Agradecemos ao Prof A. Vinogradov eo Dr. Vera Grivennikova para a introdução dos autores para o campo da biologia mitocondrial e muitos insights e conselhos úteis neste procedimento. Os autores agradecem à Sra. Amanda McKintock do escritório do Queens University media para o ajudar com a preparação de vídeo.

Introdução Mitocôndrias de coração de rato é uma das preparações mais comum para estudos anteriores e atuais do metabolismo celular. Eles podem ser obtidos de forma rápida e confiável em grande quantidade do tipo selvagem ou knock-out animais. O procedimento geral consiste de digestão dos tecidos por fracionamento de tripsina, e centrifugação diferencial. Existem várias condições que devem ser mantidas durante o isolamento de mitocôndrias de vários tecidos, incluindo o coração (Fig. 1). <ul><li> O tecido tem de ser completamente picada, uma vez que afeta diretamente a produção de mitocôndrias obtidos. Tecido do coração é melhor para mince com pequenas tesouras curvas e pode ser seguido pelo uso de um moedor de tecido Latapie ou, se um moedor de tecido não estiver disponível, um espremedor de alho com diâmetro de saída buracos de cerca de 1,0 mm de diâmetro. </li><li> É necessário para manter a temperatura das soluções em cada etapa. Portanto, todo o procedimento tem que ser realizado em uma sala fria e todos os instrumentos e as soluções têm que ser preparados e refrigerados com antecedência. Se as condições de temperatura não são mantidos estáveis ​​várias propriedades da preparação pode ser perdida. Estrutura mitocondrial é muito sensível ao congelamento de modo sobrearrefecimento da suspensão (por exemplo, durante a centrifugação) não é permitido, especialmente se os estudos de transporte ativo são importantes. </li><li> Um parâmetro importante é o tempo de duração do procedimento, o isolamento deve ser realizada o mais rápido possível e obtida a preparação tem que ser utilizado imediatamente. Portanto, instrumentos cirúrgicos, soluções e aparelhos devem ser preparadas com antecedência. </li></ul> Materiais e instrumentos Instrumentos <ol><li> Tesoura reta de operação, ponta afiada </li><li> Tesoura curva </li><li> Fórceps </li><li> Placa de Petri </li><li> + Funil pequeno pedaço de nylon filtro (pré-lavado) </li><li> 6 copos de 50 ml </li><li> Dois agitadores magnéticos e dois banhos de gelo </li><li> Um banho de gelo grande </li><li> 2 pequenas barras magnéticas </li><li> Espátulas para pellet raspagem </li><li> Tubos de centrífuga </li><li> Latapie imprensa tecido (pode ser substituído com espremedor de alho) </li><li> Teflon de vidro homogeneizadores 20ml e 1-2ml </li><li> Copo resíduos </li><li> Tubos Eppendorf para suspensão mitocondrial final e amostras para determinação de proteínas </li><li> Banhos de gelo </li></ol> Solutions (calculado por dois ratos): <ol><li> Tampão de lavagem: 0,3 M sacarose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml) </li><li> Tampão de isolamento: 0,3 M sacarose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml de BSA (Sigma A6003) (100 ml preparada a partir do buffer de lavar). Soro albumina bovina pode ser substituído por menos caro fatty acid-free análogos. Mesmo tampão isotônica ou suas variações podem ser usados ​​como ressuspensão buffer. </li><li> Solução de tripsina (Sigma T8003): 2.5mg/ml em HCl 1mM (0,5 ml) </li><li> Inibidor de tripsina de soja (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml de tampão de isolamento </li></ol> Protocolo O esquema geral do procedimento é mostrado na fig. 1. Corações deve ser resfriado e lavado em tampão de lavagem do tecido ventricular, excisadas, picadas e homogeneizadas durante o tratamento com tripsina fotolítica. A suspensão é centrifugada em baixa velocidade eo sobrenadante obtido é centrifugado novamente a uma velocidade maior para coletar mitocôndrias. Dependendo do buffer de experiências planejadas ressuspensão pode ser substituída por qualquer outra solução isotônica. Os animais foram terminados de acordo com o Reino Unido &quot;Animals (Scientific Procedures) Act&quot;. por deslocamento cervical seguida por decapitação. É necessário extrair o coração imediatamente após a decapitação do animal, de modo que não há atraso entre o desligamento de animais e extração de coração. Se o isolamento paralelo de fígado mitocôndria é esperado que os ratos devem estar em jejum durante a noite antes do experimento. <ol><li> Prepare três copos contendo 40 ml de tampão de lavagem. Resfriá-los no banho de gelo-sal por 3 a 5 min antes de prosseguir para a próxima etapa. Certifique-se de não overfreeze-los e usá-lo imediatamente, logo após nuvens de cristais de gelo começam a aparecer. </li><li> Abrir o tórax do rato decapitado e extrair o coração. Faça pequenas incisões e, em seguida, transferir imediatamente o coração para a solução gelada no copo primeiro. Espremer o coração para remover o sangue e colocá-lo no copo segundo. Repita esta operação para cada coração. </li><li> Secar o coração no papel filtro. Remover todo o sangue, de gordura coagulada, aurículas e fáscias e piscina no tecido ventricular. </li><li> Picar o tecido reunidos com pequenas tesouras curvas na placa de Petri sobre gelo por cerca de 5 min até que o tamanho das partículas é cerca de 1-2 mm. </li><li> Coloque o tecido picada na imprensa tecido e passar-lo completamente. Estar ciente de que uma quantidade substancial de material pode permanecer na imprensa para coletar todos os tecidos do coração das paredes e do fundo da imprensa. </li><li> Transferência do material para o copo com 50 ml Tampão de Lavagem e mexa. Em seguida, filtrar a suspensão por um filtro de nylon. Lavar o tecido picada no filtro 3 vezes com a solução de lavagem e descartar o filtrado. </li><li> Transferir os tecidos lavados em 20 ml de tampão de lavagem e colocá-lo no banho de gelo sobre o agitador magnético. Adicionar 0,5 ml de solução de tripsina, sob agitação constante e iniciar o temporizador. Prepare outra agitador magnético, banho de gelo e um copo ml segundo 50. </li><li> No minuto 4 ª brevemente homogeneizar a parte de suspensão, por parte utilizando uma pequena apertada frouxamente vidro Teflon homogeneizador (10-15ml) com várias pinceladas para cima e para baixo para dispersar a suspensão. Após a homogeneização transferir a suspensão para o segundo béquer. Repita o procedimento no minuto 9 º, de modo que você executa a homogeneização da suspensão duas vezes no total. Após 15 min de incubação, adicione 10 ml de isolar tampão contendo inibidor de tripsina e incubar por 1 min. </li><li> Filtrar a suspensão de novo através de um filtro de nylon e salvar o filtrado. Recolher a fração de partículas deixada em um filtro e homogeneizar por 1 minuto em 15-20 ml de tampão de lavagem. </li><li> Combine o homogeneizado com o filtrado e centrifugar por 15 minutos a 600g. </li><li> Cuidadosamente o sobrenadante do filtro, resultando em um novo tubo de centrífuga. Evitar a contaminação pela pelota e centrifugar novamente por 15 min a 8500g. </li><li> Após a centrifugação de alta velocidade desprezar o sobrenadante e lavar o pellet 2-3 vezes com 1 ml do tampão descartando a camada de aro branco macio exterior. Quebrar o pellet com a espátula, mas evitar a mancha vermelha de eritrócitos na parte inferior. Se as células do sangue tem loos, retire os pedaços vermelhos da suspensão antes da homogeneização. </li><li> Ressuspender o sedimento com um homogeneizador pequena ou, alternativamente, por pipetagem suave. Diluir a suspensão com mais Isolationbuffer e centrifugar novamente por 15 min a 8500g. </li><li> Desprezar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em ressuspensão Buffer (um tampão isotônica de escolha) e centrifugar novamente. </li><li> O resultado marrom pellet lavado contém mitocôndrias intactas. Ressuspender o sedimento em um volume muito pequeno de tampão isotônica de sua escolha. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema demonstrando o procedimento passo a passo de isolamento de coração de rato mitocôndrias. Parte superior, Stages 1-9: rompimento do tecido, o tratamento de tripsina e homogeneização; parte inferior, estágios 10-15: centrifugação diferencial.

