Agradecemos a outros membros da equipe iGEM INSA-Lyon ENS (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Ly Goki, Thomas Poinsot, Beryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon e Valérie Desjardin), os nossos patrocinadores pelo apoio financeiro (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon e do Departamento de Biociências INSA-Lyon), F. Wisniewski-dye para a leitura crítica do manuscrito e Sze Dr. CC para o presente de tensão. B. Drogue recebe um Ph.D. bolsa da região Rhône-Alpes.

1. Biotijolo Design e Síntese do Operon Curli <ol><li> Determinar a organização genética e localizar os sinais endógenos de transcrição e tradução dos genes curli. Estas informações são recolhidas em bancos de dados especializados, como RegulonDB um ou EcoGene b e completado por uma leitura cuidadosa das publicações pertinentes. Gestão de dados e em preanalysis silico foram realizados com Clone Gestor de software c. </li><li> Selecionar as seqüências de codificação pertinentes. Um conjunto de cinco genes absolutamente necessários para a síntese curli (CSGB e monómeros de fibra csgA de codificação) e exportação (CSGE csgF e csgG, que codifica o complexo de secreção Curlin) foram seleccionados para construir o operão sintético. Extrair as sequências escolhidas a partir da base de dados no formato FASTA. À medida que o aglomerado é csgGFE antisense em E. genoma coli, converter esta sequência para o seu complemento inverso counterparte usando as ferramentas Clone Operations Manager&gt; molécula de Processo&gt; Inverter molécula. Cole a seqüência csgEFG trás csgBA usando a função &quot;ligadura&quot; (Clone&gt; ligadura). </li><li> Adicionar o promotor apropriado. Ao colocar os cinco genes selecionados curli sob o controlo do promotor P rcn, curli são previstos para ser sobre-produzido na presença de cobalto e níquel. O locus rcn codifica uma bomba de efluxo responsável por Ni e Co desintoxicação (rcnA) e seu cognato metalo-regulador (rcnR). RcnR controla a expressão de rcnA e seu próprio gene em resposta a Ni e Co 19. A sequência compreendendo rcn CDS rcnR, a região intergénica rcn inteiro mais os 41 primeiros nucleótidos rcnA foi placedin frente da sequência csgBAEFG quimérica (Figura 1, a sequência do construto inteiro é fornecido como os dados suplementares). </li><li> Otimizar o transcricionalsinais. Um sítio de ligação ao ribossoma perfeita (ou perfeito RBS = AAGGAGGTATATA) foi adicionado na frente do primeiro ATG da sequência de DNA csgBA. Um segundo RBS perfeito foi adicionado na frente da sequência de csgEFG. RBS endógeno para o CSGB e genes csgF e csgG foram conservados. </li><li> Para ajustar as normas iGEM, o dispositivo deve ser acompanhada por um prefixo e sufixo biotijolo padrão, contendo sítios de restrição para EcoRI, Pst I (prefixo) e Spe e Xbal (sufixo). Colar as sequências correspondentes em cada extremidade do dispositivo d. </li><li> Eliminar qualquer Eco RI, Pst I, Spe I e Xba I no sítio de reconhecimento do dispositivo. Para facilitar o processo de montagem adicional, a parte biotijolo si não pode conter qualquer um destes sítios de restrição. In silico análise de restrição do dispositivo revelou um local Pst I na sequência csgA, um local Pst I na sequência rcnRe um local EcoRI no gene CSGE. Estes locais são, respectivamente, localizados em posição 80 (Mut1), 1340 (Mut2) e 1830 (Mut3) da sequência de dispositivos (dados adicionais) e foram modificadas como se segue por mutações silenciosas. Mut1 Pst I CTGCAG local alterado no CGTCTG Mut2 Pst I CTGCAG local alterado no CAGCAG Mut3 GAATTC sítio Eco RI mudado em GAATT </li><li> Executar através da simulação de tradução usando o software Gerenciador de Clone (&gt; Operação moléculas de processo&gt; moléculas de traduzir). Usar a sequência de programa de alinhamento BLAST para verificar a homologia perfeita entre o tipo selvagem de proteínas curli e as proteínas codificadas pelo operão sintético. </li><li> Peça o operon sintético. Serviços comerciais de síntese de genes estão disponíveis a partir de inúmeras empresas em todo o mundo, o nosso parceiro foi Genecust (Luxemburgo). 4 ug do operão artificial (3165 pb) foram recebidos semanas mais tarde e inserido em pUC57 (pIG2). </li></ol>2. Visualizar e quantificar bactérias aderentes em poliestireno <ol><li> Encher cada poço de uma placa de poliestireno com 24 cavidades com 2 ml de meio mínimo M63 (glucose a 0,2%) e inocular cada poço com 106 células de uma cultura durante a noite. Crescer as bactérias a 30 ° C, durante 18 a 48 horas sem agitação. Cada coluna (4 poços) representa uma modalidade. Adicionar a quantidade adequada de cobalto (25 a 100 mM) e antibióticos (ampicilina 100 gL-1), quando necessário. As três primeiras linhas da placa de 24 cavidades são usadas para quantificar as bactérias aderentes através da média das três repetições, do lado esquerdo da última linha é utilizada para visualizar o biofilme. </li><li> Para as três primeiras filas da placa de 24 poços: para cada poço, recuperar o sobrenadante que contém as células planctônicas. </li><li> Lavar cuidadosamente cada poço com 1 ml de M63 e a piscina de lavagem com 1 ml do sobrenadante inicial obtido em 2.2). Este conjunto é referido como células de natação (= S). </li><li> Recuperar o biofilme em 1 ml of M63 por raspagem e pipetando para cima e para baixo (= B). Vortex 15 seg. Estimativa do número de bactérias na superfície anexas e nadar a partir da densidade óptica a 600 nm (OD600) para dar a percentagem de adesão correspondente a cada uma das modalidades. </li><li> A percentagem de aderência é calculada utilizando a fórmula: BX100 / (3xs + B). </li><li> Apenas para a última linha da placa de 24 poços: descartar células planctônicas. </li><li> Enxaguar com 1 ml de M63 o biofilme que se desenvolveu sobre a parte inferior da placa. </li><li> Secar a placa aberta, durante 1 hora a 80 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de violeta de cristal a 20% durante 2 minutos, em cada poço seguido por lavagens extensas com água para visualizar as bactérias da superfície inscritos. Três ensaios independentes (placas) devem ser realizados para garantir a reprodutibilidade. </li></ol> 3. Visualize bactérias aderentes no vidro por Microscopia <ol><li> Obter um chassi fluorescente. O E. coli estirpe e que SCC1 constitutively expressa a proteína verde fluorescente (GFP) com nenhuma diferença observável a partir da estirpe MG1655-mãe 20 é um hospedeiro adequado para o rolamento do plasmídeo sintético curli operon. </li><li> Transformar SCC1 com o plasmídeo pIG2 (= sintético curli operon inserido no EcoRI / PstI local do plasmídeo pUC57) para se obter a estirpe S23. Transformar SCC1 com um plasmídeo de controlo (pUC18) para se obter a estirpe de controlo S24 21. </li><li> Crescer durante a noite precultura do S23 e do controlo (S24) estirpes a 30 ° C em meio M63 suplementado com glucose (0,2%) e ampicilina (100 gL-1). </li><li> Inocular 15 ml do mesmo meio, em placas de Petri com 100 ul da pré-culturas. Adicionar a concentração adequada de cobalto (isto é, 25 M) e não se esqueça do controle negativo sem cobalto. Apresente três lamela de vidro retangular em cada placa de Petri. Incubar durante a noite a 30 ° C sem agitação. </li><li> Retirar as lamelas from prato Petri e cuidadosamente drená-lo. Limpe cuidadosamente a parte inferior do rosto com um material de algodão pequena impregnada com etanol a 70 °, limpando fora de cada resíduo bacteriana. Para a observação confocal, limpar ambas as extremidades superiores em alguns milímetros para possibilitar a fixação adicional da lamela. </li><li> Bactérias aderentes pode ser visualizado directamente, mas rapidamente sob o microscópio de fluorescência, mas cuidadosamente evitar a secagem da amostra. </li><li> Para a observação confocal, depositar a lamela numa lâmina de vidro com a face superior coberta pelo biofilme colocada com a face para cima. O biofilme é então coberta com uma lamela de maior, a qual é fixada à lâmina de vidro com verniz. Inverta a configuração de modo a que o biofilme será agora na face inferior. </li><li> Coloque a configuração sob o microscópio confocal a laser. Um direito Axioplan2 LSM510 (Zeiss) microscópio confocal a laser foi usado no f plataforma Platim. </li><li> Definir. GFP excitar a 488 nm, e recolher a fluorescência bacteriana no intervalo 500-600 nm<html> . Use objetiva de imersão 40x óleo para a aquisição de imagens em modo de varredura a laser confocal. Digitalizar os totais estruturas tridimensionais dos biofilmes da superfície sólida para a interface com o meio de crescimento, utilizando um passo de 1 um. </li><li> Realizar projecções tridimensionais com IMARIS software (bitplane, Zurique, Suíça). Determinar a espessura do biofilme por meio da análise do valor médio ao longo de z estatísticos secções longitudinais. Quantificação de biovolumes biofilme pode ser extraído a partir de confocal z pilhas como descrito em outro lugar 22. </li></ol> um RegulonDB fornece informações sobre mecanicista operon organização e a sua decomposição em unidades de transcrição, promotores e seu tipo sigma, os genes e os seus locais de ligação ao ribossoma, terminadores, sítios de ligação dos reguladores transcricionais específicos, bem como a sua organização em frases de regulação.et = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp b O banco de dados EcoGene contém informações atualizadas sobre o E. coli K-12 genoma e proteoma, incluindo seqüências de genes extensas bibliografias. Um foco EcoGene principal foi a reavaliação dos locais de início de tradução. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> c <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> d <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> e Gift of Chun Chau Sze, Nan Yang Technical University, de Cingapura. f Platim microscópica plataforma UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Etapas críticas O passo mais crítico nesta abordagem de biologia sintética é o design gene. Projeto gene sintético tem que ser meticuloso para assegurar um sistema de produção eficiente. Dois genes que codificam para os monómeros de fibra e três genes que codificam para proteínas envolvidas no seu sistema de secreção foram montados com um promotor forte e indutivel de metal para criar uma nova unidade funcional para uma aplicação nova: a bio-descontaminação de efluentes nuclear....

