Somos gratos a S. Taylor para fornecer o pLPCX-histona H2-GFP plasmídeo. Agradecemos R. Mertelsmann de apoio contínuo. Este trabalho foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Semeadura de U2OS baseados em células ciclina B SNAP-Repórter (Clone 11 Células 6) em lâminas de microscopia Câmara <ol><li> Tripsinizar as células subconfluentes SNAP repórter que foram deixadas a crescer de forma assíncrona em fase log durante pelo menos 48 h. </li><li> Trabalhando com 8 poços (câmaras de microscópio distribuição constante de células). </li></ol> Para propagação de células em câmaras de 8 poços a microscópio uma distribuição constante por toda a superfície da câmara de microscópio, de centrifugação 10.000 células e ressuspender em 350 ul de fenol de meio de crescimento isento de vermelho de normal (suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina / estreptomicina e piruvato de sódio). Transferir a suspensão de células na câmara de microscópio (Figura 2). Trabalhando com 8 câmaras microscópio poços (densidade celular máxima no centro). Para propagação de células a uma densidade mais elevada no centro do microscópio Chamber, carregar a câmara com 300 ul de fenol de meio de crescimento isento de vermelho de normal. Adicionar 5000 células cuidadosamente para o centro da câmara de microscópio (Figura 2). Trabalhando com placas de 96 cavidades especiais óptica (distribuição constante de células). Para propagação de células em placas de 96 poços a uma constante de distribuição por toda a superfície do poço, centrifugar 5000 células e ressuspender em 300 ul de fenol de meio de crescimento isento de vermelho de normal. Transferir a suspensão de células para uma placa de 96 poços. Dependendo do número total de células contendo poços necessário, ajustar o número de células e o volume total do meio de suspensão (Figura 2). Trabalhando com placas de 96 cavidades especiais óptica (densidade celular máxima no centro). Para propagação de células em placas de 96 poços, cuidadosamente adicionar 1.500 células em 15 ul de meio de crescimento de fenol livre de vermelho normal num smalgota l para o centro de cada poço para obter restrição do crescimento celular para o centro do poço (Figura 2). <ol start="3"><li> Permitir que as células semeadas a crescer durante pelo menos 18 horas em condições normais de cultura de células (37 ° C, humidade relativa do ar de 100%, 5% CO 2). </li></ol> 2. A coloração de células Reporter com substrato SNAP <ol><li> 30 min antes do início do procedimento de coloração permitir alíquotas de meio de crescimento de fenol vermelho normal, livre de se aquecer até 37 ° C. </li><li> Para um manuseamento fácil do substrato SNAP (no nosso caso TMR Star) dissolver Estrela TMR em DMSO para se obter uma concentração na solução-mãe de 400 uM, a qual pode ser armazenada a -20 ° C. </li><li> Antes da coloração, diluir 0,5 ul de solução-mãe da estrela TMR em 200 ul de fenol de meio de crescimento isento de vermelho de normal (37 ° C) para obter uma concentração final de rotulagem de 1 uM. </li><li> Remover meio de crescimento normal das células em crescimento de forma assíncrona e incubar em lAbeling meio durante 25 minutos sob condições de cultura padrão. </li><li> Remover marcação de células de média e de lavagem por quatro vezes com fenol meio de crescimento isento de vermelho de normal (37 ° C). Incubar as células em 300 ul de fenol meio de crescimento isento de vermelho de normal (37 ° C) durante 30 min. Antes de transportar para o microscópio de substituir o meio com meio de crescimento fresco fenol livre de vermelho de normal (37 ° C) para remover o substrato SNAP residual não ligado. </li><li> Células de transporte para o microscópio de uma caixa de poliestireno expandido, uma relação pré-aquecido (37 ° C) do bloco de aquecimento para minimizar a variação de temperatura. </li></ol> 3. Medição da Intensidade de Fluorescência <ol><li> Duas horas antes da análise de ajustar a temperatura do ar da câmara climática a 37 ° C em modo de secagem, a fim de trazer