Os autores agradecem os membros passados ​​e presentes dos nossos laboratórios que ajudaram a desenvolver essas técnicas. Financiamento parcial fornecido ao DE por um subsídio do Instituto Califórnia de Medicina Regenerativa / CIRM (RN1-00538).

1. Zebrafish Pecuária, Geração Embryo e Tratamento <ol><li> Realizar os seguintes protocolos de peixe-zebra, sob a orientação de um cuidado com os animais e uso comitê institucional (IACUC) e dentro das diretrizes de cuidados de animais do NIH ou outros órgãos / diretrizes regulamentares. </li><li> Estirpes de peixe-zebra que expressam proteínas fluorescentes em tecidos específicos, células ou órgãos estão disponíveis a partir do Centro de Recursos Internacional de peixe-zebra (Zirc). Por exemplo, Tg (KDR: EGPF) s843 expressam GFP em células endoteliais vasculares, 6, os quais podem ser usados ​​para produzir estruturas vasculares 3D completa como mostrado neste protocolo. Outras linhas de zebrafish transgênicos estão disponíveis a partir Zirc. </li><li> Casa peixe-zebra adulto em um sistema de aquicultura apropriado que monitora pH, salinidade, temperatura, oxigênio dissolvido, luz e outros fatores ambientais 7. O peixe-zebra mostrado aqui foram alojados em um sistema Aquaneering Inc. (San Diego, CA) a 28,5 ° C, com uma lig 14 horasciclo escuro ht/10 hora. Alimente adulto zebrafish uma dieta equilibrada de camarão de água salgada e NRD 4/6 Alimentos para peixe (Brine Shrimp direta, Ogden, Utah). </li><li> Adulto masculino e feminino de peixe-zebra em idade reprodutiva devem ser alojados separadamente para aumentar acasalamento bem-sucedido. </li><li> Estimular a postura e fertilização, colocando fêmeas (2-4) e machos (4-6) juntos em um recipiente de acasalamento que tem um fundo de malha com buracos grandes o suficiente para os ovos a cair completamente, mas pequeno demais para os adultos de peixe-zebra para passar . Configure acasalamentos na noite anterior; ovos são colocados perto do amanhecer, normalmente, enquanto o ciclo de luz diurna aumenta lentamente na intensidade (madrugada). Entrada para os ovos na parte inferior do recipiente de acasalamento a cada 15-30 minutos. </li><li> Coleta de ovos usando uma peneira de malha e limpo com tampão E3 (mM NaCl 5, KCl 0,17 mM, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO 4). Transferir os ovos para 100 mm de placas de cultura de cheios com tampão de armazenamento e E3 em uma incubadora de 28 ° C. </li><li> Para estudar os produtos químicos que alteram a cerebrovascular ramificação adicionar concentrações químicas desejadas. Por exemplo ramificação neovasular pode ser induzida com inibidor γ-secretase (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)]-S-éster phenylglycinet-butil) solubilizado em DMSO 4, a partir de 24 fertilização horas após (hpf). Pelo que os embriões de ponto de tempo ainda estão dentro do córion, e muitos produtos químicos podem passar por ela 8. Se uma condição de tratamento tem neurais ou motoras efeitos que podem prejudicar a capacidade de embriões para se libertar do córion, em seguida, os embriões devem ser de-chorionated entre 24 e 48 hpf, o que pode ser feito com o auxílio de pinças de pronase 2. Embriões mostrados nas imagens fornecidas foram dechorionated agarrando suavemente o córion com duas pinças afiadas e rasgá-lo aberto. </li><li> Se necessário / desejado, a formação de pigmento pode ser inibida através da adição de 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para o tampão de E3 em 24 hpf. </li></ol> 2. Confocal de Cerebrovascular StructUres em Fixed embriões Zebrafish <ol><li> Sacrifício embriões em 250 mg / L tricaina metanossulfonato, e, em seguida, fixar-lhes por imersão em 2-4% de paraformaldeído durante a noite a 4 ° C. Os recipientes com embriões fluorescentes devem ser embrulhados em papel alumínio. Uma vez fixo, embriões devem ser armazenadas em PBS a 4 ° C até ser fotografada - EGFP intensidade de fluorescência se torna menos resolvido depois de cerca de uma semana, mas a morfologia (como visto em campo brilhante) é preservada por muito mais tempo. </li><li> Prepare-se para montar o embrião removendo primeiro um olho usando uma agulha de tungstênio afiadas. Cortar o tecido em torno de ligar o primeiro olho depois cortar os músculos, e finalmente cortar o nervo óptico para deslocar o olho. (Nota: Se remover imagiologia ambos os lados é desejada ambos os olhos.) </li><li> Uma vez que o olho é removida da montagem, o embrião de uma lamela com uma gota de 3% de metilcelulose. Orientar o embrião de modo que o lado com o olho removido é virada para a lamela e é o mais próximo do vidro quanto possível. Cubra todo o embrião com metillcellulose para evitar a dessecação durante o exame. </li><li> Imagem do embrião montado imediatamente usando um microscópio confocal invertido equipado com uma alta qualidade objectiva