この研究は、助成番号FO 315/4-1とDFGのSFB 688の下にドイツ学術振興DFGによってサポートされていました。

1。脳微小血管の分離<ol><li>それぞれの準備のためにどちらかの性別の五から十新生児マウス（3-5日齢）を使用します。 </li><li>地元の動物実験委員会/獣医師の推奨事項に従って、マウスを安楽死させる、直ちに脳を削除し、次の解決策を含むペトリ皿に転送：15mMのHEPES（pH7.4）中、153 mMのNaCl、5.6のKCl、2.3 mMのCaCl 2×2H 2 O、2.6 mMのMgCl 2×6H 2 O、1％（w / v）のBSA（バッファと呼ぶ）。 </li><li>特に断らない限り、すべての分離手順は、層流フードの下で室温（RT）（22-24℃）で行われるべきである。バッファ内に滅菌メスを使用して、髄膜および毛細血管の断片を除去した後、脳を（小脳、脳幹、大脳なし）カット。組織がない塊が表示されなくなるまで10mlのピペットを用いて上下に断片化し、ピペット。室温で5分間、250×gで50ミリリットルのファルコンチューブと遠心分離機に懸濁液を移す。 </li></ol> 注：髄膜は脳組織の表面に薄い透明膜として識別することができます。彼らは慎重に滅菌ピンセットで除去することができる。 <ol start="4"><li>上清を捨てる。 </li><li> 4.5ミリリットルバッファ0.75％の1.5ミリリットル（w / v）のコラゲナーゼ/ディスパーゼ（Roche）を用いて、37℃で45分間インキュベート℃の水浴（時折揺れ）にCでペレットを溶解する。 </li><li>一方、コラーゲンIV（0.1 mg / mlの50 mM酢酸に溶解したもの）でコーティングする4つのウェルで12ウェルプレートを準備します。 1時間付着することができます。 </li><li>氷冷緩衝液Aを徹底的にペレットを再懸濁し、15ミリリットルを添加することによって消化を停止します。 </li><li>室温で10分間250 xgで懸濁液を遠心分離します。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li>ミエリンを削除するには、4℃で20分間、1,000×gで10ミリリットル25％（w / v）のBSA（Sigma社製、純度&gt; 98％）と遠心分離機を追加25％のBSAを1×PBS（PAAラボラトリーズ）に溶解し、0.2μmのfに通して濾過されるべきであるILTER）。 </li><li>慎重に上清を捨て、10mlのバッファーと新しいファルコンチューブに移すでペレットを溶解する。 </li><li>室温で5分間、250×gで懸濁液を遠心分離します。得られたペレットは、内皮細胞が含まれています。 </li><li> PBSで二回IV型コラーゲンコートした12ウェルプレートを洗浄してください。 </li><li> 2井戸、各ウェルに2ミリリットルに4成長培地1ml（DMEM、10％FCS、50U/mlペニシリン/ストレプトマイシン、1％L-グルタミンを含む）とプレートの細胞懸濁液中にペレットを再懸濁します。 37℃で45分間、4μg/ mlのインキュベートし、最終濃度°細胞培養インキュベーター中でC​​にピューロマイシンを追加します。このステップでは、急速に接着した細胞を除去することができます注：ピューロは、24時間のために追加されます。 ECSは、他の細胞型のピューロのために、それを代謝することができる唯一の脳は14有毒である。 </li><li> 2新鮮ウェル（これらの井戸は、EC画分を含む）にステップ1.14から非付着細胞を含む2 mlの培地を転送します。 STEから接着した細胞をウェルの中に埋める2ミリリットル新鮮培地（これらの井戸は、他の細胞型、 例えば 、線維芽細胞、アストロサイトが含まれており、並行して成長し、形態の比較のために使用することができる）を持つp 1.14。 </li><li>翌日、培地を変更します。 </li></ol> 2。脳微小血管内皮細胞を不死化する<ol><li> 10％熱不活性化FCS、50U/mlペニシリン/ストレプトマイシン、および2 mg / mlのG418を（含むDMEM培地でオーマミドルTの癌遺伝子とGP + E-86ネオ（GPENeo）15線維芽細胞、分泌複製欠損ウイルスを養うゼラチンコートフラスコでPAAラボラトリーズ） 注：オーマミドルTの癌遺伝子のトランスフェクションは、非-ECS文化の内皮細胞形態4〜6週間で細胞の均質な単層につながるオーバーECの増殖の利点を引き起こす。 