A análise sistemática de pontuação é uma técnica para avaliar lesões mucosas, facilitando a interpretação histológica que pode ser realizada por pesquisadores treinados. As principais vantagens deste método é que ele é livre e fácil de usar. Permite a análise quantitativa dos dados histológicos obtidos dos intestinos de camundongos com colite.
Este protocolo fornece uma maneira rápida e reprodutível de interpretar a gravidade da doença de todo o cólon, o que é necessário para comparar doenças de animais de diferentes origens genéticas. Para a preparação de tecidos, é importante organizar todos os reagentes e materiais. Comece colocando um rato eutanizado em uma almofada dissecando em uma posição supina e imobilize as extremidades do rato usando agulhas de 20 bitolas de 1,5 polegadas.
Usando fórceps e tesouras, faça uma pequena incisão na pele abdominal e puxe-a para o lado para expor o peritônio, em seguida, abra a cavidade abdominal com uma incisão de linha média no peritônio do osso púbico para os lados do abdômen. Remova cuidadosamente tecidos e órgãos até que o intestino grosso seja visualizado. Corte o osso pélvico em ambos os lados do cólon para visualizar totalmente o órgão, estendendo-se do ânus em direção ao ceco.
Remova suavemente a gordura, as pequenas veias e as artérias presas ao cólon enquanto disseca cuidadosamente o órgão, cortando apenas proximal ao ânus e distal ao ceco. Lave cuidadosamente o cólon com PBS para remover o conteúdo fecal usando uma agulha de gavage de plástico flexível inserida através do ânus. Posicione o cólon em linha reta e abra longitudinalmente ao longo da artéria mesentérica.
Bissecte o cólon longitudinalmente do distal ao final proximal. Use metade do tecido para análise histológica e a outra metade para mancha ocidental, PCR, ou enrolada em um segundo rolo suíço para microscopia de imunofluorescência congelada fresca. Corte tecido extra do cólon proximal com uma lâmina de barbear até que aproximadamente a mesma largura ao longo do comprimento de todo o cólon seja obtida.
Alinhe o cólon para expor o lúmen e achate o tecido completamente usando uma agulha flexível de gavage. Adicione mais PBS se necessário para manter o tecido úmido durante todo o procedimento. Remova o excesso de PBS usando uma limpeza de papel.
Com uma agulha de seringa e gavage, adicione uma solução de formalina tamponada 10% neutra por dois a três minutos para fixar e achatar o tecido, em seguida, use fórceps retos para pegar a extremidade do cólon distal e torcer o cólon em círculos concêntricos do final distal ao proximal. Insira uma agulha de calibre 27 para fixar o cólon no meio e mantenha sua forma de rolo suíço, em seguida, coloque o rolo suíço em um de incorporação dentro de um recipiente de espécime histológico orientando o tecido em paralelo com relação ao. Fixar o tecido em solução de formalina tamponada 10% neutra durante a noite a quatro graus Celsius.
Após a fixação durante a noite, lave o tecido três vezes com PBS. Adicione 70% de etanol antes do processo de incorporação da parafina e remova a agulha do rolo suíço antes de prosseguir. O tecido pode ser armazenado em etanol à temperatura ambiente até a incorporação da parafina.
Depois de abrir as imagens digitalizadas no software de processamento de imagens, verifique se todo o cólon está visível e que não há áreas ausentes da amostra. Ative o imager de etiqueta e as ferramentas de barra de escala para identificar corretamente slides digitalizados clicando no imager da etiqueta. Abra a ferramenta de anotações clicando em anotações e crie três camadas diferentes clicando em nova camada para quantificar o comprimento total do rolo suíço, inflamação ou lesão, e erosão ou ulceração.
Escolha uma cor diferente para cada camada clicando na cor da camada. Meça o comprimento de cada camada ou categoria clicando na ferramenta caneta para desenhar uma linha seguindo a mucosa muscular, movendo o ponteiro conforme necessário para visualizar a área adjacente para análise. Veja a imagem com zoom de 400 micrômetros para facilitar a visualização adequada da mucosa muscular.
Cada vez que a caneta é parada, uma pequena região de camada nova será gerada. Pode ser visualizado e editado com a guia regiões de camada. Revise o comprimento total, inflamação ou lesão, e erosão ou ulceração medida utilizando a mucosa muscular como referência.
Uma vez definidas todas as camadas, exporte os dados usando a grade de exportação para o botão de arquivo de texto dentro das opções de regiões de camada. Abra os arquivos de texto e copie os dados para um software de planilha. Total de todos os segmentos de cada região e calcule o percentual de lesão e ulceração em relação ao comprimento total.
Considere três características principais para calcular o escore de colite histológica e avaliar a gravidade da doença. Verifique se há mucosa intestinal saudável, que é caracterizada por células epiteliais organizadas no eixo luminal criptografado, lamina propria com poucas células imunes e mucosa muscular subjacente. Em seguida, verifique se há inflamação ou lesão, que é caracterizada por criptas epiteliais que são atenuadas ou parcialmente ausentes células epiteliais e inflamação mucosa com infiltração de neutrófilo em criptas.
Por fim, verifique se há a presença de erosão ou ulceração, que é caracterizada por áreas desprovidas de epitélio superficial ou áreas completamente carentes de criptas de epitélio com ou sem leucócitos associados. Para ilustrar a confiabilidade dessa análise de escore de colite histológica no contexto de dano mucosa, 2,5% DSS foi administrado na água potável de oito camundongos c57BL6 do tipo selvagem durante cinco dias, seguido por um período de recuperação com água regular por cinco dias. O peso corporal permaneceu constante durante a administração aguda do DSS, mas diminuiu drasticamente quando os ratos começaram a beber água da torneira regular.
Sangue e fezes macias apareceram após três dias de administração do DSS e continuaram até o oitavo dia do experimento. Essas observações sugeriram que os efeitos mais prejudiciais da exposição ao DSS foram observados durante o período de recuperação entre os dias cinco e oito. A medição do comprimento do cólon no dia 10 confirmou um encurtamento significativo no final do experimento.
Os cólons foram colhidos no dia zero, dois, cinco, sete, oito e 10 para fazer rolos suíços de parafina. O tecido foi manchado com H&E e exames de alta definição foram analisados para calcular o escore de colite histológica e percentual de lesão e ulceração. A arquitetura cripta normal foi observada em camundongos não tratados.
Após dois dias de administração do DSS, observou-se o recrutamento de células imunes. No quinto dia, as células epiteliais aparecem danificadas e houve uma infiltração de neutrófilos em todo o epitélio associado à lesão epitelial. Do quinto ao oitavo dia, foram observadas áreas de perda epitelial com inflamação e ulceração.
No dia 10, as células epiteliais começaram a se regenerar e repovoar áreas ulceradas, restaurando lentamente a mucosa colonial. Ao tentar este protocolo, é importante criar um rolo suíço devidamente orientado e bem preservado, bem como identificar corretamente inflamação mucosa ou lesão e ulceração ou erosão. Este método pode ser usado para avaliar quantitativamente a lesão ao longo de toda a extensão da mucosa colonial em outros modelos de colite, como TMS ou modelo de transferência de células T.
