Descrevemos a técnica ideal para injeção intracraniana de células de glioblastoma derivadas do GEM em um cérebro de camundongo imunocompetente, resultando em tumores que recapitulam as principais características do glioblastoma humano. Esta técnica de injeção ortotópica de células TRP derivadas do GEM produz resultados altamente reprodutíveis, escaláveis e consistentes para tumores que se originam no córtex, mas mantêm a invasividade dos tumores GEM. Os tumores cerebrais de glioblastoma de camundongos apresentam crescimento agressivo e invadem o parênquima cerebral circundante.
Portanto, pode ser usado para avaliar terapêuticas que possam suprimir a infiltração e migração tumoral em pacientes. Este protocolo pode ser personalizado para outros modelos de tumores cerebrais, vírus, terapêuticos ou adaptado para injeção em diferentes regiões cerebrais com os ajustes de coordenadas estereotáxicas. Quem demonstrará o procedimento será Devon Atkinson, pesquisador associado do meu laboratório.
Para começar, coloque protetores de superfície sob o aparelho estereotáxico e na superfície de trabalho. Conecte o tubo de vinil do aparelho de anestesia à porta de entrada da plataforma de anestesia gasosa do aparelho estereotáxico e outro tubo à sua porta de saída. Conecte o display digital a uma fonte de alimentação e ao aparelho.
Em seguida, conecte a microbomba ao braço manipulador do aparelho depois de conectar o controlador da microbomba à fonte de alimentação. Ajuste a microbomba para 5,6 nanolitros por segundo. Conecte a almofada de aquecimento do mouse ao controlador de temperatura e a uma fonte de alimentação.
Recarregue uma seringa de precisão de calibre 30 com mistura de células metilmetilcelulose evitando bolhas. Depois de inserir o êmbolo, prenda a agulha e pressione o êmbolo até que a mistura de células carregada caia através da agulha. Limpe a agulha com uma almofada de preparação com álcool a 70%.
Uma vez que a seringa de precisão esteja conectada à microbomba, gire o braço manipulador para longe do palco antes de colocar o mouse para evitar o deslocamento da agulha da seringa. Transfira o camundongo anestesiado para o instrumento estereotáxico e fixe-o ao cone nasal colocando os dentes superiores no suporte do cone nasal. Depois de apertar o cone do nariz com um botão, aperte um dedo do pé para verificar os reflexos para garantir a anestesia adequada.
Em seguida, insira barras auriculares e aperte o botão para prender a cabeça. Aplique pomada ocular para lubrificar os olhos em condições anestesiadas. Injetar buprenorfina SR analgésica por via subcutânea e colocar uma sonda retal em camundongo para monitorar a temperatura interna.
Esterilizar o campo cirúrgico em círculos externos, alternando três vezes a paramentação cirúrgica e o etanol. Puxe a pele tensa com pinça e use uma lâmina de bisturi para fazer uma incisão de aproximadamente 1 centímetro de comprimento entre os olhos. Para injeção de células, devolva o braço do manipulador com a seringa conectada ao mouse.
Depois de apertar os botões, mova a seringa usando os botões X e Y no plano horizontal e monte-a sobre o bregma. Abaixe a agulha, usando o botão Z, para confirmar a posição do bregma e ajuste o console de leitura digital para zero. Em seguida, mova a agulha para a posição desejada, conforme descrito no manuscrito, usando os botões X e Y e a leitura digital correspondente, e use o botão Z para mover a agulha para a superfície do crânio.
Puncione um orifício no crânio usando uma seringa de 1 mililitro com uma agulha de calibre 25 acoplada. Gire cuidadosamente o braço do manipulador para o lado, enquanto coloca o bisel da agulha em direção à seringa de precisão de calibre 30. Uma vez que o braço manipulador com a agulha de seringa de precisão carregada é posicionado sobre o orifício, alinhe a ponta da agulha com o orifício e use o botão Z para abaixar a agulha na dura-máter do cérebro.
Depois de zerar o console de leitura digital, abaixe a agulha 1 milímetro com o botão Z e aguarde um minuto. Quando a profundidade de 2 milímetros for atingida, pare a microbomba e certifique-se de que a bomba pare quando 2 microlitros de suspensão celular tiverem sido injetados. Para remover a agulha do crânio, levante-a um milímetro e aguarde um minuto.
Para o fechamento da ferida, usando a extremidade de madeira de um aplicador com ponta de algodão, pegue um pedaço de cera de osso e molde-o em um cone. Depois de colocar a cera na abertura do crânio, empurre-a para o buraco. Use a pinça esterilizada para derreter a cera restante no crânio.
Uma vez liso, adicione duas gotas de solução anestésica de bupivacaína na incisão e puxe as bordas da pele juntas, usando pinças. Depois de puxar a pele tensa, usando um ou dois clipes de ferida, feche a pele, coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa em uma almofada de aquecimento em uma área livre de correntes de ar e observe atentamente o mouse. Exames semanais de ressonância magnética mostraram aumento da carga tumoral dentro do cérebro e medidas de volume tumoral.
A medida do volume tumoral na RM revelou ausência de supressão do crescimento tumoral mesmo após o tratamento radioterápico, e a sobrevida dos camundongos tratados não foi aumentada. Os tumores GBM em modelos singênicos pareciam crescer agressivamente e romper o crânio pelo desfecho terminal. Se o crescimento extracraniano for observado nas imagens após o implante celular, isso indica vazamento de células durante o processo de injeção, e mais cuidado deve ser tomado durante a retirada da agulha de injeção.
A histopatologia dos tumores ortotópicos do GBM TRP confirmou a presença de astrocitoma grau 4, incluindo a recapitulação das características distintivas em tumores como pseudopaliçada e necrose. Seja preciso ao definir o ponto zero no bregma para garantir as coordenadas corretas de injeção de células. Abaixar e elevar a agulha no cérebro deve ser lento para evitar trauma e refluxo.
Após a injeção de células tumorais, exames semanais de ressonância magnética podem ser usados para determinar o tamanho basal do tumor antes de iniciar o tratamento e para visualizar a mudança da carga tumoral dentro do cérebro.