A aderência bacteriana ao suporte abiótico desempenha um papel importante em células de combustível biocatálise biorremediação, ou microbiana. Processos de biorremediação utilizar as capacidades dos microorganismos para degradar as substâncias orgânicas, ou para modificar a distribuição de metal (volatilização imobilização) ou especiação. Essas atividades benéficos são observados em ecossistemas aquáticos e terrestres, mas também nos sistemas artificiais desenvolvidos para tratar a água poluída de resíduos industriais e domésticos. A intensidade e a qualidade da actividade microbiana dependem factores físico-químicas, mas também sobre o estilo de vida dos microrganismos (flutuante ou incorporado em biofilme). A formação de biofilme está associada a um metabolismo, resistência a biocidas, por diversos mecanismos. Este fenômeno, portanto, ser incentivado na maioria dos processos de biorremediação. Além disso, as células de engenharia de Escherichia coli para controlar a formação de biofilme tem sido aplicado com sucessoimobilizar células inteiras sensores em biochips 2-3. Adaptação dos microrganismos a uma elevada concentração de metais ocorre por meio de diversos mecanismos, tais como a adsorção aos componentes da matriz extracelular, a activação da bomba de efluxo ou transportadores específicos capazes de concentrar o metal para dentro da célula. Impulsionando estas actividades bacterianas através da engenharia genética permite o tratamento eficaz e barata de poluição de metal, à escala laboratorial, em especial no caso de metais altamente tóxicos em quantidade fraca, tal como descrito por Raghu et al. 2008 4. Descontaminação bacteriana representa, neste caso, um método de poupança competitivos e de custo em comparação com os processos químicos clássicos, usando resinas de permuta iónica. Os autores descreveram uma E. chassis coli geneticamente modificada para a absorção e retenção de cobalto primeiro batendo para fora da bomba de efluxo de codificação do gene rcnA, e, em seguida, através de transformação com uma cópia múltipla a superprodução de um plasmídeo que permitatransportador com a absorção preferencial de cobalto. tal estirpe surge como uma alternativa eficiente para resinas de permuta iónica para o tratamento de efluentes radioactivos, mas um problema por resolver é a recuperação de bactérias contaminados no final do processo 4. O objetivo do nosso trabalho foi, portanto, de projetar uma cepa de design personalizado capaz de furar a suportes abióticos, como vidro ou plástico. Entre o conjunto de adesinas e as fímbrias aderentes identificadas em bactérias Gram-, optamos por projetar um sistema que permita a produção curli. Curli são fibras amilóides finas (2-5 mm de diâmetro) e altamente agregadora que se projetam a partir do E. coli e Salmonella de superfície como uma matriz não cristalina e insolúveis 5-7. Curli também estão envolvidos na colonização de superfícies abióticas e para o desenvolvimento de biofilmes 8. Curli foram recentemente mostrado para ligar iões de mercúrio 9. Amilóides são de facto conhecidos por possuir altaafinidade por íons metálicos como Cu 2 +, Zn 2 + e Fe 3 + 10. Essa propriedade pode melhorar ainda mais a descontaminação de metais de efluentes poluídos. O cluster csg é responsável pela produção de fibras curli e é constituído por dois operões divergentemente transcritos (Figura 1). O CSGB, csgA e genes csgC constituem o operão sentido, que codifica as duas subunidades, curli CsgA e CSGB. CsgC parece ser envolvidos na atividade redox dentro do sistema biogênese curli e afetar o comportamento dos poros CsgG 11. No entanto, a ausência de csgC na maioria dos curli bactérias produtoras indica que a proteína correspondente fornece apenas um nível secundário de controlo sobre a biogénese curli. Para simplificar o sistema, foram escolhidos para trabalhar com o número mínimo de genes. O csgDEFG operonencodes proteínas essenciais na regulação e transportede CsgA CSGB e para a superfície da célula. CsgD é um activador da transcrição do operão csgBAC e desempenha um papel fundamental no controlo da formação de biofilme, controlando a produção de fímbrias curli e componentes de biofilme, tais como a celulose 12 e inibindo a produção flagelo 13. CSGE, CsgF CsgG e constituem um aparelho secretor curli específicos na membrana exterior, através da qual a grande subunidade de proteína curli CsgA é segregada como uma proteína solúvel. A polimerização de CsgA é dependente in vivo sobre a ligada à membrana da proteína nucleador CSGB (revisto em 14). Complexos envolvendo várias vias reguladoras de dois componentes de sistemas têm sido mostrados para controlar a expressão do gene curli 15-16. Estes regulamentos complexos permitem que as bactérias formam biofilmes grossas através da produção curli em resposta a sugestões ambientais, mas são difíceis de controlar para aplicações industriais. Para facilitar a recuperação da metal-enchido bactérias durante um processo industrial, a fixação das bactérias a um suporte sólido, de facto tem de ser controlado pelo parâmetro bem definido (s). As propriedades aderentes da curli estão ligados à sua natureza amilóide 17 e poderiam ser utilizados para melhorar os processos de biorremediação, mas um dispositivo simples e facilmente controlada tem de ser criado. Entre estes genes 7 18, um conjunto de 5 absolutamente necessário genes para a síntese de curli (CSGB e monómeros de fibra csgA de codificação) e exportação (CSGE csgF e csgG, que codifica o complexo de secreção curli) foram seleccionados para construir o operão sintético. Para escapar à regulação &quot;natural&quot; de curli, um operão sintético compreendendo esses genes CSG 5 sob o controlo de um promotor forte e overinducible-cobalto (Figura 2) foi desenhado e sintetizado. A análise passo-a-passo da região de codificação de curli e o procedimento para a criação de um syn funcionaltético operão são descritos. Dois métodos para visualizar e quantificar a aderência bacteriana ao poliestireno e vidro são explicados.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (pMB1 ori, 2710 bp) com um fragmento EcoRI de 3165 pb / PstI contendo o sintético P rcn - csgBAEFG operão; Ampr </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Multicópia plasmídeo (pMB1 ori, 2686 pb), Amp r </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP-tagged MG1655, dom de Sze CC) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl2 </td><td> Sigma </td><td></td><td> Solução 0,1 M de ações mantidas em temperatura ambiente </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> Placa de 24 poços </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> De poliestireno de 24 poços </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

