Este trabalho foi financiado por doações do Deutsche Forschungsgemeinschaft (KA1270/3-1/2) e BONFOR (O-112,0040).

1. Animais Machos C57BL6 / J ratos com um peso médio de 25 g foram obtidos de Harlan Winkelmann (Borchen, Alemanha). Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a lei federal sobre a protecção dos animais. Os princípios de cuidados com animais de laboratório foram seguidas. Os animais foram mantidos com uma luz de 12 h / ciclo escuro e desde com comercialmente disponível para roedores e água da torneira ad libitum. Os animais devem ser alojados pelo menos 7 dias após a chegada a sua instalação para animais antes de experimentos. Note-se que todas as experiências pode ser facilmente adaptada a ratos ou outras espécies e com ligeiras modificações em modelos animais de grande porte. 2. Procedimento operatório <ol><li> A anestesia é induzida e mantida com isoflurano (Abbott, Wiesbaden, Alemanha) em oxigênio. Após o início dos animais anestesia local em decúbito dorsal e extremidades fixar com fita adesiva (Leukosilk, Beiersdorf, Hamburgo, Alemanha). </li&gt; <li> Após o barbear e desinfecção cirúrgica da parede abdominal uma laparotomia mediana é realizada num comprimento de 2 cm. Entrar na cavidade abdominal através de uma incisão na linha alba. Coloque dois afastadores estéreis para manter o abdômen aberto. Cuidadosamente eventerate do intestino delgado para a esquerda e coloque-o sobre uma gaze de algodão molhado. </li><li> Evacuar os todo o conteúdo do intestino delgado luminais com dois aplicadores de algodão úmido e estéril (mutilados, Neunkirchen, Alemanha), ao mesmo tempo rolando o aplicador do piloro ao ceco. CUIDADO: Evite hemorragias na parede do intestino delgado ou lesões dos vasos do intestino. Voltar a colocar o intestino para a caverna peritoneal sem torcer a evitar a isquemia ou obstrução mecânica e fechar a incisão abdominal utilizando uma de duas camadas contínuas 5/0 poliamida fios não absorvíveis (Ethicon, Norderstedt, Alemanha). </li></ol> 3. Cuidados no pós-operatório <ol><li> Após o processo de colocar o animal sob uma lâmpada de aquecimento, observing até que ela recuperou da anestesia. Colocar o rato para trás na sua gaiola e permitir o acesso a água e comida. Devido à propriedade de opióides para afetar o peristaltismo, realizamos analgesia perioperatória com AINEs (por metamizol exemplo) na água potável. </li></ol> 4. Estudos funcional 24 horas após IM <ol class="lalpha"><li> Gastrointestinal Trânsito (GIT) <ol><li> Anestesiar ratos ligeiramente com isoflurano em oxigênio 22,5 horas após IM. Cuidadosamente hiperextensão da cabeça do rato e puxe a língua com uma pinça sem corte. Encher uma seringa de 1 ml, com, pelo menos, 100 uL de dextrano marcado com fluoresceína (FITC-dextrano, 70,000 MW, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemanha), ligá-lo a um cateter arterial (Vygon, Ecouen, França) e cuidadosamente inserir o cateter como um tubo gástrico no estômago. </li><li> Resumidamente, injectar 100 ul FITC-dextran e retirar o cateter. Deixe o animal acordado e esperar por 90 min. Durante esse tempo, os ratos têm acesso a comida ou água. &lt;/ Li&gt; <li> Prepare 15 ml 2 tubos de fiação e classificá-los consecutivamente. </li><li> Eutanásia ratos 90 minutos após administração por sonda e remover todo o trato gastrointestinal do estômago ao recto. Coloque o intestino num bloco de poliestireno e evitar alongamento. CAVE: É crucial para remover o intestino com cuidado para evitar a transferência de líquido de FITC-dextrano para o segmento de perto. Para o início, pode ser útil usar grampos no início e no fim de cada segmento. </li><li> Medir o comprimento total do intestino delgado e comprimento total de cólon. Divida o intestino delgado em 10 segmentos iguais, fixando-a para o bloco de isopor com cânulas. Divida o cólon em 3 segmentos. Você preparou 15 segmentos (estômago # 1), 10 de tamanho igual segmentos do intestino delgado (# 2-11), ceco (# 12) e três 3 de mesmo tamanho segmentos do cólon (# 13-15). </li><li> Transecto intestino nas posições marcadas, agarrá-lo com uma pinça e lave-os uma vez com 1,0 ml KHB no previamente preparado KHB containi2,0 ng ml tubos de vórtice e vigorosamente durante 20 sec. O estômago e ceco são colocados diretamente e corte nos tubos preparados. Encher os tubos com 1,0 ml KHB, assim enxaguamento vestígios de conteúdo luminal da tesoura para os tubos. </li><li> Centrifugar as sondas a 12.000 rcf durante 5 min à temperatura ambiente numa centrífuga de topo de mesa. Durante a centrifugação, preparar mais 15 numeradas consecutivamente tubos de 1,5 ml. </li><li> Transfira os sobrenadantes claros para o tubo de ml com 1,5 e são armazenadas no escuro a 4 ° C até à análise (passo seguinte). As sondas podem ser armazenadas durante vários dias a 4 ° C sem perda significativa de sinal de FITC. Para armazenamento adicionar 0,09% Natrium azida ou loja em &lt;-18 ° C. </li><li> Pipetar 100 duplets uL dos sobrenadantes de uma placa de 96 poços preta (Greiner Bio One, Frickenhausen, Alemanha). Pipeta duas amostras de 100 ul de KHB como em branco. </li><li> Ler a placa num leitor de fluorescência (Safire, Tecan, Crailsheim, Alemanha) e quantificar a fluorescence em 494 nm (absorção) / 521 nm (emissão) de comprimento de onda. Subtrair valores em branco a partir de amostras. </li><li> Calcula-se o centro geométrico (GC) de FITC-dextrano de distribuição, que é, na verdade, o centro de gravidade para a distribuição do marcador, através da fórmula seguinte: GC = Σ (% do sinal de fluorescência total por segmento número do segmento *) / 100 </li></ol> Nota: Multiplicando percentagem de fluorescência de cada um dos segmentos com o seu número de segmento de uma média ponderada da distribuição do marcador dentro do intestino é avaliada. Este ponto é influenciado por tanto a distribuição e a distância percorrida pelo marcador, mas não assume nenhuma distribuição subjacente específica. 