The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste trabalho são realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade Estadual de Michigan. 1. Sistema de Preparação e Configuração <ol><li> Adicione 5 L de uma solução de sal fisiológico (PSS), que é a quantidade necessária para um experimento contracção banho de tecido que utiliza cerca de 50 ml de banhos de tecido; ver Tabela 2 para a receita PSS. Calcular o volume total necessário por multiplicação do número de banhos de tecido vezes o volume do banho e em seguida multiplicando pelo número de lavagens de tecidos necessários. <ol><li> Use a Tabela 2 como um guia para fazer PSS. Dissolve-se os sais em cerca de 4 L de água. NOTA: HPLC - Tipo I água é recomendado </li><li> Adiciona-se 8 ml de 1 M de solução de CaCl 2 (147 g / L de se utilizar o sal di-hidrato) para a solução, de modo que a solução final é de 1,6 mM de cálcio. </li><li> Solução PSS Quantum sufficit a 5 L. </li></ol&gt; </li><li> Pré-aqueça o sistema de banho de tecido a 37 ° C por ligar o banho de água aquecida a recirculação. Passo Crítica: Cada componente do sistema é jaqueta de água, assegurar que eles estão ligados em série uns aos outros. A direção do fluxo é crítica - garantir que os fluxos de água para cada componente com o menor conexão farpado e, ao mais alto conexão farpado. </li><li> Ligue sistema de aquisição de dados. Ligue os transdutores de força, pelo menos, 15 minutos antes do experimento para equilibrar a temperatura. NOTA: A maioria dos transdutores de força empregar medidores de tensão que são sensíveis a variações de temperatura e exibem deriva térmica inicialmente depois que a energia é aplicada. </li><li> Lançamento software de aquisição de dados e garantir a conexão com o sistema de aquisição de dados. Por favor, siga as instruções de fabricação para permitir a gravação de dados. </li><li> Certifique-se que os transdutores de força são calibrados antes de tecido é colocado no banho de tecidos e antes de gravação de dados já começou; foinstruções do fabricante Llow para calibração. </li><li> Ligue o sistema de banho de tecido a um 95% de O2 / 5% de CO 2 cilindro de gás de grau médico e verifique se há vazamentos de gás e, em seguida, pressurizar o sistema. </li><li> Encha os reservatórios de banho tecido com PSS e permitir que o tempo de solução para atingir a temperatura ideal. Primeiro o sistema e remover as bolhas de ar dentro do sistema e tubos. </li><li> Verifique aeradores de banho tecido para garantir a aeração solução consistente, que oxigena o tampão PSS e proporciona movimento browniano para distribuir drogas que serão introduzidas no banho de tecidos durante o experimento. Certifique-se de aeração / bolhas não causar o movimento do tecido, o que vai atrapalhar as gravações de dados; diminuir o fluxo de gás, conforme necessário. NOTA: O banho de tecidos e sistemas de aquisição de dados agora está pronto para iniciar a experiência. </li></ol> 2. Preparação de tecidos <ol><li> Idealmente, dissecar os tecidos a partir do animal imediatamente antes do uso e colocar directamente into PSS. NOTA: Alguns tecidos podem ser salvos no PSS noite a 4 ° C, mas os controles apropriados deve ser feito para validar a função do tecido após um armazenamento prolongado; veja Seção 6. </li><li> Use a aorta torácica como o tecido neste exercício. </li><li> Anestesiar o rato, de acordo com as diretrizes institucionais e coloque o lado dorsal do rato para baixo. Confirme anesthetization via um dedo do pé-pitada ea perda de resposta reflexa a esse estímulo doloroso. NOTA: Este protocolo utiliza 70 mg / kg de pentobarbital fornecido através de uma injecção intraperitoneal. Diretrizes institucionais para anestesia roedor pode ser diferente. </li><li> Criar um pneumotórax, criando uma incisão com tesoura ao longo do diafragma na parte inferior da caixa torácica. Em seguida, continuar a incisão da parte de