de 20x Plano Apo (abertura numérica = 0,75 ou melhor). Esta configuração é preferível a um microscópio invertido que não exigiria ensanduichando o embrião entre dois planos de vidro, e pressionando o embrião contra o tampo de vidro. </li><li> Colete fatias ópticas em 1 mícron incrementos usando um ajuste de abertura médio ou grande. Passos maiores de 2,5 mM podem também ser usados, mas pode ser mais difícil de determinar a ordem espacial dos objectos mais pequenos. As pequenas aberturas produzir detalhes mais nítidos, mas os exames mais necessários podem descorar EGFP e também limitar a profundidade das imagens no embrião que pode ser alcançado. Um microscópio confocal permite a imagem a meio caminho através de um embrião. </li><li> Se imagens de todo o peixe é desejada, remover os dois olhos no início (ver nota no passo 3.2), gire o embrião após imaging de um lado e repetir os passos 2,3-2,5 para o lado oposto. </li></ol> 3. Reconstrução 3D de Embryonic Zebrafish Cerebrovasculature <ol><li> Use a distribuição Fiji 3 de open source ImageJ (http://fiji.sc), que é otimizado para desenhos em 3D, de forma gratuita, e compatível com PC, computadores Mac e Linux. </li><li> Importar pilhas confocal para Fiji, indo para Plugins&gt; loci&gt; BioFormats Importador 9 em seguida, selecione o arquivo confocal, por exemplo name.ids para pilhas Nikon (Figura 2A). Selecione Exibir pilha com o modo hyperstack, Cor: tons de cinza, verifique autoscale, verifique canais divididos. </li><li> Essas seleções abrirá quatro painéis de canais separados; para EGFP apenas um será necessário, geralmente a terceira para baixo. Feche os outros três painéis (vermelho, azul e alfa) deixando a imagem de 16 bits com um nome longo seguido por C = 1 (Figura 2A). </li><li> Ajuste o limiar de digitalização que a imagem usando o rolo tab ao longo do fundo para encontrar uma fatia que tem a região ou estrutura de interesse, em seguida, vá em Image&gt; Adjust&gt; Threshold (Figura 2C). </li><li> No painel que vem para cima, deslize a barra superior (nível de preto) para a esquerda, de modo que a estrutura pode ser visto muito bem sobre o fundo, e deixar a lâmina inferior (nível de branco) onde é (Figura 2D). Selecione B &amp; W, selecione Fundo escuro. Não selecione Threshold calcular para cada imagem, a menos que diferentes ajustes são necessários para cada fatia, selecione Fundo preto. Este processo cria uma nova imagem de 8-bit. </li><li> ATENÇÃO: Limite não pode ser desfeita ou salvos em ImageJ, então a pilha confocal terá de ser recarregado cada vez que é necessária uma mudança. Anote os números e tentar diferentes configurações até que o resultado desejado seja alcançado. </li><li> Ir para Plugins&gt; 3D Visualizador&gt; Threshold 0, fator 1 (melhor) ou 2 (bom) Reamostragem, desmarque as caixas de cores vermelho e azul para fazer uma saída 3D verde - caso contrário, will produzir uma prestação branco - selecione Aplicar (não automático) (Figura 2E). </li><li> Girar, girar e ampliar a imagem em 3D usando o mouse e os controles do teclado (Figura 2F). </li><li> Salve as imagens estáticas em qualquer ponto usando a opção de captura no menu. O tamanho da caixa de imagem na tela determina dimensões de pixel da imagem produzida por isso, se uma imagem de alta resolução é desejado fazer a caixa maior, arrastando o canto inferior direito. </li><li> Crie um filme fiação 3D, selecione Exibir&gt; Gravar rotação graus 360 (Figura 2G). Padrões de rotação para 2 graus por passo, mas pode ser alterado para 5 graus, por exemplo, que criará tamanhos de arquivo muito menores, mas pode adicionar jerkiness para a animação. </li><li> Salve o arquivo em um dos vários formatos disponíveis para visualização posterior com players de mídia, fazer o upload para a Internet, ou usar em apresentações do PowerPoint. O open source media player, VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>tp :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), é gratuito e manipula esses vídeos muito bem. </li></ol>

<ol>
	<li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish.">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-&#946;+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-&#946; plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-&#946;+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina.">Amyloid-&#946; increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+husbandry+of+zebrafish+(Danio+rerio):+a+review.">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo.">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development.">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li><li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging.">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy.">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272 (2012).</li></ol>

Não há nada a divulgar.

