Células SBNET bem diferenciadas são de crescimento lento e difíceis de propagar. As poucas linhas celulares estabelecidas não estão prontamente disponíveis para os pesquisadores. Para superar essas limitações, desenvolvemos esse protocolo de cultura 3D.
A vantagem dessa técnica sobre o método tradicional de estabelecer uma linha celular SBNET é que culturas 3D podem ser obtidas e testes de drogas podem ser feitos dentro de três semanas. Este método pode ser aplicado a outros tumores neuroendócrinos, como tumores neuroendócrinos do pâncreas. Depois de obter uma amostra SBNET do paciente resseced, corte-a em cubos de cinco milímetros e armazene-a em 25 mililitros de meio DMEM F12 em um tubo cônico para transporte.
Incubar os tumores em meio de lavagem preparados de acordo com as instruções do manuscrito por 15 minutos. Em seguida, transfira-os para um novo prato e pique-os para pedaços de menos de um milímetro usando tesouras curvas estéreis. Transfira os tecidos picados para um novo tubo de 50 mililitros contendo 25 mililitros de meio de lavagem, depois centrifugar a amostra a 500 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernante e resuspenja as pelotas em 10 mililitros de meio de lavagem com colagemnase e DNase. Deixe os tumores picados digerirem a 37 graus Celsius com agitação lenta por 90 minutos. É importante não digerir demais as amostras do tumor.
Muita enzima ou tempo de incubação mais longo matará células SBNET. Depois que a digestão estiver completa, centrifufique o tubo a 500 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 15 mililitros de meio de lavagem.
Coloque um coador de células de 70 micrômetros em cima de um novo tubo de 50 mililitros e transfira 10 mililitros do tampão de lavagem através do coador. Gire o tampão de lavagem dentro do tubo para evitar que as células grudem nas laterais. Em seguida, filtre a suspensão da célula através do coador.
Centrifugar as células a 500 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 200 microliters de meio de lavagem. Coloque o tubo no gelo e use cinco microliters das células para contagem de células com um hemócito.
Calcule o número de células, em seguida, repita a centrifugação para remover o supernaspe e resuspense as células em ECM líquido a uma concentração de um milhão de células por mililitro. Em seguida, transfira de cinco a 20 microlitadores de esferoides SBNET em ECM para uma placa de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius para permitir que o ECM líquido se solidifique. Adicione 200 microliters de cultura SBNET ao meio de cada poço contendo esferoides ou cultura dos organoides em mídia de células-tronco como descrito anteriormente.
Use uma pipeta P1000 para transferir os organoides para um tubo de 1,5 mililitro e centrífugue o tubo a 1.500 vezes g durante um minuto para remover o supernante. Lave a cultura com um mililitro de PBS e centrífuga novamente para remover o supernaspe. Em seguida, fixar os organoides adicionando 500 microliters de paraformaldeído e incubando-os por 15 minutos.
Após a incubação, lave a cultura duas vezes com um mililitro de PBS. Adicione 500 microliters de PBS com 3%BSA e 0,1% Triton X-100 para permeabiliizar a cultura. Incubar o tubo por cinco minutos, depois lave os organoides três vezes com um mililitro de PBS e 3%BSA.
Em seguida, incubar a cultura com anticorpos primários por uma hora e depois repetir as lavagens com PBS e BSA. Incubar com os anticorpos secundários e repetir as lavagens certificando-se de aspirar e descartar todos os supernascidas. Para imaginar os esferoides, adicione cinco microliters de meio de montagem contendo DAPI e use uma pipeta P20 para transferir cinco microliters dos esferoides para um slide de vidro.
Sele o slide com um deslizamento e imagem com um microscópio de fluorescência usando os objetivos 10, 20 e 40X. Quebrar mecanicamente o ECM com uma pipeta P1000 e transferi-lo para um tubo estéril de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 1.000 vezes g a quatro graus Celsius.
Em seguida, remova todos os supernaspentes e coloque o tubo no gelo. Adicione duas a quatro vezes o volume do novo ECM à pelota e misture o conteúdo do tubo por tubos para cima e para baixo 10 vezes, certificando-se de evitar a introdução de bolhas de ar. Transfira de cinco a 20 microlitadores da mistura ECM e SBNET para uma nova placa de poço 96 e permita que o ECM se solidifique.
Em seguida, cubra o ECM solidificado com o novo meio SBNET e coloque a placa na incubadora. Se enviar spheroids SBNET para outro laboratório, transfira os esferoides com o novo ECM para um frasco T25 e permita que o ECM se solidifique. Encha o frasco com o meio esferoide SBNET, enrosque a tampa firmemente e prepare o pacote de envio.
Ao receber a cultura esferoide, remova o meio de cultura e repita os passos anteriores para colocar os esferoides de volta à cultura. A taxa de crescimento esferoide da SBNET foi monitorada com imagens microscópicas. Leva aproximadamente 14 dias para que os spheroids da SBNET dobrem de tamanho quando a mídia cultural é alterada uma vez por semana.
Após 14 dias na cultura, os spheroids sbnet não aumentam de tamanho. Os esferoides foram manchados com anticorpos específicos contra sinápticos, cromogranin A e SSTR2 e imagedos usando microscopia de imunofluorescência. Os dados mostraram que esses marcadores estão localizados no citoplasma e na membrana das células SBNET.
Para garantir a especificidade dos anticorpos, os mesmos procedimentos de coloração foram realizados em uma linha organoide a partir de um tumor de pâncreas que não expressa sinaptofisina, cromogranin A e SSTR2 e nenhum sinal verde foi detectado. A principal vantagem da imagem de imunofluorescência é que ela pode ser realizada dentro de quatro horas e dar informações de coloração semelhantes à imunohistoquímica. A culturação do SBNET como esferoides é uma técnica valiosa para identificar drogas que podem inibir o crescimento da SBNET.
Os esferoides foram tratados com rapamicina e inibidor de mTOR. Após cinco dias, o esferoide tratado com rapamicina formou uma estrutura semelhante à uva e tornou-se apoptótico ou necrosado. Ao tentar este procedimento, é importante pré-molhar o coador celular e o tubo de coleta com meio de lavagem.
Isso evitará que as células SBNET grudem no coador celular e no tubo plástico. Com este protocolo, cientistas e médicos podem estabelecer culturas eferóides da SBNET a partir de tumores ressecados, compartilhá-los com outros laboratórios e usá-los para testar medicamentos aprovados pela FDA.