O método descrito aqui consiste em redesenhar E. coli propriedades de aderência através da montagem do número mínimo de genes curli sob o controlo de um promotor forte e metal overinducible-, e em visualizar e quantificar o ganho de aderência bacteriana. Este método aplica-se princípios de engenharia adequadas de abstração e padronização da biologia sintética, e resultados no biotijolo BBa_K540000 (dispositivo Melhor biotijolo novo e projetado, iGEM 2011). O primeiro passo consiste na concepção do operão sintético dedicada à superprodução curli em resposta a metal, e, portanto, para aumentar a capacidade de aderência da estirpe de tipo selvagem. O original foi modificado curli operon in silico, a fim de otimizar os sinais de transcrição e tradução e escapar da regulação &quot;natural&quot; de curli. Esta abordagem permitiu testar com sucesso a nossa compreensão atual da produção curli. Moreover, simplificando a regulação curli trocando o promotor endógeno complexo (mais de 10 identificados reguladores transcricionais) de um promotor de metal-regulada simples torna aderência muito mais fácil de controlar. A segunda etapa inclui a avaliação qualitativa e quantitativa das habilidades de aderência por aplicação de métodos simples. Estes métodos são aplicáveis ​​a uma ampla gama de bactérias aderentes independentemente das estruturas biológicas envolvidas na formação de biofilme. Teste de aderência em placas de 24 poços de poliestireno proporciona uma visualização rápida preliminar do biofilme bacteriano após coloração com violeta de cristal. Este teste qualitativo pode ser afiada, mediante a quantificação da percentagem de aderência. Tal método é muito simples, mas mais preciso do que a coloração violeta de cristal único, como descrito anteriormente, com um tanto uma boa repetibilidade e reprodutibilidade. Visualização de bactérias marcadas com GFP em lâminas de vidro por fluorescência a laser ou confmicroscopia ocal permite reforçar os resultados obtidos com o teste de placa de 24 poços por observação directa do fenómeno.