Os métodos descritos aqui fornecer uma base para os estudos visuais do sistema vascular no desenvolvimento do peixe-zebra. Os espécimes vivos pode ser usado para avaliar os parâmetros fisiológicos, como freqüência cardíaca e volume de ejeção cardíaca, enquanto as amostras fixas podem ser usados ​​para confocal de alta resolução de imagem. Drosophila e C. elegans permitir a imagiologia de todo o corpo, mas de peixe-zebra são animais vertebrados e fornecer um modelo útil para tecidos de vertebrados, incluindo um sistema vascular forrado de célula endotelial. Estes estudos podem incorporar linhagens transgênicas significativas e recursos genômicos da comunidade de pesquisa do peixe-zebra. Reconstrução 3D e renderização de imagens confocal de peixe-zebra embrionária, como descrito aqui, permitir uma abordagem de biologia de sistemas de ramificação vascular e densidade de vasos sanguíneos que não é possível com modelos animais maiores, como ratos e camundongos. Além disso, como amniotas zebrafish desenvolver em um ambiente modificável (tampão E3), onde se pode facilmente adicionar chemicals que inibem enzimas específicas ou outros processos que afetam o desenvolvimento vascular. A concentração eo tempo de entrega química pode ser alterada, permitindo que o pesquisador condições de tratamento para afinar. 1. Modificações e solução de problemas Modificações a este sistema pode incorporar linhas de peixes-zebra transgénicos que expressam proteínas fluorescentes EGFP ou outros numa variedade de tecidos, órgãos ou de padrões específicos da região 10. Além disso, a análise de alterações neovasculares da retina de peixe-zebra foi recentemente publicado em 5. Problemas com pigmentação em embriões de peixe-zebra mais velhas e adultos pode ser compensada pelo cruzamento com linhagens transgênicas que não produzem pigmentos escala ou pigmentar da retina. Problemas com fluorescência reduzida tipicamente resultam de condições inadequadas de fixação. Paraformaldeído (4%) durante 1 dia é óptimo, mas fixadores mais fortes, tais como o glutaraldeído, tetróxido de ósmio ou álcool, podedestruir EGFP fluorescência. Após a fixação, os embriões devem ser mantidos em PBS a 4 ° C e sempre protegida da luz solar directa. 2. Limitações desta técnica A qualidade e resolução de desenhos em 3D produzidos com este protocolo dependem da qualidade das imagens geradas. A penetração de luz através destes embriões se limita ao plano médio-sagital utilizando um microscópio confocal padrão. Este aspecto da imagem limita a profundidade da imagem em embriões mais velhas e adultos, mas os sistemas de microscopia multi-fotão mais avançados permitem a imagem em maiores profundidades. 3. Significado no que diz respeito aos métodos existentes Este protocolo proporciona uma abordagem para a análise de redes dos vasos sanguíneos em um nível de sistemas que podem incorporar um animal inteiro. Representações anteriores de tais dados, muitas vezes invocada série de imagens dispostas em conjunto, mas a renderização 3D proporciona uma melhor resolução da relação espacialções envolvidas. 4. Aplicações futuras Novos desenvolvimentos na imagem e processamento de tecidos irá proporcionar muitas novas aplicações para esses métodos que podem incluir fazendo embriões mais velhas ou adultos transparente 11-14. Maior transparência permitirá aumentar significativamente a penetração nos tecidos por lasers confocal e multi-fotão. Além disso, como a velocidade de câmeras e tubos fotomultiplicadores aumentá-lo em breve poderá ser possível a produção de desenhos em 3D de peixes em tempo real, proporcionando uma 4 ª dimensão de análise. 5. Passos críticos Um passo crítico neste protocolo é a preparação para a imagem latente, que inclui a fixação adequada. Imagem deve ser feito o mais cedo possível após a fixação com os objetivos de alta qualidade que têm as melhores aberturas numéricas disponíveis. A resolução depende do sistema de imagem usado, os sistemas de tão alta qualidade são geralmente melhor. Gerando desenhos em 3D é a memória intensivapara assim mais novos, computadores high-end, com uma grande quantidade de memória e bons processadores gráficos são recomendados. O sistema de biologia visuais aqui descrita foi optimizado para peixes-zebra transgénicos que expressam GFP em células endoteliais vasculares, embora estes métodos pode ser adaptado a embriões transgénicos que expressam a GFP, ou outras proteínas fluorescentes, em populações de neurónios, músculos, glândulas ou qualquer número de outras células. A principal vantagem em trabalhar com este sistema é a possibilidade de estudar o que está acontecendo em todo o embrião, a qualquer momento durante este período de desenvolvimento, em animais fixos e / ou ao vivo.