<ol>
	<li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+heart+mitochondria:+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation.">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li><li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes:+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria.">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Protocolo rápida detalhadas para o isolamento de mitocôndrias intactas com um alto grau de acoplamento é descrito. Preparação obtidos podem ser utilizados para investigação funcional ou estrutural na bioenergética celular, estudos proteômicos ou análise de DNA mitocondrial e do conteúdo lipídico. Estudos biofísicos de transporte ativo de íons e intermediários metabólicos também podem ser executadas. É possível ainda mais o processo de preparação mitocondrial a fim de isolar partículas submitocondriais, membrana externa ou purificar componentes separados de fosforilação oxidativa. O método descrito é uma modificação do protocolo padrão de isolamento por Jacobus e Saks 1. O rendimento esperado das mitocôndrias preparado é de aproximadamente 10-15 mg de proteína mitocondrial por coração e da razão de controle respiratório em malato / glutamato desta preparação varia entre 8 a 12 com a respiração IV Estado de cerca de 0,12 mmol 2 xmin O -1 proteína XMG -1 a 23 ° C no meio composto de sacarose 0,25 M, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM fosfato de potássio (pH 8,0) com 150 mM ADP para a iniciação da respiração III Estado (para as condições exactas experimental e adições, ver ref . 2). Especial atenção deve ser dada a vários detalhes técnicos antes do início do procedimento de isolamento. É crucial para utilização limpa policarbonato ou tubos de centrífuga de polipropileno, portanto tubos devem ser cuidadosamente lavados com uma escova limpa e água quente, no entanto o tratamento de detergente deve ser mantido no mínimo. Além disso, é melhor recolher todos os vidros e os instrumentos necessários na sala fria de um dia antes do isolamento. Durante o isolamento durante a transferência de buffers de frascos para copos, а atenção especial deve ser dada para evitar que gotas de água gelada para as soluções. Ao manusear tecidos deve sublinhar-se que a extração do coração deve ser realizada o mais rapidamente possível uma vez que mesmo pequeno atraso de tempo entre a decapitação do animal e de resfriamento do tecido resultaria em mitocôndrias parcialmente desacoplado. Resfriamento rápido e lavagem completa dos corações removido é essencial para obter preparação padrão, livre de hemoglobina e eritrócitos NADase. Tripsina é usada para a degradação de proteínas conjuntivo para aumentar a susceptibilidade do tecido à força de cisalhamento durante a homogeneização. A exposição prolongada do tecido a protease deve ser evitado, pois resulta em mitocôndrias de qualidade inferior. Após centrifugação de alta velocidade nas paredes dos tubos de centrífuga deve ser limpo com lenço de papel para remover quaisquer depósitos de material de gordura acumulada nas paredes. Para a ressuspensão final, é melhor usar um volume baixo do buffer final, a fim de minimizar a perda de funções mitocondrial durante o armazenamento (150 a 200 l do tampão por coração). Para estudos do transporte de cátions bivalentes não quelantes devem estar presentes na preparação final, assim, as mitocôndrias devem ser lavadas várias vezes com EGTA livre de médio e utilizado dentro primeiras horas após o isolamento.

