Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (NIH), SSH (R01-DK078640), aus dem Howard Hughes Medical Institute (HHMI) durch die HHMI / Vanderbilt University Certificate Program in Molecular Medicine, um TJW (GRDOT56006779), die unterstützt Vanderbilt Diabetes Research and Training Center (P30-DK020593) und der Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404), die Core Services.

Ein. Bereiten Kanüle <ol><li> Warm eine 1-Zoll langen Abschnitt der PE10-Schlauch mit Ihren Fingerspitzen und strecken, so dass der Schlauch dünn wird. Anmerkung: die Größe des Gefäßes oder Gangs zu kanüliert werden den Grad der Dehnung zu bestimmen. Die Kanüle muss Gallengang wirft gut gedehnt werden kann aber nur dann erforderlich, bis mäßig gedehnt werden, um innerhalb der größeren Pfortader angepasst werden. </li><li> Schneiden Sie das gestreckte Schlauch an einer Diagonale eine abgeschrägte Spitze zu generieren. </li><li> Schneiden Sie die andere Kante des Schlauchs an einen 5-6 Zoll-Segment zu schaffen. </li><li> Einfügen einer 32 Gauge, ½ Zoll Injektionsnadel in die nicht abgeschrägte Kante des Schlauchs. </li></ol> 2. Bereiten Spritze mit PBS <ol><li> Füllen Sie eine 3 ml Spritze mit PBS. </li><li> Schrauben Sie die Spritze auf die Injektionsnadel mit angeschlossenem gezogen PE10 Schlauch zuvor vorbereitet. </li><li> Flick Spritze und Push Spritzenkolben, dass PBS zu gewährleisten, hat die Nadel und Schläuche gefülltes gibt keine Luftblasen in der Spritze. </li><li> Legen Sie die gefüllte Spritze mit PBS in eine Spritze-Halter aus Modelliermasse geformt. Diese Halterung hält die Spritze stetig, während der Schlauch in den Kanal eingeführt wird. </li></ol> 3. Andere Set-up <ol><li> Wiegen 0,1 g Katalysator in einen kleinen Behälter, z. B. eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. </li><li> Ziehen Sie 1 ml Harz in eine 3 ml Spritze. Anmerkung: die relativen Mengen des Katalysators und des Harzes eingestellt werden, um Aushärtungszeit zu verändern. Sinkende Menge des Katalysators kann jedoch erhöht gegossen Schrumpfung und führen zu einer weniger wünschenswert Stimmen. Hinweis: Beim Umgang mit Harz, Vorsichtsmaßnahmen ergreifen, um Kontakt mit Harz oder Einatmen der Dämpfe Harz zu vermeiden. Tragen Sie immer Schutzhandschuhe und führen Sie die Schritte mit Harz in einem gut belüfteten Raum, wie einer chemischen Abzugshaube </li><li> Schneiden Sie ein Stück von 5,0 Seidennaht von ca. 5 cm als einer Ligatur verwendet werden. </li></ol> 4. Bereiten Maus <ol&gt; <li> Sacrifice erwachsenen Maus. Legen Sie mit der Maus auf den Rücken und öffnen Sie die Bauchhöhle. </li><li> Lay Maus auf Binokular Plattform. Positionieren Sie eine 15 ml konischen Röhrchen senkrecht der Unterseite der Maus, um die Sichtbarkeit und Zugänglichkeit der Leber zu erhöhen. </li><li> Befeuchten Sie ein Wattestäbchen mit PBS und verwenden Sie es, um die Leber nach oben und weg von Ihnen, um die dorsale Ansicht der Leber zusammen mit dem extrahepatischen Pfortader oder Choledochus Setzen kippen. </li><li> Für Pfortader Abgüsse, können Sie verhindern die Blutgerinnung durch Spülen der Vene mit Raumtemperatur PBS. Bringen Sie eine Nadel in eine 3 ml Spritze mit PBS gefüllt und Nadel in extrahepatischen Pfortader so weit von der Leber, wie Sie können. Schieben PBS durch in die Pfortader. Machen Sie einen nick in der gemeinsamen Cardinalvene Blut abfließen. Benutzen Sie einen nassen Wattestäbchen zur Massage der Leber, verbessert Blut Entwässerung. Dieser Schritt ist für den Gallengang empfohlen und eventuell nicht notwendig, dass alle Gefäßsystems. Hinweis: Dieser Schritt kann auch perfo werdenRMED mit 4% Paraformaldehyd anstelle von PBS. Verwendung von 4% Paraformaldehyd kann vaskuläre Integrität und führen zu einer genaueren gegossenen erhöhen, speziell von kleineren Gefäßstrukturen. </li></ol> 5. Kanülieren extrahepatischen Pfortader oder Choledochus <ol><li> Verwenden gekrümmten Zange, um das chirurgische Nahtmaterial Ligatur unterhalb der Pfortader oder Gallengang passieren, ungefähr ¼ Zoll von der Leber. </li><li> Binden Sie die Naht in einem lockeren gemeinsamen Knoten. Ziehen Sie die Knoten. </li><li> Wenn Sie mit einem offenen System arbeiten, kann es hilfreich sein zu binden und ziehen eine Ligatur am anderen Ende des Systems. Wenn Sie die gemeinsame Cardinalvene geöffnet haben, um das Blut aus der Pfortader abfließen, binden eine Ligatur um ihn herum, um den Druck in der Pfortader zu erhöhen und zu verhindern, Harz Leckage in der zentralen Lebervene. </li><li> Verwenden Frühjahr Schere einen kleinen Schnitt in der Pfortader oder Gallengang, etwa ¼ Zoll unter der Naht Knoten zu machen. Diese cut sollte dringen nicht mehr als der Hälfte des Durchmessers der Pfortader oder Gallengang. </li><li> Mit # 5 Zangen, halten Sie die Pfortader oder Gallengang an der Stelle des Schnittes und legen abgeschrägte Ende des Schlauches in den Gallengang. </li><li> Schieben Spitze des Schlauchs an der Pre-gebundenen Blattschraube und zur Leber. </li><li> Test für Kanülierung Genauigkeit durch die Injektion von PBS durch die Kanüle und beobachten, um zu sehen, ob es die Pfortader oder Gallengang gelangt. </li><li> Ziehen Sie die Ligatur um die Kanüle in Position zu halten. </li></ol> 6. Resin Cast der Pfortader oder intrahepatischen Gallengang <ol><li> Fügen abgemessene 1 ml Harz abgemessene 0,1 g Katalysator und gründlich mischen. Vermeiden Erzeugung von Luftblasen. </li><li> Zeichnen Harz-Katalysator-Gemisch wieder in den 3 ml Spritze. Entfernen Sie alle Luftblasen durch leichtes Ausklopfen der Spritze und Vertreibung Blasen. Hinweis: zum Gießen kleine Strukturen, kann es hilfreich sein, um eine Vakuumkammer verwenden, um sehr kleine Luftblasen aus th entfernene Harz und verbessern Gussqualität. Um Zeit für diesen Schritt zu ermöglichen, wird es erforderlich sein, den Katalysator / Harz-Verhältnis von dem oben vorgeschlagen, um Harzhärtung verlangsamen verringern. </li><li> Vorsichtig wieder PBS-haltigen Spritze mit Harz enthaltenden Spritze, so dass die 32-Gauge-Nadel an der Kanüle. </li><li> Langsam und vorsichtig Harz in die Pfortader oder Gallengang, bis Widerstand ansteigt und Leber gefüllt ist. </li><li> Verwenden nassen Wattestäbchen sanft massieren Leber und fördern eine gleichmäßige Füllung. </li><li> Entfernen Kanüle aus der Struktur und schnell wieder anziehen Ligatur Harz zu verhindern. </li><li> Lassen Maus lag bei Raumtemperatur Wohnung für 20 min, während das Harz härtet, dann entfernen Sie Leber. </li><li> Fahren Sie mit dem entweder für die Beseitigung oder Mazeration der Leber. </li></ol> 7. Klare Leber für Visualisierung in situ <ol><li> Fix die Leber in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C, Schaukeln. </li><li> Waschen Sie die Leberin PBS für mindestens vier Stunden, Schaukeln. An dieser Stelle können Sie trennen die Leberlappen, falls gewünscht. </li><li> Entwässern in 50% Methanol und anschließend in 100% Methanol für mindestens vier Stunden jeden, Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Deaktivieren Sie die Leber in einer 1:2-Lösung von Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BABB) für mindestens 24 Stunden, Schaukeln. Längere Waschzeiten notwendig sein. Wenn die Leber nicht vollständig nach 2-3 Tagen klar, wieder auf 100% Methanol für 24 Stunden zu verschieben und wiederholen BABB Lichtung. </li><li> Tauchen Leber in BABB in einem Glas Petrischale für die Bildgebung in situ. </li></ol> 8. Mazerieren Lebergewebe <ol><li> Entfernen der Leber von Mäusen und in einem 50 ml konischen Röhrchen mit Wasser. Warten Sie 1 Stunde zur vollständigen Aushärtung. Separate Leberlappen falls gewünscht. </li><li> Gießen Sie das Wasser und bewegen Leber zu einer Glasflasche. Tauchen in 15% KOH. Lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur. Nicht rocken. </li><li> Vorsichtig abgießen KOH und waschen Besetzung in destilliertem Wasser. Hinweis: Die Besetzung ist very zerbrechlich und sollte mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Verhindern, dass die Besetzung beim Hinzufügen oder Entfernen von Flüssigkeit aus dem Rohr. </li><li> Wenn Harz gegossenen sauber ist, sanft auf einem Kimwipe zum Trocknen lag, dann zu einem Behälter abgelegt werden übertragen. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Eine erfolgreiche Besetzung der Pfortader oder Gallengang zeigen ein kontinuierliches Netzwerk von immer kleiner Zweige, die sich aus dem Hilus der Leber Peripherie. Abbildung 1 zeigt eine Pfortader gegossen als visualisierte in situ nach BABB Lichtung. 1A die Besetzung des gesamten linken Leberlappen und die Form und Größe der Besetzung zeigt. Abbildung 1B zeigt eine Nahaufnahme der gleichen Besetzung, was die Eindringen des Harzes in die kleinsten Pfortaderäste an der Leber Peripherie. Abbildung 2 zeigt eine Pfortader Besetzung, KOH ma durchlaufen hatceration. 2A zeigt die gesamte linke Leberlappen und 2B ist eine Nahaufnahme der kleinen peripheren Äste. Diese Technik wurde auch erfolgreich auf die intrahepatischen Gallengang eingesetzt und veröffentlicht sowohl mit dem BABB Clearing und KOH Mazeration Techniken 1,2,7. Häufige Probleme sind unvollständig ausfüllt, demonstriert Blasen in dem Harz, und Überlauf in umgebenden Systemen oder Geweben. Abbildung 3, wie eine unvollständige Füllung (3A), Blasen (3A) und einen Überlauf von Harz aus der Pfortader zu erkennen, um die Zentralvene (3B). Alle Bilder sind aufgenommen mit einem Leica MZ 16 FA Stereoskop und QImaging RETIGA 4000R Kamera. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig1.jpg" /> Abbildung 1. BABB geräumten Resin der Leber links lobe Pfortader. A. Resin gegossen zeigt eine hierarchische Verzweigung Struktur, die sich aus dem Hilus der Leber Peripherie. Resin erscheint in gelber Farbe in blau getönt Leberlappen. B. Eine Nahaufnahme zeigt, dass Harz zu füllen, um kleine Äste in der Leber Peripherie erstreckt. Resin ist weißlich über gelöscht Leber. Maßstab = 1 mm. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4272/4272fig2.jpg" /> Abbildung 2. Tissue-mazerierten Resin der Leber links lobe Pfortader. A. Resin ganzer Leberlappen gegossen zeigt viele Niederlassungen in unterschiedlichen Größen. B. Close-up zeigt, kleine Äste in der Peripherie der Leber. Weiche Auftreten von kleinen Zweigen stellt Harzfüllung von sinusförmigen Räume und kann oder kann nicht auf Harz sichtbar wirft und die scheinbare Niederlassung Dichte zu erhöhen, falls vorhanden. Resin ist in der Farbe weiß. Maßstab = 1 mm. Abbildung 3. Gemeinsame Probleme mit Harz Würfe. A. Eine unvollständige Füllung des linken Lappens Pfortader ist durch einige oder alle Stimmen Niederlassungen nicht gelingt, auf die Leber Peripherie erweitern offensichtlich. Diese Besetzung zeigt auch Blasen, sichtbar als Pausen in der kontinuierlichen Besetzung (Pfeil). B. Durch die Nähe der Pfortader und zentrale Vene Niederlassungen in einigen Orten wird die Pfortader Harz oft geben und füllen Sie die zentrale Vene. Dies erkennt man, wenn zwei unterschiedliche hilar Niederlassungen (Pfeile) und zwei verzweigte Strukturen, die unterschiedliche Muster und Überschneidungen haben sollen. Unterscheidung zwischen technischen Fehlern und wahre morphologische Veränderungen kann auf zwei Arten erfolgen. Erstens sollte das Gußgefüge der Struktur erwartet bezogen auf 2-dimensionale Analyse oder andere Verfahren verglichen werden. Zweitens ist es wichtig, führen mehrere Wiederholungen, und wenn möglich, zu quantifizieren structure und statistische Analysen, um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen und wenn es eine statistisch signifikante morphologische Veränderung zwischen und in verschiedenen experimentellen und Querlenker.