Peixe-zebra fornecer um sistema poderoso para estudar a biologia do desenvolvimento, e da transparência relativa dos seus embriões é passível de estudos imagiológicos 1. O peixe-zebra foi agora utilizado como modelo para o desenvolvimento dos vertebrados durante décadas. Teleósteos, incluindo peixe-zebra, possuem um sistema vascular vertebrados simplificada que não tem homólogo razoável em invertebrados. O sangue é bombeado a partir da câmara anterior de uma de duas câmaras do coração através das guelras, onde é oxigenado. O sangue das brânquias converge na aorta dorsal e passa por artérias que se ramificam em vasos cada vez menores, eventualmente atingindo capilares em tecidos de órgãos. Dentro capilares oxigênio é liberado e dióxido de carbono é absorvido. No lado venoso dos capilares sangue flui para veias cada vez maiores e finalmente é arrastado para a câmara posterior do coração, onde o ciclo repete-se. Um peixe-zebra adulto pode colocar 200 ou mais ovos de cada vez, e once fertilizados, eles desenvolvem rapidamente 2. Dentro de um dia, o eixo do corpo é bem desenvolvida, incluindo os músculos que movem o contrato e embrião em torno de dentro da membrana coriônica. De 2-7 dias pós-fertilização (dpf) a maioria dos sistemas do corpo se desenvolver, incluindo olhos e um sistema nervoso central que possa coordenar nadando em direção a comida ou abrigo da luz brilhante. Até 7 embriões dpf são suficientemente pequenas para permitir a visualização em microscopia. Linhagens transgênicas que expressam proteínas fluorescentes podem ser visualizados com microscopia confocal ou fluorescência. Imagem confocal pode ser emparelhado com software open-source 3 para criar desenhos em 3D de estruturas vasculares completos em embriões de peixe-zebra que fornecem uma perspectiva de biologia de sistemas de desenvolvimento vascular. Estudos relacionados com mudanças na complexidade vascular e cerebrovascular serão beneficiados com este protocolo, uma vez que permite uma análise de nível de sistemas de redes vasculares 4,5. Uma compilação de métodos e recursos são fornecerd para permitir a adoção fácil e destas técnicas para estudos que exigem imagens de estruturas vasculares em peixes-zebra embrionários. A eficiência de custo do peixe-zebra como modelo animal está combinando com as tecnologias de imagem emergentes para fornecer novas plataformas que permitam avaliar os efeitos angiogênicos de vias moleculares no desenvolvimento de vertebrados e homeostase.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

Zebrafish são uma ferramenta poderosa para estudar a biologia do desenvolvimento e patologia in vivo. O tamanho pequeno e transparência relativa de embriões de peixes-zebra tornam particularmente úteis para o exame visual dos processos, tais como o coração e o desenvolvimento vascular. Em vários estudos recentes peixes-zebra transgénicos que expressam GFP em células endoteliais vasculares foram utilizados para a imagem e analisar as redes vasculares complexos no cérebro e na retina, utilizando microscopia confocal. As descrições são fornecidos para preparar, tratar e imagem embriões de peixes-zebra que expressam reforçada proteína verde fluorescente (EGFP), e depois gerar renderings 3D abrangentes do sistema vascular cerebral. Protocolos incluem o tratamento de embriões, imagiologia confocal, e protocolos de fixação que preservam EGFP fluorescência. Além disso, dicas úteis sobre como obter imagens de estruturas vasculares cerebrais, tais como a remoção do olho sem tecido neural nas proximidades prejudicial de alta qualidade são fornecidos. Armadilhas potenciaiscom imagem confocal são discutidas, junto com os passos necessários para gerar reconstruções 3D a partir de pilhas de imagens confocal usando livremente disponível software de código aberto.