baixo da caixa torácica para o esterno e bifurcar. </li><li> Dissecar fora ou colocar de lado os órgãos que estão no topo da coluna vertebral e localize a aorta, que se encontra diretamente ao longo da coluna vertebral. NOTA: Este étep fornece um espaço de trabalho claro para dissecar a aorta. </li><li> Sever todas as ligações à aorta; a partir do esófago, pulmão, etc, e cortar a aorta perpendicular à coluna vertebral ao nível do diafragma. </li><li> Suavemente segurar a aorta com uma pinça e utilize uma tesoura para dissecar a aorta a partir da espinha. Comece a dissecção na área inferior do diafragma ao lado da coluna vertebral e do trabalho em direção ao coração. Certifique-se de tomar cuidado extra para não puxar ou puxão na tecido aórtico, o que pode danificar o tecido. </li><li> Colocar imediatamente a aorta no prato dissecção preparado contendo PSS. NOTA: A dissecção da aorta em anéis é o melhor feito em um prato de dissecação que tem um silastic fundação preto. Isto permite a utilização de fios que podem ser usados ​​para canular a artéria aorta e ser fixada ao prato, proporcionando estabilidade ao mesmo tempo no prato de dissecação. O fundo preto fornece contraste que auxilia dissecção. Cuidados devem ser tomados na utilização de fios canulação como o endotelialcamada de células ial pode ser removido com um excesso de atrito do fio contra o lúmen do vaso. </li><li> Tomar um fio e fazer um pequeno ângulo de 90 ° em uma extremidade e empurrar a extremidade em ângulo para a base de silastic para ancorar o fio de guia. Coloque toda a aorta no prato dissecção. </li><li> Segurar a extremidade do fio de guia, com uma pinça, e, em seguida, passe suavemente o fio no interior do lúmen da aorta. </li><li> Use uma pinça e deslize a aorta para o fio. Quando a extremidade livre do fio de guia é visível, o fio suavemente curva e colocar a extremidade livre para a fundação de silastic do prato para estabilizar o tecido. </li><li> Usando pequenos Vannas tesoura e pinça, retire o tecido adiposo perivascular e todos os outros tecidos estranhos, coágulos de sangue, etc., até a aorta torácica aparece em branco e um pouco fibrosa. </li><li> Remover a aorta a partir de arame limpa e utilize uma tesoura para cortar em anéis da aorta, que são cerca de 3-5 mm de largura. </li><li> Inserir um anel aórtico de um de um par de tiganchos ssue por segurar o gancho e usando uma pinça para deslizar suavemente o anel no gancho. Repita este processo com o segundo gancho. Tome cuidado para garantir os ganchos não emaranhado; veja a Figura 3. </li><li> Verifique se cada gancho tem um fio de seda diferente anexado. Verificar que um gancho tem um pequeno laço de seda atado que permite a ligação de um vidro ou uma haste de aço inoxidável, enquanto que o outro é uma peça 10-4 cm de comprimento de sutura que vai ser amarrado o transdutor de força à mão; veja a Figura 3. Observação: Uma vez que a aorta é fixada aos ganchos, o tecido é preparado para ser montado no banho de tecido; veja a Figura 3. </li><li> Repita os passos de 2,14-2,15, para montar um segundo anel aórtico na segunda câmara do banho de tecido. </li></ol> 3. Colocação Tissue em Bath <ol><li> Note-se que neste sistema, os próprios banhos de tecido são estacionários. Neste momento, preencher os banhos de tecido com aquecido, PSS aerado e permitir que a solução para vir a temperature. </li><li> Com a sutura de seda, amarrar um dos ganchos na preparação de tecido para o pino na vara de aço inoxidável. Coloque este final para a câmara de banho de tecido. Ligue a vara a um stand anel e coloque a outra extremidade no prato de coloração com PSS para manter o tecido imerso em tampão; veja a Figura 3. <ol><li> Coloque a haste e tecido na câmara de banho de tecidos e certifique-se que o tecido é totalmente imerso no PSS e da haste é segura; veja a Figura 3. </li><li> Amarre a outra sutura para o transdutor de força e