GPENeoは市販されていないと（オリジナルの刊行物4,16を参照してください）共有公的材料として得ることができる。 </li><li>のウイルス含有培地を使用するには<html>不死化、24時間G418を含まない培地でGPENeo細胞を養う。 </li><li> GPEneo上清10mlを取り外し、8μg/ mlの最終濃度にポリブレン（ヘキサジメトリンブロマイド）（シグマ）を追加し、細胞破片を除去するために0.45μmのフィルターで滅菌します。 </li><li>パート1で調製したEC培養から培地を除去し、ウェルにGPEneo上澄み/ポリブレン混合液2mlを加える。新鮮GPEneoポリブレン/上清混合物を使用して次の日にそれを繰り返す注：ポリブレンはウイルス粒子）の感染を容易にするために、細胞壁に孔を作るために使用されます。 </li><li> GPEneoポリブレン/上清を混合翌日を削除し、PBSで細胞を2回洗浄し、3日ごとにそれを変更する増殖培地中で細胞を維持。合流時には、コラーゲンIVコーティングプレート上の細胞1:2に分割します。 </li><li>典型的には、安定した脳血管内皮（CEND）細胞株は4-5週間後に得られるべきである。 </li></ol>E &quot;&gt; 3。脳微小血管内皮細胞の育成<ol><li> 10ミリリットルあらかじめ温めておいた培地を用いて15ミリリットル·ファルコンで水浴して転送でcryoaliquotから細胞を解凍します。 </li><li>室温で5分間、250×gで懸濁液を遠心分離します。 </li><li>培養液を除去し、あらかじめ温めておいた増殖培地とコラーゲンIVコーティングされたTの25cm 2の細胞培養フラスコ（めっき用の細胞密度が少なくとも1×10 4細胞/ mlであるべきである）でペレットを転送します。 </li><li>翌日、培地を変更して、細胞がコンフルエントに達した後（通常5日後）セルを​​分割する。 </li></ol> 4。 CEND細胞の分裂（注：分割は週に一度の間隔で行われる必要があり、1:4より高い分割を避ける）。 <ol><li> 、培地を除去し、PBSで細胞を洗浄する。 </li><li> 37℃でインキュベート暖かいトリプシン-EDTA溶液（PAAラボラトリーズ）（T 75cm 2フラスコ）、3 mlを追加℃、細胞層まで待つ（通常5〜15分以内）に分散されている。 </li><li> 5ミリリットルoを追加fの成長培地、ピペッティングと、新しいコラーゲンIVコーティングしたフラスコへの転送。 </li></ol> 5。 CEND細胞の凍結<ol><li>ステップ4で説明したように細胞懸濁液を得</li><li>室温で5分間、250×gで懸濁液を遠心分離します。 </li><li> 6ミリリットルの凍結培地中で細胞ペレット（1 T 75cm 2フラスコから得られた）（95％成長培地、5％DMSO）を懸濁します。 </li><li> 。4 1.5ミリリットルクライオアリコートに細胞懸濁液を分割注：Oneクライオアリコートは、T 25cm 2フラスコに播種することができます。 </li><li>液体窒素蒸気温度下クライオアリコートを格納します。 </li></ol> 450ミリリットルDMEM、10％FCS、10ミリリットルのL-グルタミン、2％MEM-キット、2％NEAA、10mlのピルビン酸ナトリウム、50 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン：増殖培地をCEND 6。代表的な結果 CENDとcerebEND細胞は内皮の免疫染色によって特徴づけられたND BBBは経内皮電気抵抗（TEER）と透磁率の測定によって、ならびにマーカー。 CENDとcerebENDは合流での成長阻害を示したすし詰め状態細長い細胞の単層で、脳ECの初代培養と同様の形態を有していた。細胞は、免疫蛍光（ 図3）4,5で示される細胞間結合に局在していたクローディン-5、オクルディンとVE-カドヘリンタンパク質の良く検出可能なレベルを、表明した。