Os autores gostariam de agradecer a Priyanka Subrahmanyam para discussões úteis. Os autores não competindo interesse financeiro. Este trabalho foi financiado por doações do American Cancer Society, NIH / NCI K01 CA131487, CA162273 R21, R21 CA162277, e P30 Tumor Imunologia e Imunoterapia Programa para TJ Webb. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional do Câncer ou o National Institutes of Health.

1. Geração de AAPC <ol><li> Antes de adicionar proteínas de grânulos, preparar todos os reagentes e tampões: 0,1 M de tampão de borato; 1X D-PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +), (azida de sódio 1X PBS 5% de soro humano AB + 0,02%), solução tampão de lavagem Bead ; meio completo (meio RPMI 100 mM de piruvato de sódio, solução de vitaminas 10 mM não essenciais, solução de 100 mM de MEM vitamina, 1% de 2-mercaptoetanol, 10 mM de ciprofloxacina, 5% de soro AB humano); MACS tampão (1 L de PBS livre de Ca 2 + e Mg 2 +, 5 g de BSA, e 2 mmol de EDTA). </li><li> Enxaguar 1 ml de Dynabeads M-450 esferas de epóxi com 3 ml de 0,1 M de tampão estéril borato (ácido bórico e da água, pH 7,0-7,4) num frasco de vidro de 5 ml de borosilicato transparente roscada. </li><li> Num tubo separado de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 100 | ig de dímero hCD1d-Ig e 20 moléculas co-estimulatórias ng (por exemplo: anti-CD28mAb) a 1 ml de PBS w / o Ca 2 + ou Mg 2 +. </li> &lt;li&gt; Local grânulo contendo frasco de vidro no íman e tampão borato aspirado a partir de pérolas. Adicionar a mistura de proteína a partir do passo 1.2 a ampola de vidro e substituição da tampa. Misturar imediatamente invertendo o frasco, a tampa de cobertura com parafilm e, em lugar de um rotor e incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, frasco de vidro no lugar ímã e remover mistura de proteína, enquanto evitando cuidadosamente contas. Lavar os grânulos por adição de 3 ml de tampão de lavagem talão (PBS com 5% de soro AB azida de sódio a 0,02%), e incubação a 4 ° C num rotor durante 5 min. Repita duas vezes. </li><li> Contas podem ser armazenadas nesta mistura de lavagem do grânulo. Para tornar AAPC funcional, remover uma pequena alíquota e contar as pérolas utilizando um hemacitómetro. Verificar que as proteínas são carregadas de forma estável sobre as pérolas através de coloração com anticorpos (ex. PE-conjugado anti-ratinho IgG1) e a realização de análises de citometria de fluxo. </li><li> Para carregar grânulos com antigénio, remover 5 x 10 7 esferas, e adicionar a um pequeno frasco de vidro de 1,5 ml, lavar grânulos com 1 ml de PBS estéril. Resuspend lavado contas com 1 ml de PBS estéril e adicionar antígeno; exemplo: carregue com α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Nota: Embora, não ter detectado qualquer problema com lipossolubilidade ou a formação de micelas, lipídios devem ser tratadas de acordo com as recomendações do fabricante. Especificamente, KRN7000 foi reconstituída em DMSO (1mg/ml) para estes estudos. KRN7000 e outros antigénios glicolipídicos podem também ser dissolvidos em 0,2 mg / ml de PBS contendo 0,5% de Tween-20 (sonicar 2 hr. A 37 ° C). IMPORTANTE-O AAPC precisa ser carregado para, pelo menos, 48-72 horas antes da utilização. </li></ol> 2. Isolamento de CD161 + CD3 + Células <ol><li> Recolher as células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Para a separação Ficoll centrifugação em gradiente de densidade de linfócitos a partir de uma crosta inflamatória ou de embalagem leucoferese, primeiro sangue heparinizado diluído com um volume igual de PBS 1X à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 15 ml de Ficoll (aquecida até à temperatura ambiente) para tubos de 50 ml. Lentamente sobreposição25 ml da mistura de sangue diluído no topo do Ficoll. Centrifugar a 2000 rpm durante 30 min à temperatura ambiente, com o freio. </li><li> Remova cuidadosamente a interface de linfócitos (anel branco entre a mídia e Ficoll) com uma pipeta Pasteur e transferir para um novo tubo de 50 ml cônico. </li><li> Lavar as células, preenchendo-se o tubo de 50 ml com PBS e centrifugação a 1500 rpm durante 5 min. Descartar o sobrenadante e combinar os tubos a partir de um único indivíduo, a um único tubo e lavar as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de novo com 20 ml de PBS. Depois contar o PBMC e ressuspender a uma concentração de 5 x 10 7 células / ml em tampão de MACS (1 L de PBS livre de Ca 2 + e Mg 2 +, 5 mmol g de BSA e 2 EDTA). </li><li> A fim de isolar a fracção de células T, começar com 2 ml de PBMC (10 8 células) e adicionar 100 ul de solução de enriquecimento de células Pan-T do T Humano EasySep Kit Enriquecimento Cell. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li&gt; <li> Adicionar 100 ul de partículas magnéticas para a solução e incubar à temperatura ambiente durante mais 10 min. Trazer o volume final de solvente a 2,5 ml e colocar o tubo no íman roxo por 5 min. Rapidamente despeje a fracção CD3 + para um tubo cónico de 15 ml. </li><li> Lave as células por adição de 5 ml de tampão arrefecido com MACS, contar o número de células viáveis, e remover-se uma alíquota para a coloração de FACS. </li><li> Para seleccionar as células CD161 +, primeiro ressuspender as células T enriquecidos em 980 ul de tampão arrefecido em gelo MACS, adicionam-se 10 ug de mAb anti CD161, e incubar em frigorífico durante 10 min. </li><li> Centrifugar as células a 1.500 rpm a 4 ° C durante 5 min. Em seguida reconstituir o pellet celular em 800 ul de tampão de MACS. Adicionar 200 ul de microesferas anti-IgG1 de ratinho e incubar a solução durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Durante este passo de incubação, misturar uma coluna LS por adição de 3 ml de tampão de MACS. </li><li> Em seguida, lava-se as células por centrifugação de 1.500 rpm a 4 ° C durante 5 min. Resupassar as células em 3 ml de tampão MACS. Em seguida, as células pipetar para a coluna MACS LS separação. Certifique-se de evitar a geração de bolhas pipetando lentamente. Lavar a coluna por adição de 3 ml de tampão de MACS. Repita duas vezes. </li><li> Adicionar 3 ml de tampão fresco e remover MACS coluna do campo magnético. Coluna lugar em um tubo de 15 ml cônico. Insira êmbolo e empurre conteúdo para obter purificadas CD161 + CD3 +. Contagem de células NKT enriquecido fração. Você deve têm 2-4 milhões de células. </li></ol> 3. AAPC mediada por expansão de células NKT <ol><li> Defina-se a co-cultura, adicionando 10 6 enriquecidos CD161 + células T CD3 + e 10 AAPC 6 em 16 ml de meio completo (meio completo + IL-2, 100 U / ml). Placa esta mistura por adição de 160 volumes ul / poço final para um 96 polistireno de cultura de tecidos bem tratados, U-placa inferior, com a evaporação de baixo da tampa. Realizar troca de meio a cada 7 º dia, adicionando 80 uL de meio fresco. </li><li> Colheitacélulas, contar e realizar a coloração de FACS no dia 12-14. </li><li> As células NKT podem ser expandidas novamente plaqueadas como descrito acima no passo 3.1, especificamente ressuspender 10 6 células T expandidas e 10 AAPC 6 em 16 ml de meio completo. Placa esta mistura por adição de 160 ul / poço de uma placa de 96 cavidades de fundo U-. Continue a atualizar meio de co-cultura a cada 7 º dia, adicionando 80 uL de meio fresco. </li><li> O melhor é congelar as células NKT adicionais após a segunda ronda de expansão (1 x10 6 / criotubo em 1 ml de DMSO a 5% / 95% de FBS). </li></ol> 4. Teste funcional: AAPC mediada por estimulação das células NKT <ol><li> Defina-se 5x10 4 células NKT / poço com 5x10 AAPC 5 em volume de 200 ul final (meio completo), em placa de 96 cavidades de fundo U-. </li><li> Colheita sobrenadante da cultura celular por ELISA após 24-48 h. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

AAPC pode ser usado para estudar os requisitos básicos para a activação das células NKT e tem valor clínico potencial para a expansão ex vivo de células T NK para uma imunoterapia adoptiva. Mescher et al. Descreveu um dos primeiros sistemas baseados em grânulos, em que biotinilado de MHC de classe I-péptido murino-construções de cadeia simples foram combinadas com moléculas co-estimuladoras B7.1 e B7.2 biotinilados via estreptavidina para a superfície de microesferas de látex 14, 15. Esta abordagem tem sido utilizada com sucesso para estimular específicas de antigénio de células T a partir de ratos transgénicos. Além disso, uma vez que esta abordagem utiliza uma única cadeia complexo MHC-peptídeo para garantir um carregamento homogénea de moléculas de MHC, cada antigénio