certifique-se de deixar uma folga na sutura entre o tecido e o transdutor de força. NOTA: Este folga vai ser removido através do ajuste do micrómetro; veja a Figura 3. </li></ol></li><li> Repita essas etapas para o segundo anel e banho de tecidos câmara aórtica. </li></ol> 4. Definir tensão passiva NOTA: Cada tecido tem um comprimento (Lo) em que células musculares lisas responder optimally. As experiências preliminares para determinar a tensão de alongamento óptimo que alcança este comprimento devem ser realizados para cada tipo de manipulação de tecidos a ser examinado. O rato aorta torácica tem uma tensão de alongamento passivo ideal de 4 g. <ol><li> Use o micrômetro / cremalheira e pinhão para aumentar a tensão de 2 g e esperar que o tecido para chegar planalto. Uma vez patamar é atingido, aumentar a tensão de 2 g e outra esperar para o tecido para estabilizar. NOTA: Nos anéis de aorta, após a tensão inicial de 2 g definiu e planalto atingido, o tecido deve então relaxar a ~ 1,6 g. Uma segunda aplicação de 2 g iria levar o tecido a ~ 3,6 g, a partir do qual o tecido novamente irá relaxar e tensão irá diminuir. Assim, depois de ter adicionado 4 g de tensão total, o software deve indicar cerca de 3,2 g de tensão. </li><li> Repita essas etapas para o segundo anel e banho de tecidos câmara aórtica. </li></ol> 5. Equilíbrio e Confecção de Drogas <ol><li> Equilibrar a tecido para60 min após a aplicação de tensão passiva para o tecido. </li><li> Durante a fase de equilíbrio, lavar o tecido a cada 15-20 min. Escorra o banho de tecidos e substituir o PSS com PSS de um reservatório aquecido. NOTA: Durante este tempo, o tecido irá relaxar, o que é indicado pela perda de tensão passiva. </li><li> Durante este tempo, preparar medicamentos para o experimento, que necessitam de ser de pelo menos 1000 vezes mais concentrada que a concentração real no banho, de modo que apenas um pequeno volume da reserva de fármaco necessária para atingir a concentração desejada. </li></ol> 6. desafio inicial <ol><li> No final do período de equilíbrio, lavar o tecido um tempo final, com excepção de dados, e re-zero de todas as entradas. </li><li> Escolher um agonista (composto que irá provocar a contracção activo) ao qual o tecido responde. NOTA: No rato aorta torácica, o músculo liso arterial irá contrair ativamente para um agonista do receptor adrenérgico alfa devido à inervação dotecido pelo sistema nervoso simpático. Um agonista adrenérgico não seria útil em tecidos intestinais dado que os agonistas adrenérgicos causar relaxamento. Neste caso, um agonista de receptor, tais como acetilcolina (receptor colinérgico) poderia ser utilizado. Uma alternativa para a fenilefrina e a acetilcolina é a utilização de um agonista não-receptoras tais como níveis elevados de potássio (K) como o primeiro desafio. No músculo liso, K elevado opera para indirectamente os canais abertos de cálcio e, portanto, vistos como um índice geral da integridade do músculo liso. <ol><li> Execute o primeiro desafio ou o desafio de despertar pela adição de 10 -5 M fenilefrina ao banho de tecidos. Para atingir esta concentração em 50 mL de banho de tecidos, adicionar 50 ul de uma solução de fenilefrina 10 -2 M. NOTA: 50 ul em 50 ml de PSS é uma diluição 1 / 1.000, de modo que a concentração final é de 1.000x inferior a lingua, ou 10 -5 M. Conhecimento de volume e manutenção constante do volume dentro do banho de tecido cHamber é crítico para a determinação da concentração final da droga. </li></ol></li><li> Adicionar 10 -5 M fenilefrina ao banho de tecidos e permitir a contracção de pico e, em seguida, planalto, quando a inclinação dos dados torna-se zero. Certifique-se de gravar cada evento experimental para auxiliar a análise pós-experimental. </li><li> Depois de planalto, lave o agonista para fora completamente por esvaziamento eo reenchimento da câmara de banho de tecido com o novo PSS. Certifique-se