Nossa metodologia simples e prática pode ser usada para obter ADSCS abundante para estudar adipogênese PVAT in vitro e para testar drogas normais contra a obesidade e doenças cardiovasculares relacionadas. A vantagem deste método é a fluorescência inerente dos NCADSCs de biotina que você precisa para rotular as células com anticorpos conjugados flou-cromados para FACS, ou classificação celular ativada magnética. Este método pode ser usado para adquirir ADSC abundante derivado de células de crista neural do ectoderme para estudar adipogênese PVAT, ou lipogênese in vitro.
Usar camundongos jovens e ter experiência com cauterrorismo e adipogênese induzida significa que as células 3T3 são fundamentais para o sucesso deste protocolo. Demonstrando o procedimento estarão Yiding Qi, um estudante de pós-graduação, e Lian Xu, um técnico do meu laboratório. Para dissecção PAAT, depois de esterilizar a carcaça do rato em 75% de etanol por cinco minutos, use uma tesoura para cortar e separar a pele no abdômen.
Corte ao longo da linha média ventral da pelve até o pescoço, e abra o abdômen. Mova o fígado para expor o diafragma, e corte o diafragma e as costelas em ambos os lados da linha média. Descasque as costelas para expor o coração e os pulmões.
E remova os pulmões e o timo. Extrair o PAAT junto com a aorta e o coração em uma placa de petri. E corte a aorta na raiz aórtica para remover o coração.
Então, faça um corte entre o arco aórtico e a aorta descendente. Separe cuidadosamente o tecido adiposo ao redor de ambas as estruturas, e as artérias carótidas comuns e ortodidas da parede torácica posterior. É importante separar o PAAT da raiz e, como um vaso vascular maior com cuidado, é que a presença de células de parede vascular pode afetar a eficiência do FACS.
Coloque o tecido em uma placa de petri contendo tampão HBSS gelado. E use fórceps estéreis para remover o máximo possível da vasculatura e fáscia. Em seguida, transfira o tecido adiposo para um tubo Eppendorf de dois mililitros, contendo cinco mililitros de tampão HBSS gelado no gelo.
Quando todo o PAAT tiver sido coletado, transfira o tecido adiposo colhido para um novo tubo microcentrífugo de dois mililitros contendo um mililitro de meio de digestão recém-preparado. E use uma tesoura cirúrgica para picadinho dos tecidos. Transfira o chorume de tecido para um tubo de 50 milímetros contendo nove mililitros de meio de digestão fresco.
E use uma pipeta de um mililitro para triturar os tecidos 10 vezes. Quando uma solução homogênea for obtida, incubar o tubo por 30 a 45 minutos a 37 graus Celsius e 100 revoluções por minuto, verificando a cada cinco a 10 minutos para evitar a superdigestão. Quando uma solução de tecido adiposo amarelo claro pode ser observada sobre o giro suave do tubo, pare a digestão com cinco mililitros de HDMEM suplementados com soro bovino 10%.
Após uma mistura completa, centrifugar a amostra de tecido adiposo. A fração de célula vascular estromica será visível como uma pelota marrom. Suspenda a pelota em 10 mililitros de meio de cultura e filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 70 micrômetros.
Colete as células por outra centrifugação. E suspenda suavemente a pelota em cinco mililitros de tampão de lise de eritrócitos. Transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros.
Após 10 minutos, pare a reação com duas centrífugas em 10 mililitros de PBS, suplementados com soro bovino fetal de 1%. Após a segunda centrifugação, suspenda a pelota em cinco mililitros de cultura no gelo. E coletar as células com uma centrifugação final.
Em seguida, suspenda novamente as células em cinco mililitros de tampão FACS para contagem. Para criar uma cultura NCADSC, após seu isolamento pela FACS de acordo com os protocolos padrão, coloque as células em cinco vezes 10 a 10 células por cento centímetros de concentração quadrada em cada poço, uma placa de doze poços de cultura. Cultura incompleta média a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 20 a 24 horas.
No dia seguinte, lave as células com 37 graus Celsius PBS, e alimente a cultura com meio de cultura fresca. Quando a cultura atingir 80 a 90% de confluência, trate as células com dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA por poço por poço por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Quando as células tiverem sido separadas da parte inferior da placa, neutralizar as enzimas com dois mililitros de meio culto, e coletar as células colhidas por centrifugação.
Suspenda a pelota em um mililitro de meio de cultura fresca para contar. E semeou as células em uma nova placa de cultura de 12 poços em cinco vezes 10 a terceira células por centímetros de concentração quadrada. Em seguida, suspenda novamente as células remanescentes em meio de cultura suplementadas com sulfóxido de 10% de dimetil para armazenamento congelado em nitrogênio líquido.
Para induzir a diferenciação adipogênica, quando as células atingem uma confluência de 80 a 90%, trate as células com meio de indução adipogênica marrom ou branca por dois dias, conforme apropriado. No final da incubação, lave suavemente as células duas vezes com PBS antes de adicionar o meio de indução adipogênica fresco apropriado para cada poço, e devolver as células à incubadora de cultura celular para mais três a cinco dias de incubação. Os NCADSCs cultivados atingem uma confluência de 80 a 90% após sete a oito dias de cultura.
E demonstrar uma fibra de vidro expandida como morfologia. Para confirmar ainda mais seu potencial adipogênico, a coloração vermelha do óleo dos NCADSCs diferenciados pode ser realizada para detectar adipócitos maduros. Tipicamente, adipócitos maduros são observados após oito dias de indução adipogênica branca ou marrom com mais de 60% dos NCADSCs exibindo diferenciação adipogênica.
Observe que os NCADSCs demonstram um potencial adipogênico muito reduzido após a passagem. Imunoblotting e PCR quantitativo em tempo real revelam que a expressão de proteínas e genes relativos específicos adipócitos aumenta significativamente em NCADSCs adipogenicamente diferenciados após oito dias de indução adipogênica branca. Da mesma forma, a expressão de genes específicos de adipócito, e genes específicos de adipócito marrom, também aumenta significativamente após oito dias de indução adipogênica marrom.
Uma vez que a maioria do protocolo de isolamento NCADSC é simples, econômico e não requer o uso de anticorpos, para isso, a intensidade forte dos fluidos do IFP pode melhorar a eficiência alimentar facs.