do péptido alvo seria necessária uma nova transfecção quanto à expressão do complexo de cadeia única desejado MHC-peptídeo, limitando assim a generalidade da abordagem. É importante ressaltar que o grupo do Dr. Schneck de pioneira no talão baseada-AAPC, através do desenvolvimento de um outro não-celular AAPC talão base, Feito por acoplamento de HLA-Ig, o sinal 1 e anti-CD28, o sinal de 2, sobre as esferas magnéticas. HLA-Ig, uma única forma multimérica de HLA fundida a uma imunoglobulina andaime molecular 16, 17 foi desenvolvido pelo seu grupo. Subsequentemente, desenvolveram MHC-Ig baseado AAPC, que foram mostrados para expandir eficazmente CMV e MART-1 CTL específica 18. Aqui, demonstramos que CD1d-Ig AAPC base pode ser utilizada para expandir as células NKT funcionais. Um estudo foi utilizado um sistema semelhante para examinar a interacção física das células NK com CD1d 19. Notavelmente, criamos uma célula artificial apresentando antígeno que é adaptável a todos os requisitos que achar necessário para a proliferação de células NKT ideal. O método de expansão AAPC fornece um método simples e confiável para a expansão e enriquecimento de células humanas NKT. Nosso AAPC pode ser modificado para avaliar sistematicamente o papel de um painel de moléculas co-estimulatórias potenciais e avaliar o seu papel na proliferação de células NKTção e função. Assim, AAPC representam uma tecnologia robusta versátil e útil para induzir a expansão de células NK. A geração de aAPCs demora menos de uma semana, e é adequado para a produção de grandes quantidades de grânulos. No entanto, um passo crítico na geração da AAPC é confirmar que CD1d-Ig é estavelmente imobilizado sobre a superfície dos grânulos e para avaliar a sua funcionalidade para garantir a consistência de lote para lote. Uma limitação potencial do sistema é que não existe um mecanismo para desligar a estimulação, excepto a remoção mecânica dos grânulos. Especificamente, o bloqueamento do receptor de células T (TCR) com o antigénio: Complexo CD1d/MHC tipicamente gerar a sinapse imunológica em conjunto com acessórios / adesão de moléculas, o que pode resultar na indução de factores inibidores ou supressor sobre tanto a célula T e célula que apresenta antigénios. No sistema de AAPC, estes factores podem ser regulada pela célula T, mas o cordão não irão expressar os ligandos cognatospara estes receptores. Além disso, as células CD4 + NKT foram mostrados para suprimir as respostas anti-tumorais em ratinhos e seres humanos, por isso, é possível que a activação não selectiva de todas as células NK (por exemplo, estimulação global com α-GalCer) ou à activação do subconjunto errado pode resultar em indesejáveis ​​imunológica resultados. Consequentemente, deve-se fenotipicamente e funcionalmente caracterizar a AAPC-expandido população de células NKT. Como mostrado na Figura 4, verificou-se que a estimulação com α-GalCer-carregado AAPC expressar anti-CD28 pode resultar células NKT produzem Th1, Th2 e citocinas do tipo Th17. Estudos em ratos relataram que o desafio com IL-33, uma citoquina recentemente identificada, resultou no aumento dos níveis circulantes de citocinas inflamatórias, tais como IL-5 e IL-13. O tratamento de células NKT com IL-33 aumentou a sua produção de citocinas 20. IL-33 é um ligando específico para ST2 e demonstrou-se que ca solúvel ST2n de blocos de IL-33 de sinalização. Assim, como um exemplo de uma possível aplicação, AAPC ST2 expressar pode ser gerado e utilizado para determinar se se pode inibir selectivamente a produção de citocinas do tipo Th2, enquanto a indução da secreção de citocinas Th1 pelas células NK. Também tem sido relatado que a injecção iv de Kb-expressando AAPC em ratinhos C57BL / 6 resultou em metástases do pulmão diminuiu de 21 tumores. Mais importante ainda, estes dados demonstram que o tráfego de AAPC para o pulmão e são capazes de activar células T efectoras subconjuntos. Portanto, pode gerar vários tipos de AAPC e examinar a interação entre antígeno subpopulações de células T específicas. Resumindo, estes estudos demonstram que CD1d-Ig AAPC base pode ser usada para substituir APC celular normal, e têm o potencial de melhorar as actuais abordagens clínicas para imunoterapia baseada em célula NKT-adoptiva.