de registrar esses eventos também. NOTA: A regra de ouro é que a concentração de agonista no banho é reduzida 10 vezes com cada lavagem. Embora, mais do que 3-4 lavagens podem ser necessários para pôr o tecido de volta para baixo para o seu tom de linha de base de equilíbrio (tensão). </li><li> Deixe o resto do tecido em tom de linha de base para ~ 10 min antes de prosseguir. </li></ol> 7. Experiment NOTA: Prazosin, um antagonista dos receptores adrenérgicos alfa, será apresentado à câmara de banho de tecido para mudar a resp concentraçãocurva onse à fenilefrina (PE); este é um antagonismo demonstrável. <ol><li> Para um banho, adicionar o veículo (H 2 O) em que prazosina foi dissolvido. Para outro, adicione a concentração adequada de prazosin. Neste exemplo, adicionar 25 uL de veículo a um banho e 25 ul de 10 -5 M de concentração prazosina para o outro para obter um 5 x 10 -9 M ou uma concentração de 5 nM no banho. NOTA: Embora a adição de veículo parece desnecessária neste exemplo, é imperativo fazê-lo quando se utiliza outros veículos que têm um potencial para ser vasoactivo (por exemplo, DMSO, etanol, acetato). Adicione o veículo correspondente, mesmo que pouca evidência existe para que seja vasoativas. </li><li> Deixar veículo / prazosina nos banhos e não lavar o tecido durante 1 hora. <ol><li> Embora os tecidos são equilibrante, preparar várias concentrações de agonista (PE). Incluem uma vasta gama de concentrações, a partir das concentrações que não induz qualquer resposta (por exemplo, &lt;/ Em&gt; 10 -9 M PE) para concentrações que ultrapassam a resposta máxima (por exemplo, 10 -4 M PE). Desde curvas concentração-resposta são logarítmicas na natureza, fazer seis soluções separadas banco de PE (10 -6 -10 -1 M) através de diluições em série a partir da solução estoque 10 -1 M. Certifique-se que o volume necessário para cada concentração é ligeiramente maior do que o triplo do volume total necessário para todos os banhos (ie&gt; 300 ul). </li></ol></li><li> Continuar a adição de agonista, como descrito na Tabela 1. NOTA: Esta experiência vai gerar uma curva de resposta concentração cumulativa ao PE; cada iteração leva em conta a quantidade de substância já adicionado ao banho. Adições ocorrer até que já não aumentar a contração, ou de toda a curva atingiu patamar. <ol><li> Adicionar a cada concentração de droga individualmente até que o limite do tecido é alcançada. </li><li> Se não houver mudança, adicionar o próximo concentração nosérie; ver Tabela 2. NOTA: O calendário destas adições depende do agonista utilizado. Por exemplo, norepinefrina e contração fenilefrina se desenvolve rapidamente, e deve platô em poucos minutos. Em contrapartida, a endotelina-1 contração desenvolve lentamente e pode não planalto para perto de 45 min. Outra experimentação pode ser feito sobre o tecido, após a construção de uma curva, tal como este, desde que (1) a substância lavagens para fora; e (2) que possa ser demonstrado que o tecido volta ao comportamento normal contrátil e não é afetado pelos estímulos anteriores. </li></ol></li></ol> Análise 8. Dados <ol><li> Certifique-se de salvar os dados imediatamente antes e depois de uma intervenção (por exemplo, acordar ou curva cheia). </li><li> Encontrar e definir a linha de base do tecido para cada canal de câmara / input banho de tecidos, o que ajudará na análise de dados. </li><li> Uma vez que a linha de base é definida, encontrar a resposta máxima para cada concentração, e registrar o change a partir da linha de base. Sequencialmente percorrer cada uma das concentrações e registrar a mudança de linha de base. </li><li> Gráfico os dados resultantes. Fazei isto em qualquer programa gráfico. NOTA: Graph Pad Prism é concebido para farmacologista, e este é ideal para o tipo de experiência aqui apresentada. </li></ol>

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Authors have nothing to disclose.

