעילות בשימוש להסבר של תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים בב&quot;ב. שימוש cEND וcerebEND אנו מראים כי תאים אלה מגיבים לglucocorticoid-4,6-9 ואסטרוגן טיפול 10, כמו גם למתווכים פרו infammatory, כגון TNFalpha 5,8. יתר על כן, יש לנו למדנו את הפתולוגיה של מרובה sc11 lerosis והיפוקסיה 12,13 ב EC ברמה. CEND וקווי cerebEND יכולים להיחשב ככלי טוב ללימוד המבנה והתפקוד של BBB תגובות, הסלולריות של ECs לגירויים או באינטראקציה שונים של EC עם ימפוציטים או תאים סרטניים.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

18.8K Views.  University of Wurzburg. שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

Video: Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

תכנון והרכבה של Microdrive קל במיוחד ממונע להקלטות עצביות כרוניות בבעלי חיים קטנים

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם ניסיוני

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

מודל טרום קליני להעריך את ההתאוששות המוח לאחר שבץ חריף בחולדות

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a combination of focused ultrasound (FUS) induced blood-brain barrier opening (FUS-BBBO), gene delivery with adeno-associated viral (AAV) vectors, and activation of cellular signaling with engineered, chemogenetic, protein receptors and their cognate ligands. With ATAC, it is possible to transduce both large and small brain regions with millimeter precision using a single noninvasive ultrasound application. This transduction can later allow for a long-term, noninvasive, device-free neuromodulation in freely moving animals using a drug. Since FUS-BBBO, AAVs, and chemogenetics have been used in multiple animals, ATAC should also be scalable for the use in other animal species. This paper expands upon a previously published protocol and outlines how to optimize the gene delivery with FUS-BBBO to small brain regions with MRI-guidance but without a need for a complicated MRI-compatible FUS device. The protocol, also, describes the design of mouse targeting and restraint components that can be 3D-printed by any lab and can be easily modified for different species or custom equipment. To aid reproducibility, the protocol describes in detail how the microbubbles, AAVs, and venipuncture were used in ATAC development. Finally, an example data is shown to guide the preliminary investigations of studies utilizing ATAC.

This protocol delineates steps necessary for the gene delivery through focused ultrasound blood brain barrier (BBB) opening, evaluation of the resulting gene expression, and measurement of neuromodulation activity of chemogenetic receptors through histological tests.