血清低減培地で培養CEND細胞はTEERの増加（Ωcmの2 150から2％血清の存在下で500Ωcmで2〜10％血清の存在下）ヒドロコルチゾンを添加することによって増強された、（800Ω·cmであったにつながった2）またはインスリン（1,000Ω·cmであった2）4。 21日間血清低減培地で培養CENDの単分子膜は、900Ω·cmであった2（ 図4）のTEERを持っていた。 TEERは、アセンブリを使用して測定した現在のパッシングと電圧測定電極（ワールド·精密機器）を含む。比較のために、主要な微小血管脳ECは200から600Ω·cmであった2と市販のマウス細胞株bEnd.3のTEER値はアボット2005とTothさんらを参照してください最近のレビューのために100から140Ωcmの2（のTEER値を持っていたことが報告されているら 、2011年17,18）。加えて、4時間かけてこのような非荷電分子量4、10、70、500 kDaのFITC-デキストラン、または2％FCSの分化培地でCENDの単層にわたるフルオレセイン（300 Da）のような巨大分子の通過は低下した10％FCSを含む成長培地中で維持コントロール細胞と比較して：傍細胞フラックスはFITC-デキストラン10〜70 kDaのために26％に、フルオレセインの制御細胞の30％に減少した、フラックスをFITC用コントロール細胞の4.5％に減少した-dextrtan 500kDaの。値をTEERと同様に、透磁率がglucの存在下で培養した細胞では、最低レベルであったocorticoids（GC）4。さらなる研究では、脳血管内皮4,7,9にクローディン-5およびVE-カドヘリン、オクルディン、グルココルチコイド標的遺伝子を同定した。 GCの治療は、これらのタンパク質の発現が増加したこと及び細胞骨格へのVE-カドヘリンの転位につながった。タイトジャンクションタンパク質オクルディンとクローディン-5の直接GC媒介規制は、そのプロモーター領域4,7,19のGC応答エレメントを通して表示されます。また、クローディン-5は血管内皮10における新規エストロゲン標的として同定された。 内皮機能障害の根底にさまざまな病気を。我々は、酸素/グルコース欠乏（OGD）条件下でCEND培養した。 OGDは、GCおよびプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ12との併用治療後に再構成することができるのBBB機能の破壊につながった。 OGD条件はグルコース取り込みの強い増加につながったとグルコースtransporの発現にMK801、NMDA受容体13の非競合的阻害剤を添加することにより減衰させることができるcerebENDでTERS、。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> 図1。脳微小血管内皮細胞の形態（CEND）分離後の1週間。光顕微鏡写真は6倍（A）と15倍（B）の倍率で撮影した。内皮細胞の島形成されたコロニーが表示されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> 図2。一ヶ月隔離と不死化後の脳微小血管内皮細胞の形態（CEND）。光学顕微鏡写真は15倍の倍率で撮影した。コンフルエントに、均質な内皮細胞単層を観察することができる。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> 図3。不死化脳microvascularの内皮細胞はクローディン-5、オクルディンとVE-カドヘリン。CEND細胞がコラーゲンIVコーティングされたカバースリップ上で成長し、クローディン-5に対する抗体（）、オクルディン（B）およびVE-カドヘリン（C）で染色した。画像は40倍の倍率でツァイスAxioscop2顕微鏡を用いて撮影した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> 図4。 CEND単層。CENDの経内皮電気抵抗（TEER）の測定は、コラーゲンIVコーティングされたトランスウェルフィルター（孔径0.4μm）の上に成長した。コンフルエントに達した後、細胞を2％FCSを含む培地中で維持した。 TEERは、電流通過および電圧測定用電極を含むアセンブリを使用して、7日、14日及び21日後に測定した。