Medição da força isométrica como ferramenta de pesquisa é mais de 150 anos, mas continua a ser a técnica de protótipo para caracterização receptor em tecidos contráteis 2. O poder desta técnica é, na sua simplicidade e versatilidade: por gravação respostas induzidas por concentrações crescentes de agonista na presença ou ausência de um antagonista, uma miríade de informação pode ser derivada sobre as características farmacológicas de cada fármaco e o receptor ao qual se liga-se 3-5. As experiências deste tipo também reunir informação sobre o competitivo contra a natureza não competitiva dos antagonistas utilizados, bem como a heterogeneidade dos receptores e efeitos de drogas não-específicos 6-8. Assim, com permutações simples para este banho de tecido isolado experimento, um perfil farmacológico relativamente completa dos receptores que medeiam a contracção muscular induzida pelo agonista pode ser gerado. Em termos de agonismo, the eficácia relativa (E max) e a potência (EC50) de um agonista de um dado tecido pode ser calculado e comparado com as respostas de outros agonistas no mesmo tecido 1. Na nossa experiência, a aorta torácica do rato foram incubados com veículo ou o α 1 adrenérgico prazosina antagonista do receptor (5 nM), durante uma hora antes da adição do agonista adrenérgico α 1 fenilefrina ao banho de tecidos e geração de contracção. A Figura 2 apresenta os resultados modificado da Figura 1. As respostas verdes foram marcados com a contracção máxima conseguida pela PE marcado como máximo, a contracção máxima ½ marcada como tal e, em seguida, associadas com a concentração do PE que causou que a resposta. A identificação destes valores é a determinação da concentração eficaz de um agonista que consegue uma resposta max metade (50%) ou o valor de EC 50. Infelizmente, o uso do parâmetro dependente do agonistas sozinha para determinar as características de ligação ao receptor pode ser complicado 9. Idealmente, experiências adicionais utilizando antagonistas do receptor de permitir o cálculo dos dois parâmetros importantes que são a chave para definir a interacção entre um fármaco e um receptor: a 10 -log da dissociação antagonista constante (pK B) e 10 a -log molar do antagonista concentração necessária para induzir um duplo desvio para a direita na curva de concentração-resposta (pA 2) 10. Ambos K B e pA 2 ganho a sua utilidade a partir do fato de que eles são valores independentes de agonistas, e permanecer constante, mesmo entre diferentes tecidos 11. A partir dos dados na Figura 2, pK B pode ser calculado usando a equação seguinte, com base em valores de EC50 calculados em outros lugares: CE 50, na ausência de prazosina = 2 x 10 ~ 8 M CE 50 no présença de prazosina = 7 x 10 -6 M Resolver para K B na equação seguinte: log (dr-1) = log [B] - log K B Onde: [B] = concentração de antagonista, ou 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8.3 dr = relação dose de valor EC 50 na presença de antagonista / CE de 50 de ausência. Se houver um desvio para a direita, este valor irá ser maior do que um. Assim: dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M ou 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350 Substituindo [B] e dr: log (350-1) = -8 - log K B 2.54 = -8 - log KB pK B = 10,54 Este valor para o prazosin é consistente com os valores obtidos com prazosin interage com um α 1 adrenérgico receptou 12,13, sugerindo que o receptor adrenérgico fenilefrina para mediar a contracção é o receptor adrenérgico α 1. Vários passos são fundamentais para o sucesso desses experimentos. Os tecidos devem permanecer no PSS após a dissecação para evitar a perda de viabilidade do tecido. Qualquer preparação muscular isométrica tem uma relação comprimento-tensão ideal que gera força máxima contra tensão passiva 14,15. Para o experimento descrito neste protocolo, tensão passiva ótima foi previamente determinado pela soma brevemente incrementos de 0,5 g de tensão passiva ao tecido. O tecido deve começar sem tom e, em seguida, após 30 minutos de equilibração, o tecido foi desafiada com uma concentração máxima de KCl (80 mM), o que gerou tom activo. Em seguida, o tecido foi lavado e deixou-se voltar à linha de base tom. Depois de 15 min na linha de base, um outro 0,5 g de tensão passiva foi colocada e este processo foi repetido até que um patamar detensão ativa foi conseguido com tensão passiva adicional. Em experiências preliminares, 4 g no total de