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+the+Rat+Intrahepatic+Biliary+System+by+Three-Dimensional+Reconstruction.">Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction.</a> The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+Artery+and+Portal+Vein+Remodeling+in+Rat+Liver:+Vascular+Response+to+Selective+Cholangiocyte+Proliferation.">Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation.</a> The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben die spezifischen Beispiele, wie die Pfortader und intrahepatische Gallengang Systemen der Leber umgewandelt werden kann beschrieben, aber diese Technik kann auf praktisch jedem anderen Duktus oder Gefäßsystem mit geringen Anpassungen aufgebracht werden. Frühere Arbeiten haben die Machbarkeit dieser Technik in mehreren Arten, darunter Maus 1,2,7-9, Entlein 10,11, Kaninchen 12,13, Hund 14 und Schwein 15, und in vielen Organen, einschließlich nasaler Stop...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> PE10 Polyethylenschlauch </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1417012P </td><td></td></tr><tr><td> 5-0 chirurgische schwarzen geflochtenen Seide </td><td> Roboz Surgical </td><td> SUT-15-1 </td><td></td></tr><tr><td> Steriject 32 G x 13 mm Nadel </td><td> Air-tite </td><td> TSK3213 </td><td></td></tr><tr><td> Frühling Schere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Number 5 Zangen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 91150-20 </td><td></td></tr><tr><td> Mercox II Kit </td><td> Ladd Research </td><td> 21247 </td><td></td></tr><tr><td> Benzylalkohol </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1816-04 </td><td> Only für BABB-Clearing erforderlich </td></tr><tr><td> Benzylbenzoat </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 154839 </td><td> Nur für BABB-Clearing erforderlich </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Modelliermasse </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Maßstab </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laborscheren </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 ml cap Polypropylenröhrchen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4% paraformaldahyde </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15% Kaliumhydroxid (KOH) </td><td></td><td></td><td> Nur für Mazeration erforderlich </td></tr><tr><td> Rasierklinge </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100% Methanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Luer-Lock-Spritze </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system