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Life Sciences </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Human T Kit Enriquecimento celular </td><td> StemCell Technologies </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Aloficocianina CD161 humano mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-ratinho IgG1 micropérolas </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> XI dímero solúvel recombinante dimérica Rato CD1d: IG Proteína de Fusão </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 pérolas Epoxi </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-galactosilceramida (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Meio RPMI 1640 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Não-aminoácidos essenciais </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de vitamina </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciprofloxacina </td><td> Bioquímicos Alexis </td><td> 380-288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (Clone C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Clone C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-rato IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-mouse IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, sem cálcio, magnésio nenhuma </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> Azida de sódio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td> Americana Bioanalytical </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> O soro humano AB </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Rotator Tubo Labquake </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml de poliestireno de fundo redondo tubos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Wheaton frascos de vidro com tampa de Amostra </td><td> Fisher Scientific </td><td> Pequeno (03-343-6A) Grande (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

Natural killer T (NKT) são células de um único subconjunto de células T que exibem marcadores característicos de ambas as células assassinas naturais (NK) e células T 1. Ao contrário das células clássicas T, células NK reconhecem antigénio de lípidos no contexto das moléculas CD1 2. Células NKT expressam um rearranjo da cadeia invariante TCRα: Vα14Jα18 em ratos e em seres humanos Vα24Jα18, que está associado com cadeias Vp de diversidade limitada 3-6, e são referidos como canónicas ou invariante NKT (i NKT) células. Semelhante às células T convencionais, as células NKT se desenvolvem a partir de CD4-CD8-tímicas células T precursoras após a sinalização apropriada por CD1d 7. O potencial para utilizar células NKT para fins terapêuticos tem aumentado significativamente com a capacidade de estimular e expandir as células NKT humanas com α-galactosilceramida (α-GalCer) e uma variedade de citocinas 8. É importante notar que estas células mantiveram a sua origem phenotype, citocinas secretadas e exibida função citotóxica contra células tumorais. Assim, as células expandidas ex vivo NKT permanecer funcional e pode ser utilizado para a imunoterapia adoptiva. No entanto, células NKT imunoterapia baseada tem sido limitada pela utilização de células autólogas apresentadoras de antigénios e a quantidade e qualidade destas células estimuladoras pode variar substancialmente. Derivados de monócitos DC a partir de pacientes com cancro têm sido relatados para expressar níveis reduzidos de moléculas co-estimulatórias e produzir citocinas inflamatórias menos 9,10. De facto, em vez de DC murina APC autólogas foram utilizadas para testar a função das células NK de pacientes com LMC 11. No entanto, este sistema só pode ser utilizado para os testes in vitro a partir de células NKT não pode ser expandido por DC de murino e, em seguida, utilizada para uma imunoterapia adoptiva. Assim, um sistema padronizado que depende das células artificiais Antigen Presenting (AAPC) poderia produzir os efeitos estimulantes do DC sem as armadilhas do alo-ou xenogénicas cells 12, 13. Relata-se um método para gerar CD1d baseado AAPC. Desde o envolvimento do receptor de células T (TCR) por antígeno-CD1d complexos é uma exigência fundamental da ativação de células NKT, antígeno: CD1d-Ig complexos fornecem um método confiável para isolar, ativar e expandir as populações de células efetoras NKT.