preparation of highly coupled rat heart mitochondria

A função da mitocôndria na geração de ATP celular no processo de fosforilação oxidativa é amplamente reconhecida. Durante as últimas décadas tem havido avanços significativos em nossa compreensão das funções de outras mitocôndrias do que a geração de energia. Estes incluem o seu papel na apoptose, agindo como organelas de sinalização, desenvolvimento de mamíferos e envelhecimento, bem como sua contribuição para a coordenação entre o metabolismo celular e proliferação celular. Nossa compreensão dos processos biológicos modulada pela mitocôndria é baseado em métodos robustos para isolamento e manipulação de mitocôndrias intactas de tecidos dos animais de laboratório. Mitocôndrias de coração de rato é uma das preparações mais comum para estudos anteriores e atuais do metabolismo celular, incluindo estudos sobre animais knock-out. Aqui nós descrevemos um método detalhado rápida para o isolamento de mitocôndrias intactas com um alto grau de acoplamento. Tal preparação de coração de rato mitocôndria é um objeto excelente para investigação funcional e estrutural sobre bioenergética celular, transporte de biomoléculas, os estudos de proteômica e análise de DNA mitocondrial, proteínas e lipídios.

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Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Descrevemos а protocolo para o isolamento de puro coração de rato, altamente acoplado mitocôndria para estudos funcionais ou estruturais da bioenergética celular, medições biofísicas, proteômica ou DNA mitocondrial e análise de lipídios.

Preparação de coração de rato altamente acoplado mitocôndrias

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K visualizações.  University of Manchester. Descrevemos а protocolo para o isolamento de puro coração de rato, altamente acoplado mitocôndria para estudos funcionais ou estruturais da bioenergética celular, medições biofísicas, proteômica ou DNA mitocondrial e análise de lipídios.

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Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Implantação de engenharia de tecidos no coração de ratos

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Biologia

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Preparação das Culturas cérebro de um rato Aggregate para Neuron Glia e Estudos de Desenvolvimento

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultura primária de Miócitos Coração Adulto Rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Preparação de tendões da cauda de rato de Estudos biomecânicos e Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparação de coração de rato altamente acoplado mitocôndrias

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