In Organen, ist die richtige Architektur von vaskulären und duktalen Strukturen für die richtige physiologische Funktion unentbehrlich, und die Bildung und Aufrechterhaltung dieser Strukturen ist ein hoch regulierten Prozess. Die Analyse dieser komplexen 3-dimensionalen Strukturen hat sich stark auf beiden 2-dimensionalen Prüfung im Bereich oder auf Farbstoffinjektion Studien abhängt. Diese Techniken sind jedoch nicht in der Lage, eine vollständige und quantifizierbare Darstellung der duktalen oder Gefäßstrukturen sie vorgesehen sind aufzuklären bereitzustellen. Alternativ erzeugt der Natur der 3-dimensionalen Kunststoffharz Abgüsse eine permanente Momentaufnahme des Systems und ist ein neuartiges und nützliches Verfahren weithin zur Visualisierung und Quantifizierung von 3-dimensionalen Strukturen und Netze. Ein entscheidender Vorteil des Harzes Gießsystem ist die Fähigkeit, die intakt und verbunden oder kommuniziert, Struktur eines Blutgefäßes oder Kanal zu bestimmen. Die Struktur von vaskulären und ductal-Netzwerke sind entscheidend für Organfunktion, und diese Technik hat das Potential Studie von vaskulären und Duktus-Netzwerke in mehrfacher Hinsicht zu unterstützen. Gießharz kann verwendet werden, um normale Morphologie und funktionelle Architektur eines luminalen Struktur analysieren, Entwicklungsstörungen morphogenetischen Veränderungen und aufzudecken morphologischen Unterschiede im Gewebe Architektur zwischen Normal-und Krankheitszuständen werden. Frühere Arbeiten haben Harz Gießen zu studieren Verwendete beispielsweise architektonischen und funktionalen Mängeln in der Maus intrahepatischen Gallengang System, die nicht in 2-dimensionale Analyse der Struktur reflektiert wurden 1,2, Veränderungen im Gehirn Gefäßsystem eines Alzheimer Mausmodell 3 , Pfortader Abnormalitäten in Portal hypertensiven und Leberzirrhose Mäusen 4, Entwicklungsschritte in Ratten lymphatischen Reifung zwischen unreifen und adulte Lunge 5, sofortige mikrovaskulären Veränderungen in der Rattenleber, Pankreas und Niere in Antwort auf chemische Schädigung in6. Hier präsentieren wir ein Verfahren zur Erzeugung einer 3-dimensionalen Resin einer Maus vaskuläre oder Milchgangsystem, die speziell auf die Pfortader und intrahepatischen Gallengang. Diese Umwandlungen können durch Löschen oder Mazerieren des Gewebes visualisiert werden und kann dann analysiert werden. Diese Technik kann auf nahezu jedem Gefäß-oder duktalen System angewendet werden und wäre direkt anwendbar für jeden Studie anfragenden in die Entwicklung, Funktion, Wartung, oder der Verletzung eines 3-dimensionalen duktalen oder vaskuläre Struktur.