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特別な利害関係は宣言されません。

説明する手順は、血管内皮機能の特定の変化を研究するために、異なるマウス系統からだけでなく、さまざまなノックアウトマウス系統からの微小血管ECの切り分けに使用することができます。 不死化の方法として、我々は、マウスポリオーマウイルス、ポリオーマミドルT抗原の癌タンパク質の形質転換を使用していました。これは、in vivoおよび in vitro 20,21,22 で急速に未熟な内皮細胞を変形させる。文献に記載されているECの不死化する他の方法は、例えばSV40ラージサル空胞化ウイルスのT抗原40 23、アデノウイルス遺伝子産物E1A 24またはヒトテロメラーゼ3の触媒サブユニットを過剰発現させると不死化を含む。 PymTと不死化は短時間で新生児マウスから均質のEC文化を得ることを可能にするマウス未熟ECS、特異的である。不死化は、細胞及び番目のプロパティを変更不死化細胞株を用いて得られた電子の結果は、一次細胞またはマウスを用いたin vivoでの実験とのどちらと比較する必要があります。 PymT不死ECはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の産生の増加に起因する線維素溶解活性を高レベルに発現することが記載とプラスミノーゲン活性化因子阻害剤25の産生を減少させてきた。プライマリとPymT bEND5不死細胞株の直接比較は 、in vitro BBBモデルの両方がよくT細胞接着の研究26に適していることを明らかにしたECS。 記載の手順に従って確立された細胞株は、細胞が老化中にこれらのプロパティを失うように、BBBとECの接合部タンパク質の高発現によりバリア性を維持するために低継代数で使用することができます。したがって、バリア性の損失の後、新たな細胞株の調製は、考慮されるべきである。これは細胞増殖に重要であるとして、細胞播種密度は、ECSの高いはずです。これは、単離手順と同様に不死ECのメンテナンスの際に考慮しなければならない。それぞれの新しい細胞株は、その障壁特性及び他の細胞型では不可能汚染物質に対するテストする必要があります。 ECの単層をオリゴデンドロサイト、アストロサイトおよび周皮4,27による汚染を除外するために一次抗体として抗ガラクトセレブロシド、抗グリア線維性酸性タンパク質と抗平滑筋抗原で染色することができます。 meningal血管系による汚染を排除するために、トロンボモジュリンの発現が脳の28を除いた全ての血管床で表現されて、テストすることができます。 興味深いことに、異なる脳領域から分離された不死化微小血管内皮細胞株は、プロ炎症性刺激に彼らのバリア性と感受性が異なります。例として、大脳や小脳CEND cerebEND細胞株を4,5挙げることができる。 CerebEND比較で示した、主要なタイトジャンクショ​​ンコンポーネントclaudin-1のとオクルディンの低い発現レベルをCENDます。しかし、クローディン-3、-12のレベルはcerebENDで高かった。 cerebEND細胞のバリア機能は、炎症性メディエーターを用いた治療の下ではるかに苦しんだ、CEND細胞のバリア特性よりTNFαは5でした。炎症性刺激に高い小脳の脆弱性、多発性硬化症患者における脳脊髄炎と29の実験自 ​​己免疫の動物モデルを用いたin vivo で観察することができます。これらの興味深い知見は、脳の中に将来の薬物ターゲティングを改善するために、異なる脳領域のためのin vitroモデル個体を生成し、特徴付けるの必要性を示す。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A7906 </td><td>純度&gt; 98％ </td></tr><tr><td>コラーゲンIV </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C5533 </td><td> 50mM酢酸で50μg/ mlの</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ディスパーゼ</td><td>ロッシュ</td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FCS） </td><td> PAAラボラトリーズ</td><td> A15110-1333 </td><td>最終濃度10％、熱不活化（56℃で30分間C） </td></tR&gt; <tr><td> L-グルタミン酸</td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td>保管時：≤-15℃ </td></tr><tr><td> MEMビタミン</td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td>保管時：≤-15℃ </td></tr><tr><td> NA-ピルビン酸塩</td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td>ネオマイシン（G418） </td><td> PAAラボラトリーズ</td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸（NEA） </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> 4°Cでの保存</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td>保管時：≤-15℃ </td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS） </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン（ヘキサジメトリンブロマイド） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 107689 </td><td> PBS中0.8 mg / mlと、-20℃で貯蔵</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/ EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0.05％、PBS中の0.02％EDTA </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

