Este protocolo pode melhorar significativamente a expansão de células NK funcionais, não exaustivas e semelhantes à memória ex vivo em comparação com outras células alimentadoras baseadas no sistema de expansão. Este é um método mais simples em comparação com outros protocolos que usam células alimentadoras em que pulamos a etapa de isolamento da célula NK antes da expansão da célula NK. Este protocolo pode fornecer um número suficiente de células NK e CAR-NK para imunoterapia.
Esta técnica é altamente reprodutível. No entanto, usar novos materiais de partida frescos e tomar cuidado para não perturbar as células NK durante os primeiros dias de expansão é crucial. Comece identificando e seccionando as áreas de tecido viáveis usando equipamentos cirúrgicos estéreis para obter linfócitos.
Em seguida, coloque os tecidos seccionados em 30 mililitros de HBSS sem cálcio ou magnésio e mantenha o tecido no gelo até que esteja pronto para o isolamento. Trabalhando dentro de um armário de biossegurança, pice o tecido em cubos de menos de 0,5 centímetro com lâminas de barbear estéreis e fórceps. Coloque os pedaços de tecido picados, não mais de 4 gramas, nos tubos dissociadores de tecido e adicione 10 mililitros de colagenase IV aos pedaços de tecido.
Para picar o tecido completamente, trate os tubos dissociadores de tecido em um dissociador de tecido a 37 graus Celsius. Depois de remover os tubos do dissociador de tecido, triturar o tecido picado através de um filtro de células de nylon de 40 mícrons usando a extremidade traseira de uma seringa de 5 mililitros. Descarte os grandes fragmentos não digeridos.
Gire o eluente coletado a 400G por 5 minutos à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante antes de ressuspender os pellets celulares em sílica revestida de polivinilpirrolidona a 30% para remover as células adiposas. Gire as células conforme descrito antes de ressuspender o pellet celular em 9 mililitros de meio R-10. Para separar os linfócitos dos glóbulos vermelhos e das células polimorfonucleares, coloque cuidadosamente a suspensão celular em camadas sobre 4 mililitros de Ficoll ou meios de separação de linfócitos.
Separe as camadas centrifugando a 400G por 23 minutos à temperatura ambiente com a aceleração e os freios desligados. Em seguida, decante cuidadosamente a camada média-superior e colha a interfase contendo linfócitos infiltrantes de tecido. Lave as células com 10 mililitros de meio e prossiga para análise ou protocolo primário de expansão de células natural killer, ou NK.
Lave as células mononucleares do sangue periférico, ou PBMCs, e 100 células 221-mIL-21 irradiadas por gama separadamente por centrifugação a 400G por 5 minutos com 10 mililitros de meio R-10. Após a centrifugação, salve 1 x 10 para o 6º PBMCs para citometria de fluxo e misture 5 x 10 para o 6º PBMCs com 10 x 10 para o 6º 100 células 221-mIL-21 irradiadas por gama em uma placa especial de 6 poços. Adicione 30 mililitros de meio R-10 suplementado com interleucina-2 humana e interleucina-15 humana à mesma placa de 6 poços e incube a placa a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%, substituindo o meio a cada 3 a 4 dias.
Durante a incubação, registre o assassino natural total do sangue periférico, ou PBNK, a viabilidade do número de células e realize a citometria de fluxo a cada 3 a 4 dias para calcular a taxa de expansão celular NK. Adicionar 1,8 x 10 à 6ª célula 293T em 11 mililitros do meio D-10 por placa de 100 milímetros tratada e incubar células 293T a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. Em um tubo de 1,70 mililitros, misture 470 microlitros do meio sérico reduzido com 30 microlitros do reagente de transfecção.
Em um tubo separado de 1,70 mililitro, adicione 2,5 microgramas de plasmídeo pRDF, 3,75 microgramas de plasmídeo Pegpam3 e 2,5 microgramas de construção CAR no vetor SFG no meio sérico reduzido para fazer o volume final de 500 microlitros. Misture o conteúdo do tubo com o tubo de 1,70 mililitro preparado anteriormente de forma gotícula. Após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente, adicione 1 mililitro da mistura do tubo à placa de células 293T de forma gota a gota e coloque a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas.
Diluir a proteína retronectina com PBS até uma concentração final de 50 a 100 microgramas por mililitro. Adicione 500 microlitros da retronectina diluída em cada poço de uma placa de 24 poços não tratada. Em seguida, sele a placa usando parafilme e incube a placa a 4 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, centrifugar a placa de retronectina a 2, 103G por 30 minutos a 4 graus Celsius e descartar o sobrenadante. Depois de bloquear cada poço da placa de 24 poços com 1 mililitro de meio R-10, incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 1 hora. Filtre as células 293T previamente transfectadas usando um filtro de 0,45 mícron para coletar o sobrenadante do retrovírus.
Aliquot 2 mililitros do sobrenadante do retrovírus filtrado em cada poço da placa de retronectina de 24 poços. Centrifugar a placa de retronectina de 24 poços a 2, 103G por 2 horas em uma centrífuga pré-aquecida a 32 graus Celsius. Enquanto as placas estão sendo centrifugadas, colete as células PBNK expandidas do Dia 0 e conte as células usando Trypan Blue.
Diluir as células PBNK expandidas com meios R-10 suplementados com interleucina-2 e interleucina-15 até a concentração de 2,5 x 10 para a 5ª a 5 x 10 para a 5ª célula por mililitro. Após a centrifugação da placa de retronectina de 24 poços, aspirar parcialmente o sobrenadante do retrovírus de cada poço. Em seguida, adicione 2 mililitros das células PBNK expandidas diluídas a cada poço.
Centrifugar a placa a 600G durante 10 minutos a 32 graus Celsius antes de incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas. Transfira as células da placa de 24 poços para um tubo de centrífuga de 50 mililitros para centrifugar o tubo a 400G por 5 minutos. Depois de ressuspender o pellet com 1 mililitro de meio R-10, transfira as células ressuspensas para uma placa especial de 6 poços contendo 30 mililitros de meio R-10 suplementado com interleucina-2 e interleucina-15.
Incube a placa especial de 6 poços a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com meios refrescantes e calcule a taxa de expansão da célula NK a cada 3 a 4 dias. As células PBNK expandidas por 221-mIL-21 mostraram expandir-se quase 5 x 10 para a 4ª dobra. E a pureza da célula NK foi mantida em torno de 85% durante a expansão de 21 dias.
Antes da expansão, a robustez do sistema de expansão 221-mIL-21 foi examinada pela coloração de PBMCs para anti-CD56 e anti-CD3, que mostraram uma pureza celular de 7,09% para células NK e uma alta porcentagem de células T. No 4º dia de PBMCs e cocultura de 221-mIL-21, a pureza NK foi verificada antes da transdução CAR-NK. As células CAR-NK coradas para anti-CD56, anti-CD3 e anti-IgG humana mostraram uma alta população de células NK no Dia 7 e uma alta eficiência de transdução CAR de aproximadamente 70% foi observada.
No 18º dia, a expressão de RCA em vários subconjuntos foi verificada com citometria de fluxo. Após a expansão das células NK, as células podem ser usadas para ensaios funcionais in vitro ou para experimentos in vivo. O pesquisador pode usar este protocolo para expandir NK e CAR-NK para pacientes com deficiência funcional de NK, bem como outras espécies, como cães.