7 O valor calculado GC é muitas vezes apresentada em combinação com um gráfico que demonstra a distribuição de FITC dextrano ao longo do tracto gastrointestinal (Figura 1A). </li><li> Trânsito cólon <ol><li> Mice deve ser fracamente anestesiados com isoflurane 2% em oxigênio. CUIDADO: Certifique-se de que o animal vai despertar dentro de 40 seg. </li><li> Examinar cuidadosamente a permeabilidade do cólon através da inserção de uma sonda de fístula (metal haste, 2 mm de diâmetro) através do ânus para o cólon. </li><li> Usando a sonda fístula avançar de 2 mm de vidro esfera de 3 cm no cólon e retirar a sonda imediatamente. Posicione o mouse em uma gaiola transparente e começar a medir o tempo após a sonda fístula foi puxado para fora do cólon. Fique de olho para o mouse e parar o tempo logo após a bola de vidro se tornou excretado. </li></ol></li></ol> 5. Análise histoquímica de espécimes isolados ME <ol><li> Midjejunal segmentos são cortados a partir do intestino e imerso em KHB a frio num prato de Sylgard-cheia. </li><li> Mesentério é preso ao prato com agulhas 0,2 milímetros de insetos (Ferramentas Ciência Fine, Heidelberg, Alemanha). </li><li> Cortar abrir o segmento ao longo de sua borda mesentérica e esticar a ~ 120% do seu comprimento e largura. Finalize a fixação com insetopinos no lado oposto do mesentério. Lave o prato Sylgard cuidadosamente com KHB fresco gelado, assim, a lavagem todos os conteúdos luminais. ME podem agora mecanicamente separada da túnica mucosa a partir do mesentério. Durante a preparação substituir frescas, refrigeradas KHB várias vezes. </li><li> Túnica mucosa pode ser separado choque congelado em azoto líquido para posterior análise ou descartados. </li><li> Fixar a montagem ME isolada inteiro com etanol a 100% durante 10 min à temperatura ambiente. Lavar os integrais de montagem três vezes usando KHB refrigerados. Nota: fixadores outros (ou seja, 4% de formaldeído, ácido acético, acetona), também pode ser utilizado depois de testar a sua compatibilidade com a análise subsequente. </li><li> As montagens ME inteiras estão prontos para a coloração histoquímica ou imuno-histoquímico mais: </li></ol><ol class="lalpha"><li> Histoquímica: coloração de mieloperoxidase (MPO) PMNs infiltradas pode ser analisado pelo seguinte protocolo MPO coloração. <ol><li> Resolva 10 mg HEscora reagente Yates (Polyscience Europa, Eppelheim, Alemanha) em 10 ml de KHB e adicionar 100 ul de 3% de H 2 O 2. Prepare a solução recentemente imediatamente antes de usar e não reutilizar. </li><li> Incubar as peças inteiras durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Enxaguar espécimes extensivamente com KHB frio e incubar durante 10 min. </li><li> Montar os espécimes em meio de montagem aquoso (Aquatek, Merck, Darmstadt, Alemanha) Após a secagem durante 2 hr analisam as lâminas sob um microscópio de luz. </li><li> Conte o número de células em 5 campos escolhidos aleatoriamente e calcular como MPO células positivas / mm 2. </li></ol></li><li> A coloração imuno-histoquímica: De acordo com a coloração histoquímica MPO, colorações imunohistoquímicas das montagens inteiras podem ser executadas. Principalmente, os protocolos estabelecidos coloração imuno-histoquímica da cultura de células ou fatias de tecidos podem ser facilmente adaptados a uma coloração de montagem inteira. No entanto, otimizando o processo de anti específicacorpos é altamente recomendável. <ol><li> Cortar amostras em peças de 5 x 5 mm e realizar a coloração em tubos de centrífuga de 2,0 ml, de fundo redondo, em ~ 150 ul - 200 ul de solução de anticorpo. </li><li> Fixação e de bloqueio interno (isto é, 3% BSA em PBS durante 1 h à temperatura ambiente) pode ser realizada no &quot;prato Sylgard&quot;. </li><li> Passos de lavagem em PBS, ou outros tampões podem ser realizados em placas de 12 poços. </li><li> Transferir as amostras. Cuidadosamente com uma pinça nítidas entre tubos e placas de coloração de lavar. </li><li> Após os finais de lavagem espécimes procedimento de montagem no anti-desbotamento meio de montagem com lamínulas e analisar com um microscópio fluorescente. </li></ol></li></ol> 6. Cultura órgão do ME <ol><li> Todo o intestino pequeno é ressecado 24 hr após IM e colocados em KHB a frio, contendo 200 U / ml de penicilina G e estreptomicina 100 ug / ml (KHB + P / S). </li><li> Corte o intestino em 3 cm de comprimento e pino de cada segmento para baixo a uma Sylgard contendo glaprato ss. </li><li> Retire o mesentério com tesoura fina e desliza o intestino em uma agulha de tricô. </li><li> Gentilmente incisão no ME com uma pinça afiada e tira-lo do submucosa usando um aplicador de algodão úmido. A mucosa túnica permanece na agulha de tricotar e pode ser congelada estalo para uma investigação mais aprofundada. O ME é coletado em KHB frio + P / S. </li><li> Corte as tiras isoladas ME em pequenos pedaços de 2-4 mm de comprimento e incubar em gelo frio KHB + P / S durante meia hora e enxaguar a amostra várias vezes. </li><li> Transferir aproximadamente 50-60 mg ME (pelo menos a metade de um ME de intestino delgado), numa placa de 24 poços estéreis contendo Dulbecco modificado 500 ul de meio de Eagle (DMEM). </li><li> Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 durante 24 h adicionais. </li><li> Inspeccionar as culturas de células de contaminação bacteriana ou fúngica sob um microscópio. </li><li> Recolher o sobrenadante, girar por 5 min a 1000 rcf e congelar pressão em nitrogênio líquido. Enquanto isso secar o muscle tecido em um tecido limpo durante 30 segundos e o peso. </li><li> Os sobrenadantes podem ser utilizados para a análise subsequente de citocinas (IL-6) por meio de ELISA ou outros metabolitos (por exemplo, nitrito) no sobrenadante, seguindo instruções do fabricante. </li><li> Normalizar concentrações medidas por peso do ME tecido. </li></ol> 7. Resultados representativos <ol><li> Estudos funcionais O parâmetro mais importante na avaliação da gravidade da PI é a análise do GIT in vivo. Figura 1A demonstra uma distribuição típica de FITC dextrano ao longo do tracto gastrointestinal, em controlos não tratados e ratinhos manipulados intestinally hr 24 após a cirurgia. &quot;Sham operados&quot; animais mostraram uma GIT normal com um centro de cálculo geométrico (GC) no ceco enquanto IM levou a um atraso significativo do GIT no jejuno proximal (Figura 1B) Motilidade do cólon foi focada em separado através da medição do tempo de excreção de bola ofa 2 bola de vidro mm. Sham operados ratinhos mostram um tempo de excreção de 48 - 200 seg enquanto IM conduziu a um tempo prolongado entre a excreção de 470-775 segundos (Figura 1C). </li><li> Estudos morfológicos Para descrever a inflamatório estender dentro dos fenótipos ME vários dos leucócitos podem ser analisados ​​utilizando histoquímica ou imuno-histoquímica. Na figura 2A + B baixa presença de PMNs em &quot;operação simulada&quot; animais foi observado (39 ± 7 células / mm 2). IM do intestino delgado levou a uma infiltração PMN forte (660 ± 86 células / mm 2), em comparação com camundongos operação simulada </li><li> ME Organ Culture Muitos mediadores inflamatórios libertados a partir de células são difíceis de detectar, em lisados ​​de tecido. Culturas de órgãos de permitir a detecção de mediadores libertados no sobrenadante de cultura. Um mediador representativo de POI é NO, que é como neurotransmissor inibidor principal no tracto gastrointestinal 5. NO não pôde ser detectado em ME cul órgãotura sobrenadantes de animais de controlo não-operados (5 ± 6 pM / 24 tecido hr / mg). Na operação simulada (laparotomia) ratos basal os níveis de NO de 53 ± 36 nM / 24 tecido h / mg foram observados. ME culturas de murganhos manipulados intestinally (colhido 24 horas após a cirurgia) produzem significativamente mais NÃO (2254 ± 853 pM / 24 tecido hr / mg) durante 24 horas de cultura de órgãos ME (Figura 3). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig1.jpg" /> Figura 1. Efeito de IM em GIT (A + B) e do trânsito do cólon (C) GIT foi medido como a percentagem de não-absorvível de dextrano marcado com fluoresceína em 15 gastrointestinal segmentos-estômago (STO), intestino delgado (SI 1-9 ), ceco (Cec) e cólon (Co) -90 min após a ingestão oral. Trânsito colónico foi medida como o tempo desde a puxar para fora da sonda, até a excreção de fístula de 2 mm de contas de vidro. (A) de distribuição gastrointestinal de isotiocianato de fluoresceína-dextran após operação simulada ou IM. Em animais de operação simulada a maior parte do marcador está localizado no ceco ou o cólon proximal em relação à localização do jejuno proximal em animais manipulados. As linhas pontilhadas indicam calculado GC. (B) Cálculo do GC demonstrou um tempo de trânsito gastrintestinal prolongada após IM. (C) o tempo de trânsito do cólon mostraram um atraso significativo em ratos em comparação com os animais de MI operação simulada. GC para os 15 segmentos intestinais são apresentados como média (n = 5). Tempo de trânsito colônico foram exibidos dizer com todos os valores individuais (n = 6). *** = P &lt;0,001, teste t de Student. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig2.jpg" /> Figura 2. Detecção de MPO células positivas dentro do intestino delgado ME. (A) ME montagens inteiras foram coradas com reagente Hanker Yates para a detecção de MPO positiva PMN 24 horas após laparotomia (sham) ou procedimento IM. (B) Quantificação da célula positiva MPO em 5 campos aleatoriamente escolhidos por rato. n = 6 animals por grupo. *** = P &lt;0,001, teste t de Student. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig3.jpg" /> Figura 3. Produção de NO nos sobrenadantes de cultura de ME. Espécimes musculares de controles não operados, simulação e ratos IM foram 24 horas de pós-operatório e cultivados por 24 horas. Ratos não tratados apresentaram apenas uma produção muito baixa basal de NO. Após laparotomia NÃO libertação é aumentada sem medir diferenças significativas entre o grupo controle e os ratos operação simulada. 24 horas após a produção de NO IM é dramaticamente aumentada em comparação com ratinhos não tratados ou sham operados. n = 5 animais por grupo. *** = P &lt;0,001, ANOVA uma via.