In silico anotação da seqüência tipo selvagem csg de E. coli K12 associadas com a optimização de sinais de transcrição e de tradução, permitiu conceber o único sintético curli operon P-rcn csg mostrado na Figura 3 (a sequência completa de dados suplementares). Protocolo 2 e 3 do protocolo foram usadas para visualizar e quantificar a aderência associada com a produção curli. Utilizando coloração de violeta de cristal em placas de 24 poços de poliesti...

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

A concepção de um operão que codifica tanto o aparelho sintético de secreção e os monómeros estruturais de curli fibras é descrito. A superprodução destas amilóides e polímeros aderentes permite um ganho mensurável de aderência do<em&gt; E. coli</em&gt; Chassis<sup&gt; 1</sup&gt;. Maneiras fáceis de visualizar e quantificar a adesão são explicados.

Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K visualizações.  Université de Lyon. A concepção de um operão que codifica tanto o aparelho sintético de secreção e os monómeros estruturais de curli fibras é descrito. A superprodução destas amilóides e polímeros aderentes permite um ganho mensurável de aderência do E. coli Chassis 1. Maneiras fáceis de visualizar e quantificar a adesão são explicados.

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Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procedimento para a Engenharia de pulmão

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Bioengenharia

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

Sintéticos, Multi-Layer, auto-oscilante Fabricação Modelo Vocal Fold

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Gradiente de densidade de várias camadas de polimerização (DGMP): uma nova técnica para a criação de multi-compartimento, Andaimes customizáveis ​​para Engenharia de Tecidos

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa<em&gt; In Vivo</em&gt; Câmara Engenharia de Tecidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Reconhecimento Molecular de engenharia com Polymers Bio-mimético em únicos Walled nanotubos de carbono

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...