Descrevemos aqui um método para gerar CD1d-Ig AAPC base, feito por acoplamento covalente de CD1d-Ig e anti-CD28 mAb a contas magnéticas para estimular células NK como um método padrão para a propagação de células NKT (figura 1). Primeiro, deve-se demonstrar que as proteínas de fusão de Ig-CD1d são estavelmente imobilizados na superfície das esferas magnéticas. Como mostrado na Figura 2A, CD1d-Ig e anticorpos anti-CD28 foram ambas expressas na superfície das esferas magnéticas. Para examinar a capacidade estimulante da AAPC, nós co-cultura de células hibridomas NKT com AAPC durante a noite, sobrenadantes colhidos a cultura e medida de produção de IL-2 por ELISA. Descobrimos que CD1d-Ig baseado AAPC foram capazes de estimular os hibridomas de células NKT a níveis iguais ou superiores do que os seus homólogos celulares (Figura 3, os dados não mostrados). Curiosamente, descobrimos que nosso mouse hibridomas de células NK são estimuladas por CD1d humana baseada AAPC (Figura 2B), o que proporciona um método simples para testar cada lote de AAPC. Em seguida, procurou-se demonstrar o potencial de propagação de AAPC, assim células T humanas foram isoladas do sangue periférico. Primeiro, o CD161 + CD3 + fracção de células T foram enriquecidas por separação esfera magnética. Em seguida, as células T foram estimuladas duas vezes por semana com α-GalCer-carregado AAPC. Importante, verificou-se que mesmo com uma população de células relativamente baixa inicial NKT (0,03%), que foi capaz de expandir as células para ~ 67% Vα24 + Vβ11 + (Figura 3). Nós expandimos as células NK do PBMC de muitos voluntários saudáveis ​​e pacientes com câncer e descobriram que a α-GalCer carregado AAPC foram capazes de expandir a população de células NKT em ambos os grupos. Notavelmente, a taxa de expansão era altamente dependente do doador. Como esperado, a mais elevada da população inicial de células Vα24 +, maior será a percentagem de expansão. Além disso,quando se utiliza uma população inicial de 2 milhões de células CD161 + células T CD3 +, pode-se obter&gt; 10 7 células após dois ciclos de expansão (Tabela 1). Cerca de 80-90% das células expandidas NKT são CD4 +, ~ 5% de CD8 +, e os restantes são presumivelmente CD4-CD8-negativas duplas células NKT. Estas células expandidas NKT podem ser utilizadas para estudos funcionais, tal como mostrado na Figura 4A-C. Descobrimos que o nosso expandidas ex vivo de células NKT permanecer responsivo a α-GalCer estimulação e são produtores potentes de IL-17A, TNF-α e IFN-γ. Deve notar-se que, se a população inicial de enriquecimento de células T é baixa e se é incapaz de realizar a etapa de enriquecimento de CD161, a expansão AAPC mediada não pode produzir os resultados esperados (ver Figura 4D, Dador 1). No entanto, se a percentagem de células NKT circulantes é superior a 0,1%, deve ainda ser capaz de obter uma expansão significativade células NKT i. Colectivamente, estes dados demonstram que CD1d based-AAPC pode ser eficazmente usada para expandir e estimular células humanas primárias NKT. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático da CD1d: Ig baseados aAPCs porções extracelulares da molécula de CD1d são fundidos com a região constante de uma proteína de cadeia pesada de imunoglobulina separados por um ligante curta de aminoácidos. Estas moléculas podem ser facilmente carregadas com antígenos lipídicos, tais como α-GalCer, simplesmente, incubando-as com um excesso de lipidos de interesse. AAPC foram feitas por acoplamento CD1d-Ig e anti-CD Abs a esferas magnéticas. Neste sistema, CD1d-Ig é utilizado para fornecer o sinal específico de antigénio cognato através do TCR e anti-CD28 mAb fornece o sinal de co-estimulação. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg /&quot; /&gt; Figura 2. . FACS coloração de proteínas de superfície sobre aAPCs aAPCs A) foram testados para a presença de CD1d: IgG dímero (através de coloração com a PE-conjugado anti-ratinho IgG1), assim como anti-CD28 anticorpo (utilizando FITC-conjugado anti-IgG2a de ratinho) . histogramas abertos indicam controlo isotipo; histogramas cheios representam os anticorpos indicados. CD1d-Ig AAPC Expressando pode estimular IL-2 por células NK. B) A + Vα14 NKT rato de células de hibridoma, DN32.D3, foi co-cultivadas com um meio, o antigénio solúvel (α-GalCer), descarregado AAPC ou α-GalCer-carregado AAPC. Os sobrenadantes da cultura foram colhidos e padrão sandwich ELISA foi usado para medir a produção de IL-2. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Figura 3. Expansão de células NK por CD1d-Ig revestidos células antígeno artificiais apresentando. (A) Primário CD3 + CD161 + duplas células positivas foram isoladas a partir de PBMC utilizando a separação magnética. As células seleccionadas foram estimuladas com α-GalCer carregado, CD1d-Ig AAPC revestida durante 14 dias. As células foram coradas para Vα24 e Vβ11 estimulação AAPC seguinte. (B) primária de células NKT humano mediado lise de uma linha de células B de linfoma. C1R-CD1d células incubadas com células NKT nas proporções indicadas na presença ou ausência de antigénio, uma GalCer (100 ng / ml) em 96 cavidades de fundo U-placas para 20-24 hr. Célula NKT lise celular mediada foi avaliada por ensaio de libertação 51Cr padrão. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Figura 4. Perfis de citoquinas de células NKT AAPC-expandidas. </strong&gt; Após estimulação com α GalCer carregado AAPC, durante duas semanas, as células expandidas NKT (1 x 10 5 / po) foram co-cultivadas com solúvel α-GalCer, PMA / Ionomicina, anti-CD3/28 microesferas, ou α-GalCer carregado AAPC (2 x 10 5 / po) durante 48 horas. (A) IL-17A, (B) de TNF-α, e (C) a produção de IFN-γ foi medida pelo padrão de citocinas ELISA. Os dados apresentados são a produção de citocinas net depois de subtrair os controles negativos (mídia e contas vazias). (D) As células T primárias foram isoladas a partir de PBMC utilizando separação esfera magnética. As células seleccionadas foram estimuladas durante duas semanas, com a indicação de um-GalCer carregado-AAPC. As células foram coradas utilizando Abs específicos para Vα24 + e + Vβ11 e analisadas por citometria de fluxo.

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Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Aqui nós descrevemos um método para ativar e expandir células humanas NKT de granel populações de células T com células artificiais apresentando antígeno (AAPC). O uso de CD1d baseado AAPC fornece um método padronizado para a geração de números elevados de células NKT funcionais.

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

17.9K visualizações.  University of Maryland. Aqui nós descrevemos um método para ativar e expandir células humanas NKT de granel populações de células T com células artificiais apresentando antígeno (AAPC). O uso de CD1d baseado AAPC fornece um método padronizado para a geração de números elevados de células NKT funcionais.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Imunologia e Infecção

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; Depleção de células T humanas antígeno específico da

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.