o microscópio inteiro com todos os seus componentes para a temperatura desejada. O pré-aquecimento antes de definir a humidade é importante para evitar a condensação e subsequentes danos ao microscópio. </li><li> Ajuste t umidade do aro 60% de% de CO 2-5 antes do início da análise. </li><li> Inicie a digitalização ^ software de aquisição de R e definir configurações padrão (ver quadro 1). </li><li> Definem as posições dos poços a serem analisados. </li><li> Definir a Dt (tempo do ciclo de aquisição) e o número absoluto de ciclos de aquisição. </li><li> Se a análise de um número maior de poços é desejado, seleccionar a focagem automática de hardware, de outra forma, é suficiente utilizar autofocus software sozinho. </li><li> Iniciar e supervisionar a aquisição para os primeiros dois ciclos de aquisição. O microscópio focará o sinal H2-GFP histona, com subsequente aquisição de uma primeira imagem de que o canal antes de o filtro é alterado e a imagem correspondente da estrela TMR for adquirida (Figura 3). Este é, então, repetido para todas as posições dentro de um poço e para cada um dos poços a serem examinados, antes de repetir novamente o ciclo seguinte. </li></ol> 4. Análise de u Perfis ProteolyticDigitalização cantar ^ R <ol><li> Inicie a digitalização ^ software de Análise de R e analisar as imagens com os núcleos das células, tal como visualizado por histona H2-GFP, definido como o objecto principal, usando um limiar baseado na intensidade do sinal e um algoritmo de bacia para auxiliar na separação de células vizinhas. Um subobject consistindo de um núcleo com citoplasma deve ser criada para análise TMRstar. (Propriedades importantes do objeto principal são posições X e Y, o tempo, e máxima e média intensidade de GFP para o objecto principal e a intensidade total dividido pela área do subobject TMRstar.) Este processo de análise pode demorar várias horas, devido a grandes volumes de dados quantidades. </li><li> Mudar para rastrear modo a visualizar o TMR subobject média intensidade de fluorescência ao longo do tempo da estrela (vestígios de células), atribuídas aos objectos analisados ​​principais (Figura 4). O número de células a ser examinada pode ser reduzida por gating nessas medições de duração de pelo menos 140 ciclos e com uma elevada intensidade máxima de H2-GFP. Olhandoem números maiores de células permite que um representante da primeira e vista objectivo (Figura 4). </li><li> Seleccionar um rastreio celular de interesse para visualizar histona H2-GFP e TMR Estrela fluorescência simultaneamente ao nível da célula individual (Figura 5A). </li><li> Usando o botão direito do mouse em uma célula de interesse e gerar uma galeria de imagem exportável para ilustração de histona H2-GFP e ciclina B-SNAP TMR estrela para cada ponto de tempo único. </li><li> Mudar para o modo de população do software de Análise de digitalização R ^ e portão na região em que a célula de interesse é representada no vs Y X gráfico de pontos (Figura 5B). </li><li> Aplicar uma janela nova parcela de ponto para a região e visualizar fechado significa TMR Estrela intensidade de fluorescência ao longo do tempo (Figura 5C). </li><li> Exportação de dados (tempo e intensidade de fluorescência) para o Microsoft Excel para cálculo. </li></ol> 5. Resultados representativos Figoure 5D e 5E mostram a ciclina B cinética, representada por uma curva de intensidade de fluorescência TMR estrela, de uma célula que prossegue através de uma mitose normal sem sinais de desalinhamento cromossómica (Figura 5E). Após a compactação citoplasmática após ruptura do envelope nuclear (NEBD, como indicado pelo triângulo vermelho), TMR Estrela intensidade de fluorescência mostra um aumento abrupto até que a janela isomorfos (área mais clara no diagrama) é alcançado quando a célula entra na prometafase 6. A intensidade de fluorescência permanece a um nível estável, enquanto os rendimentos celulares através prófase e metáfase e então começa a cair rapidamente uma vez que todos os cromossomas estabeleceram uma placa