tensão passiva foi determinada para alcançar geração de tensão máxima activo em anéis de aorta e, assim, esta quantidade total de tensão é colocado sobre os anéis antes de equilibração. Em termos processuais, é melhor a zero aplicação tensão passiva antes, mas pode ser feito a qualquer momento antes do experimento. Excesso de alongamento dos tecidos, em qualquer ponto do experimento ou dissecção, vai impactar negativamente a viabilidade do tecido e os resultados experimentais. Isto é mais imperativo ao colocar no banho de tecidos, como este passo tem a maior probabilidade de estiramento excessivo. Lavagem adequada, em número e duração é necessária para efeitos reprodutíveis. Um segundo desafio muito cedo depois de um desafio inicial, ou antes de tecidos voltaram a tensão da linha de base, irá resultar em respostas aberrantes. Se estudar antagonistas / inibidores reversíveis, tecidos não deve ser lavado antes de ser agonista disso, como o inhibiconcentração tor vai ser diminuída. Há vantagens notáveis ​​e desvantagens para os isolados ensaios de banho de tecido. Desvantagens: Os tecidos podem experimentar diferentes graus de danos durante a remoção cirúrgica ou a colocação de anéis em ganchos. Uma vez que a célula endotelial é o revestimento interno do anel da aorta, é preciso ter cuidado com o posicionamento do anel de ganchos, de modo a não danificar a camada de células. Os tecidos também podem ter distintamente diferentes períodos de tempo em que eles são viáveis ​​no banho de tecido, e isto tem que ser determinado; nem todos os tecidos são o mesmo. Ao longo destas linhas, tecidos podem mudar em sua capacidade de resposta ao longo do dia de tal forma que os controles de tempo tornar-se um controle necessário para cada experimento. Um bom exemplo disto é a traqueia da cobaia que melhora máximo em contractilidade de 100% durante uma experiência típica 8 h. As drogas que são pouco solúveis em água pode precipitar no PSS. Finalmente, um acumuladond adições não-cumulativas de uma droga que é um agonista pode resultar em resultados diferentes se ocorrer dessensibilização do receptor para o agonista; angiotensina II é uma dessas drogas que mostra taquifilaxia rápidas. Vantagens: Uma das principais vantagens de experimentos banho de tecidos é que é em tempo real; pode-se ver a experiência que se desenrola e pode rapidamente tirar conclusões e planejar os próximos passos, bem como solucionar problemas durante um experimento. Um experimento leva um dia para fazer. Vários tecidos podem geralmente ser preparados a partir de um animal tal que o animal possa servir como o seu próprio controlo, e que aumenta a resistência a um experimento. Pode-se também isolar o tecido a partir de outros factores, a fim de testar uma resposta relativamente puro do tecido à droga. Em experiências in vitro, tais como o sistema de banho de tecido também permitem o uso de uma pequena quantidade de fármaco em comparação com uma experiência in vivo. O delineamento experimental básico aqui descrito pode serextensivamente modificado para permitir o registo dos parâmetros adicionais ou a introdução de outros estímulos externos. Por exemplo, além de permitir que os eléctrodos para a estimulação do campo eléctrico de nervos inervação 16,17. Com a adição de sondas térmicas ou de pH, os efeitos da temperatura e do pH sobre as respostas contrácteis também pode ser medido 18,19. Da mesma forma, o oxigênio pode ser substituída total ou parcialmente com N 2 para avaliar os efeitos induzidos pela hipóxia. Além disso, os mesmos princípios básicos de medição contractilidade isométrica utilizados neste vídeo pode ser utilizada para desenvolver sistemas que permitem a medição simultânea de desenvolvimento e alterações da tensão isométrica em 20 cálcio intracelular. A transdução do sinal é também prontamente estudados, uma vez que existem sistemas que podem congelar rapidamente uma amostra de tecido durante uma resposta, de modo que a actividade de um sistema de via de transdução de sinal pode ser verificada bioquimicamente. A variação de equipment que pode ser usado para fazer isso é enorme. Este sistema todo, qualquer mão construídos ou automatizado, pode ser comprado a partir de várias empresas diferentes. Os banhos de tecido e titulares de tecido utilizados neste protocolo foram (banhos de tecido) e mão construído (titulares)-blown mão por um in-house oficinas mecânicas da Universidade Estadual de Michigan.