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3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

Ein Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung der 3-dimensionalen Struktur von Maus Pfortader oder intrahepatischen Gallengang wird beschrieben. Dieses Harz gegossenen Technik kann auch auf andere duktalen oder vaskulären Systemen angewendet werden und ermöglicht<em&gt; In situ</em&gt; Visualisierung oder Quantifizierung eines Systems intakt kommunizieren Architektur.

3-Dimensional Resin Casting und Imaging of Mouse Pfortader oder intrahepatische Gallengang-System

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.1K Aufrufe.  Vanderbilt University. Ein Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung der 3-dimensionalen Struktur von Maus Pfortader oder intrahepatischen Gallengang wird beschrieben. Dieses Harz gegossenen Technik kann auch auf andere duktalen oder vaskulären Systemen angewendet werden und ermöglicht In situ Visualisierung oder Quantifizierung eines Systems intakt kommunizieren Architektur.

Serie: 3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Forschung

Medizin

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling molecules that affect multiple organs; they modulate gut motility and hormone production, and alter vascular tone, glucose metabolism, lipid metabolism, and energy utilization. Changes in fecal bile acids may alter the gut microbiome and promote colon pathology including cholerrheic diarrhea and colon cancer. Key regulators of fecal bile acid composition are the small intestinal Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (ASBT) and fibroblast growth factor-19 (FGF19). Reduced expression and function of ASBT decreases intestinal bile acid up-take. Moreover, in vitro data suggest that some FDA-approved drugs inhibit ASBT function. Deficient FGF19 release increases hepatic bile acid synthesis and release into the intestines to levels that overwhelm ASBT. Either ASBT dysfunction or FGF19 deficiency increases fecal bile acids and may cause chronic diarrhea and promote colon neoplasia. Regrettably, tools to measure bile acid malabsorption and the actions of drugs on bile acid transport in vivo are limited. To understand the complex actions of bile acids, techniques are required that permit simultaneous monitoring of bile acids in the gut and metabolic tissues. This led us to conceive an innovative method to measure bile acid transport in live animals using a combination of proton (1H) and fluorine (19F) magnetic resonance imaging (MRI). Novel tracers for fluorine (19F)-based live animal MRI were created and tested, both in vitro and in vivo. Strengths of this approach include the lack of exposure to ionizing radiation and translational potential for clinical research and practice.

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Tools to diagnose bile acid malabsorption and measure bile acid transport in vivo are limited. An innovative approach in live animals is described that utilizes combined proton (1H) plus fluorine (19F) magnetic resonance imaging; this novel methodology has translational potential to screen for bile acid malabsorption in clinical practice.

Mit Multi-fluorierten Bile Acids und<em&gt; In Vivo</em&gt; Magnetic Resonance Imaging Maßnahme Gallensäure-Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Rat Model of the Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy (ALPPS) Procedure

Recent clinical data support an aggressive surgical approach to both primary and metastatic liver tumors. For some indications, like colorectal liver metastases, the amount of liver tissue left behind after liver resection has become the main limiting factor of resectability of large or multiple liver tumors. A minimal amount of functional tissue is required to avoid the severe complication of post-hepatectomy liver failure, which has high morbidity and mortality. Inducing liver growth of the prospective remnant prior to resection has become more established in liver surgery, either in the form of portal vein embolization by interventional radiologists or in the form of portal vein ligation several weeks prior to resection. Recently, it was shown that liver regeneration is more extensive and rapid, when the parenchymal transection is added to portal vein ligation in a first stage and then, after only one week of waiting, resection performed in a second stage (Associating Liver Partition and Portal vein ligation for Staged hepatectomy = ALPPS). ALPPS has rapidly become popular across the world, but has been criticized for its high perioperative mortality. The mechanism of accelerated and extensive growth induced by this procedure has not been well understood. Animal models have been developed to explore both the physiological and molecular mechanisms of accelerated liver regeneration in ALPPS. This protocol presents a rat model that allows mechanistic exploration of accelerated regeneration.

Rat Model of the Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy ALPPS Procedure

Inducing rapid liver hypertrophy using Associating Liver Partition and Portal vein ligation for a Staged hepatectomy (ALPPS) has been proposed for resection of borderline resectable liver tumors. This model may elucidate mechanisms involved in rapid hypertrophy and allows testing of drugs that promote or block the acceleration of regeneration.

Rattenmodell der Leber Partition zuordnen und Pfortader Ligation inszenierten Hepatektomie (ALPPS) Verfahren

Recent clinical data support an aggressive surgical approach to both primary and metastatic liver tumors. For some indications, like colorectal liver ...