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	<li>Wehner, S., Behrendt, F. F., Lyutenski, B. N., Lysson, M., Bauer, A. J., Hirner, A., Kalff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+macrophage+function+prevents+intestinal+inflammation+and+postoperative+ileus+in+rodents.">Inhibition of macrophage function prevents intestinal inflammation and postoperative ileus in rodents.</a> Gut. 56, 176-185 (2007).</li><li>Kalff, J. C., Schwarz, N. T., Walgenbach, K. J., Schraut, W. H., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+of+the+intestinal+muscularis:+their+phenotype+and+isolation.">Leukocytes of the intestinal muscularis: their phenotype and isolation.</a> J. Leukoc. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Um estudo comparativo analisando diferentes níveis de IM (eventração intestino delgado por 10 min versus suavemente inspeção do intestino delgado através de dois aplicadores de algodão contra o IM com a evacuação do conteúdo do intestino delgado para o ceco) revelou uma correlação entre a extensão da manipulação cirúrgica e POI. Em comparação com os outros grupos IM apresentaram maior quantidade de leucócitos no ME (PNMS, macrófagos e mastócitos), resultando em POI prolongada e severa. 8....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Ethilon 5/0 </td><td> Ethicon </td><td> 1666H </td></tr><tr><td> Aplicadores de algodão </td><td> Mutilados </td><td> 71010 </td></tr><tr><td> cateter arterial </td><td> Vygon </td><td> 115-798 </td></tr><tr><td> Placa de 96 poços (preto) </td><td> Greiner Bio One </td><td> 655096 </td></tr><tr><td> bola de vidro (2 mm de diâmetro) </td><td> Worf </td><td> disponível a pedido </td></tr><tr><td> Pinos de insetos </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26000-25 </td></tr><tr><td> Hanker Reagente Yates </td><td> Polyscience </td><td> 560694 </td></tr><tr><td> Aquatek </td><td> Merck </td><td> HC109850 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-604 F </td></tr><tr><td> FITC-dextrano (PM 70000) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 46945-500 mg-F </td></tr></tbody></table>