A disciplina de farmacologia tem usado o sistema isolado banho de tecidos para mais de 150 anos. A versatilidade deste sistema permitiu aos cientistas em todo o mundo para caracterizar os receptores de transdução do sinal do receptor e, com este conhecimento formando a base de terapias que têm tratados milhões de indivíduos com doenças ou distúrbios, tais como hipertensão, insuficiência cardíaca, diabetes, doença gastrointestinal, a bexiga disfunção, asma, e os transtornos de deglutição, para citar apenas alguns. Até hoje, o banho de tecido isolado permanece uma importante faceta do desenvolvimento da droga e pesquisa de base, uma vez que permite que o tecido para funcionar como um tecido. Nesta lição JoVE, um protocolo formal é partilhada para demonstrar uma experiência visual e virtuais utilizando os dados a partir de um tecido isolado experimento banho que mede a contracção isométrica, que permite a caracterização do receptor. A principal vantagem desta técnica é que o tecido vivo é umnd funções como um tecido de todo, com um resultado fisiológico (contracção ou relaxação) que é relevante para o corpo. É uma síntese de etapas (de interação droga-receptor, de transdução de sinal, de segunda geração messenger, alteração na excitabilidade do músculo liso, e mudanças em função do tecido). Enquanto outras técnicas de permitir o estudo de cada um destes passos (por exemplo, ligação de radioligandos para a afinidade da droga, a medição de segundos mensageiros), o banho de tecido isolado técnica permite a integração de todos estes passos 1. Outra vantagem é o facto de conservar a função do tecido permite o cálculo de variáveis ​​farmacológicas importantes que são mais significativo num tecido contra um ambiente celular; se aproxima mais como as drogas analisadas iria trabalhar no corpo como um todo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td></td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerLab (4 channel)&#160;</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadBridge (4 channel)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML112</td>
			<td>ML112</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Adapter Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC11</td>
			<td>MLAC11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Force-Displacement Transducer</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>FT03</td>
			<td>FT03</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Transducer Cable</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>TAC-7 REV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BNC to BNC Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IsoTemp 2100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>IC-2100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Bath</td>
			<td>Multiple Sources&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Physiological Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Silk Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7615</td>
			<td>SP104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring Stand</td>
			<td>Humboldt MFG Co</td>
			<td>H-2122 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Dishes</td>
			<td>Handmade with Silicone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>63010-100</td>
			<td>R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hose Clamps</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co</td>
			<td>06832-08</td>
			<td>SNP-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Muscle Bath</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Warming Chambers</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas Dispersion Tube</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7202-06</td>
			<td>7202-02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Custom Stands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Three-Prong Clamps</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Connector</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Hooks</td>
			<td>Hand Made in House</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Stereomicroscope MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>10447254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12562-36</td>
			<td>12562-36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Petri Dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td>7740 Glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 170 Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-150</td>
			<td>160-150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Splinter &#38; Fixation Forceps</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-55</td>
			<td>160-55</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