metafásica estável (Figura 5D e 5E). Esta queda precede a separação dos cromossomos durante a anáfase (ponto azul na curva). Na mitose tarde a cromatina começa a decondense (barras azuis) e a célula adota morfologia interfase enquanto a curva de intensidade de fluorescência, se aproxima de umplanalto que é mais baixo do que o planalto antes da mitose (Figura 5D e 5E). <table border="1"><tbody><tr><td> Autofoco configurações </td><td> Histona H2-GFP (configurações principal aquisição do objeto) </td><td> Ciclina B marcada com SNAP-TMR Estrela (Configurações de aquisição) </td><td> As repetições de aquisição do tempo de ciclo </td></tr><tr><td> Grosseiras autofocus + / -39 24 uM Camadas Autofoco multa + / -5,4 UM 14 Camadas </td><td> GFP filtro definido: Tempo de exposição: 100 mseg Intensidade luminosa: 25% </td><td> TRITC filtro definido: Tempo de exposição: 150 msec A intensidade da luz: 33,3% </td><td> 2 a 5 min. </td></tr><tr><td> GFP filtro definido: Tempo de exposição: 12 mseg A intensidade da luz: 12,5% </td><td></td><td></td><td> Até 48 h de análise continuada (limitada pela humidade do ar reduzida de 60%) </td></tr></tbody&gt; </table> Tabela 1. Configurações padrão conforme utilizadas para análise da ciclina B proteólise. Histona H2-GFP foi utilizado como uma estrutura de referência que definem o plano de focagem para a medição da ciclina B-SNAP intensidade de fluorescência. Intensidades de luz durante o processo de focagem são menores em comparação com as configurações de aquisição de imagem para evitar fototoxicidade cumulativo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática da medição da ciclina B proteólise através da expressão de um derivado quimérico ciclina B com características de degradação semelhantes à proteína endógena. A diminuição na intensidade de fluorescência após marcação de pulso-caça é uma medida da APC / C-actividade. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> Figura 2. Análise de células em oito lâminas bem ou placas de 96 poços. Distribuição regular docélulas em toda a superfície do poço é conseguida por ressuspensão num volume final de 300 ul, e é recomendada, se apenas um único ou poucos posições são definidas manualmente para análise. O enriquecimento de células na região central é conseguida pela adição de células ao centro dos poços pré-carregadas ou vazias. Esta técnica é recomendado no caso de aquisição de imagem automatizado em poços diferentes. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> Figura 3. Seqüência de aquisição de dados. A) Detecção de histona H2-GFP é usada para a definição de foco avião e monitoramento de alinhamento cromossômica durante a mitose. B) A intensidade da fluorescência da intensidade de fluorescência TMR estrela é uma medida para a quantidade absoluta de pulse-chase rotulado ciclina B SNAP-. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> Figura 4. Representante representação digitalização ^ Análise R baseado em software de média TMR Estrelaintensidades de fluorescência (intensidade TMRstar total dividido por área) ao longo do tempo. Seleção de um traço célula representativa (azul). As imagens correspondentes (mostrado à direita) permitem a visualização simultânea de histona H2-GFP (verde) e ciclina B-SNAP (vermelho). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> Figura 5. A + B) Exemplo de propagação de pontos representando uma célula de juros sobre o enredo XY-ponto. C) A visualização da intensidade média de fluorescência TMRstar (intensidade TMRstar total dividido pela área) ao longo do tempo utilizando o gráfico de pontos. D + E) curva de intensidade de fluorescência de Representante ciclina B SNAP-com janela isomórfica (brigher campo no diagrama) entre descondensação NEBD (quebra envelope nuclear) e cromatina (barra azul) como gerado no Microsoft Excel. Anafase é indicado por tele ponto azul na curva. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . Filme 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">Clique aqui para ver filme suplementar</a> .

<ol>
	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Apresentamos aqui uma abordagem live-célula de imagem baseada em facilitar o monitoramento simultâneo de ciclina B proteólise e alinhamento de cromossomas. Esta abordagem permite o estudo de controlo mitótico em populações de células não perturbados ao nível da célula individual. As curvas de degradação de ciclina B facilitar percepções directas para a actividade do APC / C e assim, indirectamente, reflectem o estado do SAC 6. Esta abordagem, apesar de estabelecidos ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do produto </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Linha de células repórter </td><td> gerado em casa, como descrito 6 </td><td> clone 11 células repórter (U2OS baseados ciclina B-SNAP células que expressam) </td><td></td></tr><tr><td> Retroviral ciclina vetor de expressão B SNAP- </td><td> gerado em casa, como descrito 6 </td><td> pLNCX2-ciclina B mut5 SNAP- </td><td></td></tr><tr><td> Fenol livre de DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> A suplementação com FCS, piruvato de sódio, penicilina / estrepto-mycin exigido </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Solução estoque 400 mM em DMSO </td></tr><tr><td> Placa Opstics especial, de 96 poços </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ Slide-8 bem, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Unidade de Microscopia </td><td> Olimpo </td><td> IX-81 microscópio invertido com câmara climática </td><td></td></tr><tr><td> Objetivo </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO objetiva de 20x (NA 0,75) </td><td></td></tr><tr><td> Software de aquisição </td><td> Olimpo </td><td> Digitalização ^ Aquisição R software (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Software de análise de </td><td> Olimpo </td><td> Digitalização ^ Análise R software (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Distribuição igual dos cromossomas entre duas células filhas durante a divisão celular é um pré-requisito para garantir a estabilidade genética 1. Imprecisões durante a separação de cromossomos são uma marca registrada de malignidade e associada com doença progressiva 2-4. O posto de controle conjunto do eixo (SAC) é um mecanismo de vigilância mitótico que traz de volta as células em metáfase até que cada único cromossomo estabeleceu uma ligação bipolar estável ao fuso mitótico 1. O SAC exerce a sua função através da interferência com a activação da APC / C subunidade CDC20 para bloquear a proteólise de ciclina securin e B e, assim, a separação dos cromossomas e de saída mitótico. Penhora incorreta de cromossomos impede o silenciamento de SAC sinalização e provoca a inibição continuou da APC / C CDC20 até o problema ser resolvido para evitar missegregation cromossômica, a aneuploidia e tumores malignos 1. A maioria dos estudos que tratam da influence cromossômica de apego indevido sobre a APC / C-dependente proteólise aproveitou a interrupção eixo usando despolimerizando ou microtúbulos drogas estabilizadoras de interferir com apego cromossômica aos microtúbulos. Uma vez que a interferência com a cinética de microtúbulos pode afectar o transporte e localização de reguladores críticos, estes procedimentos de suportar o risco de induzir efeitos artificiais 5. Para estudar como o SAC interfere com a APC / C-dependente proteólise da ciclina B durante a mitose em imperturbável populações de células, foi estabelecido um sistema de histona H2-GFP-base que permitiu o monitoramento simultâneo de alinhamento metáfase de cromossomos mitóticos e proteólise da ciclina B 6 . Para descrever os perfis proteolíticos, geramos um quimérico ciclina B molécula repórter com uma porção C-terminal de SNAP 6 (Figura 1). Em uma reacção de auto-rotulagem, o SNAP-porção é capaz de formar ligações covalentes comalquilguanina-transportadores (substrato SNAP) 7,8 (Figura 1). Moléculas de substrato SNAP estão prontamente disponíveis e realizar um amplo espectro de diferentes fluorocromos. Quiméricos ciclina B SNAP-moléculas tornam-se rotuladas por adição do substrato de SNAP-membrana permeável ao meio de crescimento de 7 (Figura 1). Seguindo a reacção de marcação, a intensidade de ciclina B-SNAP fluorescência cai numa reacção do tipo de pulso-caça forma e intensidades de fluorescência reflectem os níveis de degradação da ciclina B 6 (Figura 1). O nosso sistema facilita o controlo da proteólise mitótico APC / C-dependente em grande número de células (ou várias populações de células) em paralelo. Desse modo, o sistema pode ser uma ferramenta valiosa para a identificação de agentes / moléculas pequenas que são capazes de interferir com a actividade proteolítica na metafase para a anafase transição. Além disso, como a síntese de ciclina B durante a mitose foi recentemente sugerida como uma mechanis importantesm na promoção de um bloco mitótica em camundongos e humanos, mantendo os níveis de ciclina expressão B estáveis ​​9,10, este sistema permitiu-nos analisar ciclina proteólise B como um elemento de um equilíbrio harmonioso 6.

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metáfase para anáfase transição é disparada através anáfase-promover complexo (APC / C) dependente de ubiquitinação e subsequente destruição da ciclina B. Aqui, nós estabelecemos um sistema que, na sequência de pulso-caça, rotulagem permite monitorar proteólise ciclina B em populações de células inteiras e facilita a detecção de interferência do checkpoint mitótico.

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.4K visualizações.  University Medical Center Freiburg. Metáfase para anáfase transição é disparada através anáfase-promover complexo (APC / C) dependente de ubiquitinação e subsequente destruição da ciclina B. Aqui, nós estabelecemos um sistema que, na sequência de pulso-caça, rotulagem permite monitorar proteólise ciclina B em populações de células inteiras e facilita a detecção de interferência do checkpoint mitótico.

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Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Biologia

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de populações de células no tecido humano único post-mortem do cérebro

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Método para Medição da Cinética de Fusão Viral no Nível única partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Geração de Disperso Presomitic mesoderme culturas de células for Imaging da Segmentação Relógio Zebrafish em células individuais

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Análise de LINE-1 retrotransposição no Núcleo de nível único

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.