Ablation of Ischemic Ventricular Tachycardia Using a Multipolar Catheter and 3-dimensional Mapping System for High-density Electro-anatomical Reconstruction

Ventricular tachycardia (VT) in patients with ischemic cardiomyopathy mainly results from endocardial scars after myocardial infarction; those scars represent zones of slow conduction that allow the occurrence and maintenance of reentrant circuits. Catheter ablation enables substrate modification of those low voltage areas and thus can help to alter the scar tissue in such a way that arrhythmias cannot appear anymore. Hospitalizations of concerned patients decrease, quality of life and outcome rise. Consequently, VT ablation represents a growing field in electrophysiology, especially for patients with endocardial scars in ischemic heart disease after myocardial infarction. However, ablation of ventricular tachycardia remains one of the most challenging procedures in the electrophysiology lab. Precise scar definition and localization of abnormal potentials are critical for ablation success. The following manuscript describes the use of a multipolar mapping catheter and 3-dimensional (3D) mapping system to create a high density electro-anatomical map of the left ventricle including a precise scar representation as well as mapping of fractionated and late potentials in order to allow a highly accurate substrate modification.

With the following protocol, we provide an approach to Ventricular Tachycardia (VT) ablation using high density mapping with a multipolar catheter and 3D mapping system enhancing the success of the procedure.

Ablation von ischämischen ventrikuläre Tachykardie mit einer multipolaren Katheter und 3-dimensionale Mapping-System für High-Density-Electro-anatomische Rekonstruktion

Ventricular tachycardia (VT) in patients with ischemic cardiomyopathy mainly results from endocardial scars after myocardial infarction; those scars ...

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is a common, noninvasive, repeatable method for assessing blood flow recovery. The technique calculates overall blood flow in the sampled tissue from the Doppler shift in frequency caused when a laser hits moving red blood cells. Measurements are expressed in arbitrary perfusion units, so the contralateral non-intervened upon leg is usually used to help control measurements. Measurement depth is in the range of 0.3-1 mm; for hindlimb ischemia, this means that dermal perfusion is assessed. Dermal perfusion is dependent on several factors&#8212;most importantly skin temperature and anesthetic agent, which must be carefully controlled to result in reliable readings. Furthermore, hair and skin pigmentation can alter the ability of the laser to either reach or penetrate to the dermis. This article demonstrates the technique of LDPI in the mouse hindlimb.

Here, we present a protocol that demonstrates the technique and necessary controls for Laser Doppler perfusion imaging to measure blood flow in the mouse hindlimb.

Laser Doppler Perfusion Imaging in der Maus Hindlimb

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Ein Mausmodell für chronische Pankreatitis mittels Gallengangs-TNBS-Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

DUCT: Doppelharzguss mit anschließender Mikro-Computertomographie zur 3D-Leberanalyse

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation of the extrahepatic bile duct (EBD) in mouse neonates without damaging the bile duct during preparation. Because of its exceptionally close preparation compared to the cholangiocytes cell line and harvesting of the entire extrahepatic bile duct system (EBDS), the described approach is extremely useful in researching animal models of newborn bile duct disorders, such as biliary atresia. After euthanasia, the peritoneal cavity was accessed, and the bile duct system, duodenum, and liver were extracted with the unique En-bloc-Resection (EbR). The extracted sample is placed on a foam mat, and the EBD is dissected from contaminating cells atraumatically without necessary touch. The dissection of the entire EBDS is a significant advantage of this method. Caution must be taken due to the small size and amount of bile duct tissue. Using the described technique, there is no damage to the cholangiocytes. Further, the purity of the technique is reproducible (n = 10). Therefore, optimally comparable samples can be harvested. Furthermore, no bile duct tissue is harmed, because any contact with the bile duct system can be avoided during preparation, leaving the bile fluid inside the gall bladder. Most importantly, while performing the final gall bladder and bile duct dissection, atraumatic microinstruments were used only slightly lateral of the bile duct without squeezing it. This is the key to a clean and intact sample, and essential for further histological investigation or the isolation of cholangiocytes. To summarize, the described innovative dissection technique enables especially inexperienced operators with the necessary equipment to isolate the EBDS as cleanly as possible.

For the observation of murine neonatal bile duct disorders, an intact bile duct and efficient preparation are required. Therefore, a new approach for isolating the entire extrahepatic bile duct system in murine neonates was successfully developed while maintaining the integrity of the bile duct.

Extrahepatische Gallengangs- und Gallenblasendissektion bei neun Tage alten Maus-Neugeborenen

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...