functional assessment of intestinal motility and gut wall inflammation in rodents: analyses in a standardized model of intestinal manipulation

Inflamação do tracto gastrointestinal é um motivo comum para uma grande variedade de doenças humanas. Modelos de pesquisa com animais são fundamentais na investigação do complexo celular e molecular da patologia intestinal. Embora a túnica mucosa é frequentemente o órgão de interesse em muitas doenças inflamatórias, trabalhos recentes demonstraram que a muscularis externa (ME) também é um órgão altamente imunocompetente que abriga uma densa rede de imunócitos residentes. 1,2 Estes trabalhos foram realizados dentro do padronizada modelo de manipulação intestinal (GI) que conduz à inflamação da parede do intestino, principalmente limitada à ME. Clinicamente isto leva a inflamação dismotilidade intestinal prolongada, conhecido como íleo pós-operatório (POI) que é uma complicação frequente e inevitável após cirurgia abdominal. 3 A inflamação é caracterizada pela libertação de mediadores pró-inflamatórios tais como IL-6, 4 ou IL-1β neurotransmissores ou inibitória como Nitric óxido (NO). 5 Posteriormente, os números enormes de imunócitos extravasate no ME, dominado por neutrófilos (PMN) e monócitos e, finalmente, manter POI. 2 com duração de dias, esta paralisia intestinal leva a um aumento do risco de aspiração, a translocação bacteriana infecciosas e complicações até sepsis e falência de órgãos múltiplos e causa um grande fardo econômico. 6 Neste artigo, demonstramos o modelo padronizado de mensagens instantâneas e avaliação in vivo do trânsito gastrointestinal (TGI) e colônico. Além disso, demonstramos um método para a separação do ME da túnica mucosa seguida de análise imunológica, que é crucial para distinguir entre as respostas inflamatórias nestes dois compartimentos de parede altamente Imunoactivas intestinais. Todas as análises são facilmente transferíveis para todos os modelos de outras pesquisas, afetando a função gastrointestinal.

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Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Íleo pós-operatório (POI) é uma complicação da cirurgia abdominal levando a um aumento da morbidade e permanência hospitalar prolongada. Porque estratégias profiláticas e terapêuticas faltam pesquisa intensificada é necessário. Por isso, estabeleceu um modelo de mouse padronizada e viável para o entendimento da fisiopatologia POI e estudar potenciais opções terapêuticas.

Avaliação Funcional da motilidade intestinal e inflamação da parede do intestino em Roedores: Análises em um modelo padronizado de Manipulação Intestinal

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

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21.9K visualizações.  University of Bonn. Íleo pós-operatório (POI) é uma complicação da cirurgia abdominal levando a um aumento da morbidade e permanência hospitalar prolongada. Porque estratégias profiláticas e terapêuticas faltam pesquisa intensificada é necessário. Por isso, estabeleceu um modelo de mouse padronizada e viável para o entendimento da fisiopatologia POI e estudar potenciais opções terapêuticas.

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Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murino Endoscopia para<em&gt; In Vivo</em&gt; Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Medicina

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Modelo murino de isquemia-reperfusão

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ischemia, when the blood supply and therefore oxygen is decreased to the intestine. This leads to intestinal barrier loss and damage to the underlying tissue. Intestinal stem cells reside at the base of the crypts of Lieberk&#252;hn and are responsible for intestinal renewal during homeostasis and following injury. Ex vivo cell culture techniques have allowed for the successful study of epithelial stem cell interactions by establishing culture conditions that support the growth of three-dimensional epithelial organ-like systems (termed "enteroids" and "colonoids" from the small and large intestine, respectively). These enteroids are composed of crypt and villus-like domains and mature to contain all of the cell types found within the epithelium. Historically, murine models have been utilized to study intestinal injury. However, a porcine model offers several advantages including similarity of size as well as gastrointestinal anatomy and physiology to that of humans. By utilizing a porcine model, we establish a protocol in which segmental loops of intestinal ischemia can be created within a single animal, enabling the study of differing time points of ischemic injury and repair in vivo. Additionally, we describe a method to isolate and culture the intestinal stem cells from the ischemic loops of intestine, allowing for the continued study of epithelial repair, modulated by stem cells, ex vivo.

This protocol will enable readers to successfully establish a porcine model of segmental intestinal ischemia and subsequently isolate and culture intestinal stem cells for the study of epithelial repair following injury.

Isolamento de células-tronco intestinal e cultura em um modelo suíno de isquemia Intestinal pequena segmentar

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated with an increased survival rate and greater quality of patient&#8217;s life when compared to conventional dialysis. Regrettably, transplantology suffers from a lack of reliable methods for organ quality assessment. Standard diagnostic techniques are limited to macroscopic appearance inspection or invasive tissue biopsy, which do not provide comprehensive information about the graft. The proposed protocol aims to introduce solid phase microextraction (SPME) as an ideal analytical method for comprehensive metabolomics and lipidomic analysis of all low molecular compounds present in kidneys allocated for transplantation. The small size of the SPME probe enables performance of a chemical biopsy, which enables extraction of metabolites directly from the organ without any tissue collection. The minimum invasiveness of the method permits execution of multiple analyses over time: directly after organ harvesting, during its preservation, and immediately after revascularization at the recipient&#8217;s body. It is hypothesized that the combination of this novel sampling method with a high-resolution mass spectrometer will allow for discrimination of a set of characteristic compounds that could serve as biological markers of graft quality and indicators of possible development of organ dysfunction.

The protocol presents utilization of the chemical biopsy approach followed by comprehensive metabolomic and lipidomic analysis for quality assessment of kidney grafts allocated for transplantation.

Usando uma biópsia química para avaliação da qualidade do enxerto

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, primarily in the hip and knee joints, which results in significant impacts on patient mobility and quality of life. To date, there are no existing curative therapies for OA able to slow down or inhibit cartilage degeneration. Presently, there is an extensive body of ongoing research to understand OA pathology and discover novel therapeutic approaches or agents that can efficiently slow down, stop, or even reverse OA. Thus, it is crucial to have a quantitative and reproducible approach to accurately evaluate OA-associated pathological changes in the joint cartilage, synovium, and subchondral bone. Currently, OA severity and progression are primarily assessed using the Osteoarthritis Research Society International (OARSI) or Mankin scoring systems. In spite of the importance of these scoring systems, they are semiquantitative and can be influenced by user subjectivity. More importantly, they fail to accurately evaluate subtle, yet important, changes in the cartilage during the early disease states or early treatment phases. The protocol we describe here uses a computerized and semiautomated histomorphometric software system to establish a standardized, rigorous, and reproducible quantitative methodology for the evaluation of joint changes in OA. This protocol presents a powerful addition to the existing systems and allows for more efficient detection of pathological changes in the joint.

The current protocol establishes a rigorous and reproducible method for quantification of morphological joint changes that accompany osteoarthritis. Application of this protocol can be valuable in monitoring disease progression and evaluating therapeutic interventions in osteoarthritis.

Avaliação histomorfométrica padronizada da osteoartrite em um modelo de rato cirúrgico

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable health and financial burden on individuals and society. Therefore, it is critical to investigate the mechanisms underlying the pathogenesis and development of IBD. Here, a gut microbiota antigen-specific T cell transfer colitis model is described. CBir1 flagellin has been recognized as the immunodominant gut bacterial antigen in experimental colitis and patients with Crohn&#39;s disease. CBir1 TCR transgenic na&#970;ve CD4+ T cells, specific to CBir1 flagellin, can induce chronic colitis after adoptive transfer into immune-deficient Rag1-/- mice. The disease severity is assessed by histopathology. The CD4+ T cell phenotypes in colonic lamina propria are also determined. This model closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In this protocol, a gut microbiota antigen-specific T cell adoptive transfer colitis model is described. CD4+ T cells are isolated from CBir1 TCR transgenic mice. These are specific for an immunodominant gut microbiota antigen CBir1 flagellin, which is transferred into recipient Rag1-/- mice, leading to intestinal inflammation.

Indução da Inflamação Intestinal por Transferência Adotiva de Células CD4+ T Transgênicas CBir1 T para camundongos imunodeficientes

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Manipulação padronizada de Tuina para osteoartrite do joelho em ratos

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its mechanism. Therefore, the manipulation of animal models of knee osteoarthritis is critical. This protocol provides a standard process for Tuina manipulation on KOA rats and a preliminary exploration of the mechanism of Tuina for KOA. The press and kneading manipulation method (a kind of Tuina manipulation that refers to pressing and kneading the specific area of the body surface) is applied on 5 acupoints around the knee joint of rats. The force and frequency of the manipulation were standardized by finger pressure recordings, and the position of the rat during manipulation is described in detail in the protocol. The effect of manipulation can be measured by pain behavior tests and microscopic findings in synovial and cartilage. KOA rats showed significant improvement in pain behavior. The synovial tissue inflammatory infiltration was reduced in the Tuina group, and the expression of tumor necrosis factor (TNF)-&#945; was significantly lower. Compared to the control group, chondrocyte apoptosis was less in the Tuina group. This study provides a standardized protocol for Tuina manipulation on KOA rats and preliminary proof that the therapeutic effects of Tuina may be related to reducing synovial inflammation and delayed chondrocyte apoptosis.

Autor em destaque: Compreendendo o mecanismo de manipulação da tuina em ratos 

We present a protocol for Tuina manipulation performed on plaster-immobilized-induced knee osteoarthritis rats. Based on the preliminary results, it suggested that the efficacy of the method relied on the reduction of inflammation and cartilage loss.

Manipulação de Tuina para Reduzir a Inflamação e Perda de Cartilagem em Ratos com Osteoartrite de Joelho

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...