Em termos de agonismo, a eficácia relativa (E max) e a potência (EC50) de um agonista de um dado tecido pode ser calculado e comparado com as respostas de outros agonistas no mesmo tecido 1. Na nossa experiência, a aorta torácica do rato foram incubados com veículo ou antagonista do receptor adrenérgico prazosina α 1 (5 nM) durante uma hora antes da adição do agonista adrenérgico α 1 fenilefrina ao banho de tecidos e geração de contracção (Figura 1). A figura 2 apresenta modificado resultados da Figura 1. As respostas verdes têm marcado a contração máxima atingida pelo PE marcado como max, a contração máxima ½ marcado como tal e, em seguida, associado à concentração PE que causou essa resposta. A identificação destes valores é a determinação da concentração eficaz de um agonista que consegue uma resposta max metade (50%) ou CE <sub&gt; 50 valor. Este foi donegraphically neste example.Computer software que usa funções logísticas para uma curva sigmoidal pode ser usado para o ajuste de curva e de cálculo de valores de EC 50. Na geração e interpretação destes resultados, é importante o uso de ambas as concentrações baixas e elevadas de agonista para criar a curva de concentração-resposta. Sem pontos suficientes para mostrar uma linha de base estável e máxima planalto, EC 50 e E MAX só pode ser estimado. Isto foi feito graficamente neste exemplo. O software de computador que usa funções logísticas para as curvas sigmoidais pode ser usado para ajuste de curva e cálculo dos valores de EC50. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Esquemático representando tecido de banho dos desenhos um anel de tecido colocado na parede dupla, com camisa de água de tecido de bath. Tampão de entrada e saída são regulados por uma torneira de passagem de 3 vias de vidro integradas na base da câmara. O2 / CO2 é borbulhado através de um arejador que está selado com uma junta de vedação para evitar fugas de gás ou PSS. Recirculação de entrada é inferior à saída de recirculação para manter adequada e evitar a formação de bolsas de ar que causariam temperatura desregulação. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Rat Aorta Torácica + Endothelium A figura acima mostra quatro experimentos distintos (diferentes animais e realizados por diferentes pesquisadores em diferentes set ups como representados por cores diferentes) para testar a capacidade de prazosin para deslocar uma contração induzida-PE. Prazosin (5 milhas náuticas) claramente deslocado para a direita da curva de contração induzida pelo PE em paralelo. Figura 3: Rato Aorta Torácica + endotélio estimativa gráfica de valores de EC 50 para o PE na ausência (veículo) e presença (prazosina) de antagonista.. Linha Verde (grupo C) só é marcado. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sal </td><td> MW (g / mol) </td><td> 5 Litros </td><td> MM FINAL </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (g) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,45 </td><td> 37.99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 1.75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136,1 </td><td> 0,8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> MgSO4• 7h20 </td><td> 246,5 </td><td> 1,45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,21 </td><td> 6.25 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> 180,16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0,05 </td><td> 0,03 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Normal Physiological Solução Salina (PSS) da receita Conteúdo do PSS tamponada com bicarbonato usado neste experimento.. Incluem-se os pesos moleculares de todos os sais e a quantidade adicionada a 5 L de dH2O para obter a concentração desejada. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Concentração no banho </td><td> A adição de agonista feito para banho </td></tr><tr><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 50 ml de 1 x 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -9 M </td><td> 100 ml de 1 x 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 35 ml de 1 x 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -8 M </td><td> 100 ml de 1 x 10 -5 </td></tr><tr><td> 1 x 10 -7 M </td><td> 35 ml de 1 x 10 ~ 4 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -7 M </td><td> 100 ml de 1 x 10 ~ 4 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -6 M </td><td> 35 ml de 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -6 M </td><td> 100 ml de 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 35 ml de 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -5 M </td><td> 100 ml de 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -4 M </td><td> 35 ml de 1 x 10 M -1 </td></tr></tbody></table> Tabela 2:. Tissue banho Aditivo Agonista Concentrações A quantidade de agonista a ser adicionado a cada banho de próPerly construir curvas de concentração-resposta cumulativas. A concentração do banho desejado é conseguido através da adição de quantidades sequenciais de concentrações crescentes de agonista. Cada adição leva em conta a concentração de agonista já presente no banho. Isto é feito para minimizar o aumento de volume no banho de tecido que resultam da utilização de volumes crescentes de uma única concentração de agonista.

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Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

measurement-smooth-muscle-function-isolated-tissue-bath-applications

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Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

135.8K visualizações.  Michigan State University. This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition. 

Vídeo: Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focal Ca 2 + Detecção de transitórios no músculo liso

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Biologia

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

O Mouse Preparação Muscle Cremaster for Imaging intravital da Microcirculação

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...