Reconstrução 3D de estruturas vasculares fornece uma perspectiva global e visualmente interessante de desenvolvimento do peixe-zebra. Métodos Figuras 1 e 2 mostram como eles normalmente feito. Figura 3 mostra vários ângulos de estruturas vasculares num 6 dpf embrião do peixe-zebra que expressa GFP em células endoteliais. Com uma cor verde ou branco sólido que pode ser difícil de avaliar a intensidade de sinal; pseudo-coloração fornecer intensidade de imagem a partir de uma tabela de look-up e permite uma melhor percepção de profundidade quando as estruturas se sobrepõem. Um exemplo de um pseudo-colorida imagem 3D da vasculatura num 6 dpf peixe-zebra é fornecida na Figura 4. Imagiologia de fluorescência de embriões vivos podem ser usados ​​para estudar as características fisiológicas que incluem olho e movimento do corpo, e a actividade cardíaca. Figuras 3 e 4 mostra os resultados representativos obtidos com estes métodos, utilizando a linha de peixes-zebra transgénicos<html> descrito. Resolução de imagem depende das características de microscópio, mas o brilho do sinal de EGFP é suficiente para uma boa qualidade de imagem, com a maioria dos sistemas comerciais. Reconstrução e prestação de representações 3D é consistente e opções dentro deste software open-source fornecer consistentemente bons resultados. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Remoção Figura 1. Dos olhos. A) Um embrião fixa 3 dpf com uma necessidade de tungsténio posicionado ao lado do olho. O tecido é cortado em torno do olho a partir desta posição. B) O olho é cai e os músculos subjacentes e oculares são cortadas do nervo óptico. A órbita vazia é indicado com círculo tracejado. C) O mesmo embrião é entregue e montado com metil-celulose, com o olho intacto voltado para cima.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Passo-a-passo de reconstrução 3D de uma pilha de imagens confocal. A) Abra o arquivo (4104.1.ids) carregado dentro Fiji usando Plugins&gt; LOCI&gt; Bioformat selecionar. B) Depois de encontrar uma fatia com a região de interesse, de ajuste de limite é selecionada como mostrado. C) Threshold é ajustado para 214 usando o topo deslizante e aplicar é selecionado. espectador D) 3D é chamado como mostrado. E) A reconstrução 3D é mostrado de um peixe-zebra com o olho intacto, para orientação. F) A imagem foi ampliada e girado. G) Um filme de rotação de 360 graus é feita como mostrado.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Perspectivas de reconstrução 3D. A) perspectiva Medial de 6 dpf embrião fotografada com 10x objetivo, a boca fica do lado direito, e não brânquias dentro da boca. B) lateral do mesmo embrião, nota fin é um laço no meio. C) O mesmo embrião fotografada com 20x objetiva, perspectiva medial, resolução de emalhar nota. D) perspectiva lateral 20x de imagem objetiva. A barbatana é na margem direita do painel. E) vista ântero-medial de 20x de imagem objetiva, guelras de notas dentro da boca F) Abdômen do mesmo embrião fotografada com um objetivo de 20x, a cabeça para a direita.. Nota vasculatura no saco vitelino no canto inferior direito.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Diferenças de intensidade em 6 dpf embrião. Imagem de uma reconstrução 6 dpf usando um look-up-table pseudo para a intensidade do sinal. Boca, cérebro, brânquias e saco vitelino são rotulados para orientação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> Figura 5. Filme do sistema vascular reconstruída em um peixe-zebra 4 dpf. O peixe foi fotografada em 2,5 mM. As imagens foramde imagiologia metade do embrião. Comparar estruturas vasculares com estruturas em um peixe-zebra tratado GSI fornecidos na Figura 6. Nota a menor densidade de vasos sanguíneos na cabeça e guelras maiores. (Veja o &quot;Zfish_spin.avi&quot; arquivo suplementar em Downloads) <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Figura 6. Filme 3D de sistema vascular em um embrião tratado GSI a 4 dpf. O peixe foi fotografada em 2,5 mM através de lateral para a linha média. Comparar estruturas vasculares com o controlo de 4 dpf peixe mostrado na Figura 5. A parte traseira arqueada e tamanho menor são típicos em embriões tratados com este produto químico. (Veja o &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; arquivo suplementar em Downloads)

Watch this Scientific Journal Video about Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Imagem do desenvolvimento vascular cerebral em zebrafish larval é descrito. Técnicas para facilitar a imagens 3D e modificar o desenvolvimento vascular cerebral utilizando tratamentos químicos também são fornecidos.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K visualizações.  Western University of Health Sciences.  Imagem do desenvolvimento vascular cerebral em zebrafish larval é descrito. Técnicas para facilitar a imagens 3D e modificar o desenvolvimento vascular cerebral utilizando tratamentos químicos também são fornecidos. 

Vídeo: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Imunomarcação de Dissecada Coração Zebrafish embrionárias

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal