Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para SSH (R01-DK078640), do Howard Hughes Medical Institute (HHMI), através do Programa de Certificação HHMI / Vanderbilt University em Medicina Molecular para TJW (GRDOT56006779), o Vanderbilt Diabetes Research e Centro de Treinamento (P30-DK020593) eo Digestivo Vanderbilt Disease Research Center (P30-DK058404) fornecendo serviços principais.

1. Prepare Cânula <ol><li> Aqueça uma seção de uma polegada de comprimento da tubulação PE10 com os dedos e estique-lo para que o tubo se torna fina. Nota: o tamanho do vaso ou conduta a ser canulada irá determinar o grau de estiramento necessário. A cânula deve ser bem esticado para ducto biliar lança, mas só podem ser obrigados a ser moderadamente esticada para caber dentro da veia maior portal. </li><li> Cortar o tubo estirado numa diagonal para gerar uma ponta biselada. </li><li> Cortar a outra borda do tubo para criar um segmento de 5-6 cm. </li><li> Inserir um calibre 32, agulha hipodérmica ½ polegada na extremidade não chanfrada do tubo. </li></ol> 2. Preparar seringa com PBS <ol><li> Encher uma seringa de 3 ml com PBS. </li><li> Parafuso da seringa na agulha hipodérmica com anexo puxado PE10 tubos previamente preparado. </li><li> Seringa Flick e empurrar o êmbolo da seringa para garantir que o PBS foi preenchido a agulha e tubagem eque não existem bolhas de ar na seringa. </li><li> Coloque a seringa preparada com PBS em uma seringa porta-moldada de massa de modelar. Isto irá manter o suporte de seringa estável, enquanto o tubo é introduzido na conduta. </li></ol> 3. Outros Set-up <ol><li> Pesar 0,1 g de catalisador para um recipiente pequeno, por exemplo, um poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Puxar um ml de resina para uma seringa de 3 ml. Nota: as quantidades relativas de catalisador e resina pode ser ajustada para alterar o tempo de cura. Decrescente quantidade de catalisador pode, no entanto, aumentar o encolhimento lançar e conduzir a um molde de menos desejável. Nota: ao manusear resina, tomar precauções para evitar contato com a resina ou a inalação dos vapores de resina. Use sempre luvas e executar as etapas que envolvem a resina em uma área bem ventilada, como um capuz químico fumos </li><li> Cortar um pedaço de fio de seda de 5,0 a cerca de 5 polegadas a ser usado como uma ligadura. </li></ol> 4. Prepare Rato <ol&gt; <li> Sacrifício do rato adulto. Coloque o mouse em sua parte traseira e abrir a cavidade abdominal. </li><li> Lay mouse sobre dissecar plataforma escopo. Coloque um tubo de 15 ml cônico perpendicularmente debaixo do mouse para aumentar a visibilidade e acessibilidade ao fígado. </li><li> Umedeça um cotonete com PBS e usá-lo para virar o fígado para cima e longe de você para expor o ponto de vista dorsal do fígado, juntamente com a veia porta extra-hepática ou ducto biliar comum. </li><li> Para moldes da veia porta, você pode impedir a coagulação do sangue, através de lavagem da veia com temperatura ambiente PBS. Coloque uma agulha de uma seringa de 3 ml com PBS e inserir a agulha na veia portal extra-hepática, tanto do fígado como você pode. Com cuidado, empurre PBS através na veia portal. Faça um corte na veia comum cardeal para drenar o sangue. Use um cotonete molhado para massagem fígado, melhorando a drenagem de sangue. Este passo não é recomendado para o ducto biliar e pode não ser necessário em todos os sistemas vasculares. Nota: este passo pode também ser performed com paraformaldeído a 4%, em vez de PBS. Utilização de paraformaldeído a 4% pode aumentar a integridade vascular e resultar em uma conversão mais precisa, mais especificamente de menores estruturas vasculares. </li></ol> 5. Canular veia extra-hepático Portal ou ducto biliar comum <ol><li> Fórceps curvos para passar a ligadura de sutura cirúrgica sob a veia porta ou ducto biliar, cerca de ¼ de polegada a partir do fígado. </li><li> Amarre a sutura em um nó frouxo comum. NÃO apertar o nó. </li><li> Se estiver a trabalhar com um sistema aberto, pode ser útil para ligar e apertar uma ligadura na outra extremidade do sistema. Se você abriu a veia comum cardeal para drenar o sangue da veia porta, amarrar uma ligadura ao redor para aumentar a pressão dentro da veia porta e evitar vazamento de resina para a veia hepática central. </li><li> Use uma tesoura de mola para fazer um pequeno corte na veia porta ou ducto biliar, cerca de ¼ de polegada abaixo do nó da sutura. Este cut deve penetrar mais do que metade do diâmetro da veia porta ou ducto biliar. </li><li> Usando fórceps # 5, manter a veia porta ou ducto biliar no local do corte e inserir extremidade chanfrada do tubo no canal biliar. </li><li> Empurrar a ponta do tubo após a ligadura pré-amarrado e para o fígado. </li><li> Teste de precisão canulação injetando PBS através da cânula e assistindo para ver se ele entra na veia porta ou ducto biliar. </li><li> Apertar a ligadura para manter a cânula no lugar. </li></ol> 6. Resina Lançai a veia porta ou vias biliares intra <ol><li> Adicionar pré-medidos ml de resina de 1 a pré-medidos catalisador 0,1 g e misture bem. Evitar a geração de bolhas de ar. </li><li> Desenhar resina-catalisador mistura para dentro da seringa de 3 ml. Remova todas as bolhas de ar delicadamente sacudindo a seringa e expulsando bolhas. Nota: para a fundição de estruturas pequenas, pode ser útil utilizar uma câmara de vácuo para remover as bolhas de ar muito pequenas, a partir de thresina e melhorar a qualidade e elenco. Para permitir o tempo para executar este passo, é necessário para diminuir a proporção de catalisador / resina da sugerida acima, a fim de reduzir a velocidade de cura da resina. </li><li> Recolocá PBS contendo uma seringa de resina contendo uma seringa, deixando a agulha de calibre 32 ligada à cânula. </li><li> Lentamente e empurre resina para a veia porta ou ducto biliar até aumenta a resistência e fígado está cheio. </li><li> Use cotonete molhado para massagear suavemente fígado e incentivar o mesmo preenchimento. </li><li> Remover cânula a partir da estrutura e rapidamente voltar a apertar a ligadura para evitar fugas de resina. </li><li> Permitir rato para colocar o plano à temperatura ambiente durante 20 min, enquanto as curas de resina, em seguida, remover o fígado. </li><li> Continue com o de limpeza ou maceração de fígado. </li></ol> 7. Fígado clara para visualização in situ <ol><li> Fixar o fígado em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C, de balanço. </li><li> Lavar o fígadoem PBS durante pelo menos quatro horas, de balanço. Neste ponto, você pode separar os lobos do fígado, se desejar. </li><li> Desidratar em metanol a 50% e depois em metanol a 100% durante pelo menos quatro horas cada, agitando à temperatura ambiente. </li><li> Limpar o fígado em uma solução 1:2 de álcool benzílico e de benzoato de benzilo (BABB) durante pelo menos 24 horas, de balanço. Vezes mais tempo de lavagem pode ser necessária. Se o fígado não desaparecer completamente após 2-3 dias, voltar a 100% de metanol por 24 horas e repetir BABB clareira. </li><li> Fígado submergir em BABB numa placa de Petri de vidro para imagiologia in situ. </li></ol> 8. Macerar tecido hepático <ol><li> Remover fígado de rato e colocados em um tubo cónico de 50 ml com água. Aguarde 1 hora para a cura da resina completa. Lobos do fígado separado se desejar. </li><li> Deitar fora a água e mover-se fígado de uma garrafa de vidro. Submerge em KOH 15%. Deixar durante a noite à temperatura ambiente. Não balance. </li><li> Com cuidado, despeje fora KOH e lavar elenco em água destilada. Nota: o elenco é very frágil e deve ser tratado com extremo cuidado. Evite interromper o elenco ao adicionar ou remover fluido do tubo. </li><li> Quando elenco resina é limpo, deite cuidadosamente em uma Kimwipe para secar, em seguida, transferir para um recipiente para ser armazenado. </li></ol> 9. Resultados representativos Uma conversão bem sucedida da veia porta ou ducto biliar irá mostrar uma rede contínua de ramos progressivamente menores que se estendem a partir do hilo à periferia do fígado. A Figura 1 mostra uma veia porta moldado como visualizado in situ após BABB compensação. Figura 1A mostra a conversão de todo o lobo hepático esquerdo e a forma e tamanho do molde. A Figura 1B mostra uma vista de perto do mesmo molde, demonstrando a a penetração da resina no interior dos pequenos ramos da veia porta, localizada na periferia do fígado. A Figura 2 mostra um molde da veia porta que tenha sido submetido KOH ma2A ceration. figura mostra o lobo hepático esquerdo inteiro e figura 2B é um close-up dos pequenos ramos periféricos. Essa técnica também tem sido aplicado com sucesso para o ducto biliar intra-hepática e publicado utilizando tanto a compensação BABB e técnicas de maceração KOH 1,2,7. Os problemas comuns incluem incompleta enche, bolhas na resina, e em sistemas de transbordamento ou tecidos circundantes. Figura 3 demonstra a forma de reconhecer um preenchimento incompleto (Figura 3A), bolhas (Figura 3A), e um excesso de resina a partir da veia porta para o veia central (Figura 3B). Todas as imagens são tiradas com uma Leica MZ 16 estereoscópio FA e QImaging RETIGA câmera 4000R. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig1.jpg" /> Figura 1. Elenco resina BABB-limpo de hepático esquerdo da veia porta lobo. A. fundido Resina mostra uma estrutura hierárquica de ramificação que se estende desde o hilo à periferia do fígado. Elenco resina aparece na cor amarela dentro azulada hepática. B. Um fim acima mostra que de preenchimento de resina estende a pequenos ramos na periferia de fígado. A resina é esbranquiçada através do fígado limpa. Barra de escala = 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig2.jpg" /> Figura 2. Tissue-macerado em resina de hepático esquerdo da veia porta lobo. A. Resina elenco de lobo hepático todo mostra muitos ramos de tamanhos variados. B. Close-up mostra pequenos ramos na periferia do fígado. Empenamento aparecimento de pequenos ramos representa resina de enchimento dos espaços sinusoidais e podem ou não ser visíveis na resina molda e vai aumentar a densidade aparente ramo, se presente. A resina é na cor branca. Barra de escala = 1 mm. Figura 3. Problemas comuns com moldes de resina. A. Uma preenchimento incompleto da veia portal lóbulo é aparente por alguns ou todos os ramos fundido deixando de estender para a periferia do fígado. Este fundido também exibe bolhas, visível como quebras na fundição contínua (seta). B. Devido à proximidade da veia porta e ramos da veia central em alguns lugares, a resina da veia porta, muitas vezes, entrar e encher a veia central. Isto pode ser reconhecido quando existem dois distintos ramos hilares (setas) e duas estruturas ramificadas que possuem diferentes padrões e sobreposições. Discriminação entre erros técnicos e verdadeiras alterações morfológicas pode ser feito de duas maneiras. Em primeiro lugar, a estrutura de molde deveria ser comparada com a estrutura esperada com base na 2-dimensional ou de outros métodos de análise. Segundo, é importante realizar várias repetições, e quando possível, quantificar o structure e realizar a análise estatística para determinar a reprodutibilidade e, se houver uma alteração estatisticamente significativa morfológica entre e dentro experimental diferentes e braços de controlo.

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+the+Rat+Intrahepatic+Biliary+System+by+Three-Dimensional+Reconstruction.">Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction.</a> The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+Artery+and+Portal+Vein+Remodeling+in+Rat+Liver:+Vascular+Response+to+Selective+Cholangiocyte+Proliferation.">Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation.</a> The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos exemplos específicos de como a veia portal e sistemas de vias biliares intra-hepáticos do fígado pode ser fundido, mas esta técnica pode ser aplicado a virtualmente qualquer outro sistema ductal ou vascular com pequenas adaptações. Os trabalhos anteriores demonstraram a viabilidade desta técnica, em várias espécies, incluindo o mouse 1,2,7-9, patinho 10,11, coelho 12,13, cão 14, e suíno de 15, e em muitos órgãos, inclusive da glândula ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Tubagem de polietileno PE10 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1417012P </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 seda preta cirúrgica trançada </td><td> Roboz Surgical </td><td> SUT-15-1 </td><td></td></tr><tr><td> Steriject 32 G x 13 mm agulha </td><td> Ar-tite </td><td> TSK3213 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura Primavera </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Número 5 fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> Mercox II kit </td><td> Ladd Research </td><td> 21247 </td><td></td></tr><tr><td> O álcool benzílico </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1816-1804 </td><td> Only necessário para BABB-clearing </td></tr><tr><td> Benzoato de benzilo </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 154839 </td><td> Só é necessário para BABB-compensação </td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Massa de modelar </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Escala </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laboratório de tesoura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 ml de polipropileno tubos com tampas de </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldahyde 4% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> De hidróxido de potássio 15% (KOH) </td><td></td><td></td><td> Só é necessário para maceração </td></tr><tr><td> Gilete </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol a 100% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 ml de seringa luer lock </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system

De órgãos, a arquitetura correta de estruturas vasculares e ductal é indispensável para a função fisiológica adequada, e a formação e manutenção de tais estruturas é um processo altamente regulado. A análise destes complexos, três estruturas tridimensionais grandemente dependia tanto exame 2-dimensional da secção ou em estudos de injecção de corante. Estas técnicas, no entanto, não são capazes de fornecer uma representação completa e quantificáveis ​​das estruturas ductais ou vascular que se destinam a elucidar. Em alternativa, a natureza do 3-dimensional moldes de resina plástica permanente gera um instantâneo do sistema e é um novo e técnica amplamente útil para visualizar e quantificar as três estruturas tridimensionais e redes. Uma vantagem decisiva do sistema de fundição de resina é a capacidade de determinar o intacto e ligado, ou comunicar a estrutura, de um vaso sanguíneo ou adesiva. A estrutura do vascular e ducredes mentais são cruciais para o funcionamento do órgão, e esta técnica tem o potencial para ajudar estudo das redes vasculares, e ductal de várias maneiras. Moldagem de resina pode ser usada para analisar a morfologia normal e arquitectura funcional de uma estrutura de luminal, identificar mudanças morfogenéticas do desenvolvimento, e descobrir diferenças morfológicas na arquitectura de tecido entre os estados normais e de doença. Os trabalhos anteriores resina de moldagem utilizado para estudar, por exemplo, defeitos de arquitectura e funcionais do sistema biliar intra-hepático do rato duto que não foram reflectidas em 2-dimensional análise da estrutura 1,2, alterações na vasculatura cerebral de rato um modelo de doença de Alzheimer 3 , portal anormalidades veia no Portal ratos hipertensos e cirróticos 4, etapas de desenvolvimento em maturação linfática rato entre pulmões imaturos e adultos, 5 imediatas alterações microvasculares no fígado de rato, pâncreas e rim em resposta a ferimentos em química6. Aqui apresentamos um método de gerar um elenco resina 3-dimensional de uma rede vascular do mouse ou ductal, com foco específico na veia porta e ducto biliar intra-hepática. Estes moldes podem ser visualizadas através de compensação ou maceração do tecido e pode então ser analisada. Esta técnica pode ser aplicado a praticamente qualquer sistema vascular ou ductal e seriam directamente aplicáveis ​​a qualquer estudo investigar o desenvolvimento, a função, a manutenção, ou lesão de uma estrutura 3-dimensional ductal ou vascular.

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3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

Um método de visualização e quantificação da estrutura 3-dimensional do rato da veia porta hepática ou ducto biliar intra-hepático é descrito. Esta técnica de fundição em resina pode também ser aplicada a outros sistemas do tipo ductal ou vascular e permite<em&gt; In situ</em&gt; Visualização ou quantificação de arquitectura intacto um sistema de comunicação.

3-Dimensional Fundição de resina e Imagem da Veia Rato Portal ou Sistema intra-hepática Duto Biliar

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

3-dimensional-resin-casting-imaging-mouse-portal-vein-or-intrahepatic

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Medicine

17.1K visualizações.  Vanderbilt University. Um método de visualização e quantificação da estrutura 3-dimensional do rato da veia porta hepática ou ducto biliar intra-hepático é descrito. Esta técnica de fundição em resina pode também ser aplicada a outros sistemas do tipo ductal ou vascular e permite In situ Visualização ou quantificação de arquitectura intacto um sistema de comunicação.