上皮および内皮細胞（EC）は、外部と内部の環境から組織を保護する傍細胞壁を構築しています。 ECから成る血液脳関門（BBB）、アストロサイトのエンドフィート、周皮細胞と基底膜は、脳実質の保護や恒常性に責任があります。 体外 BBBのモデルでは BBBの構造と機能を研究するための一般的なツールである細胞レベルで。 in vitroでのBBBモデルで異なるの相当数は、これまでの異なる研究室の研究のために設立されています。通常、細胞は、ウシ、ブタ、ラットまたはマウスの脳組織（ウィルヘルムらによる審査で詳細に議論した。1）から得られる。ヒト組織試料は、実験室や企業2,3の限られた数でのみご利用いただけます。初代細胞の調製物は、時間がかかり、ECの文化がバッチにバッチとは異なる場合があります、不死のEC LINの設立ですがesは科学的関心の焦点となっています。 ここでは、新生児マウスの脳からの不死化脳微小血管ECのラインを確立するための方法を提案する。我々は、プロシージャ·ステップ·バイ·ステップのリストを使用した試薬および解決策を説明します。私たちの研究室で確立した方法は、4〜5週間以内に均質な不死化血管内皮細胞株の単離を可能にする。脳毛細血管内皮細胞株はCEND 4と呼ばれる（大脳皮質から）、5（小脳皮質から）cerebEND、フェルスターの研究室では、この手順に従って単離した、効果的に、BBBの異なる生理学的および病理学的プロセスの説明のために使用されている。 CENDを使用して、我々は、これらの細胞はグルココルチコイド4,6-9およびエストロゲン治療10まで並びにTNFアルファ5,8としてプロinfammatoryメディエーターに応答することが実証されているcerebEND。また、複数のSCの病理を研究してきたlerosis 11とEC-レベルの低酸素12,13。 CENDとcerebEND線はBBBの構造と機能を研究するための優れたツール、リンパ球や癌細胞と異なる刺激やECの相互作用にECの細胞応答とみなすことができる。

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Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

この方法では、マウスの脳から微小血管内皮細胞を分離し不死化する方法について説明します。我々は、脳組織、消化手順、播種し、細胞の不死化の均質化から始まるステップ·バイ·ステップのプロトコルを記述します。通常、それは均質、不死化血管内皮細胞株を得るために約5週間かかります。

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成<em&gt; in vitroで</em&gt;血液脳関門モデル

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

18.8K ビュー.  University of Wurzburg. この方法では、マウスの脳から微小血管内皮細胞を分離し不死化する方法について説明します。我々は、脳組織、消化手順、播種し、細胞の不死化の均質化から始まるステップ·バイ·ステップのプロトコルを記述します。通常、それは均質、不死化血管内皮細胞株を得るために約5週間かかります。

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Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

皿に血液脳腫瘍-障壁を使用して生体ペイロード配信で予測

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

がん研究

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

生物工学

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

医学

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

発生生物学

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

神経科学

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is characterized by an interruption in blood supply to the brain leading to cell death and cognitive dysfunction. During and after ischemic stroke, blood-brain barrier (BBB) dysfunction facilitates injury progression and contributes to poor patient recovery. Current BBB models primarily include endothelial monocultures and double co-cultures with either astrocytes or pericytes.
Such models lack the ability to fully imitate a dynamic brain microenvironment, which is essential for cell-to-cell communication. Additionally, commonly used BBB models often contain immortalized human endothelial cells or animal-derived (rodent, porcine, or bovine) cell cultures that pose translational limitations. This paper describes a novel well-insert-based BBB model containing only primary human cells (brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and brain vascular pericytes) enabling the investigation of ischemic brain injury in vitro. 
The effects of oxygen-glucose deprivation (OGD) on barrier integrity were assessed by passive permeability, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements,and direct visualization of hypoxic cells. The presented protocol offers a distinct advantage inmimicking the intercellular environment of the BBB in vivo, serving as a more realistic in vitro BBB model for developing new therapeutic strategies in the setting of ischemic brain injury.

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

Here, we describe the method for establishing a triple cell culture model of the blood-brain barrier based on primary human brain microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. This multicellular model is suitable for studies of neurovascular unit dysfunction during ischemic stroke in vitro or for the screening of drug candidates.

虚血性脳卒中をin vitroで研究するためのヒト血液脳関門のトリプル初代細胞培養モデル

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

生化学

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

免疫・感染学

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成

要約

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