Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) e KFO 146 (MF), o Departamento de Defesa DOD concessão PC 040972 (MO) e do Instituto Nacional de Saúde concede SR1 CA108835 , SR1 Ai44129 (JPS)

1 Geração de HLA-A2-Ig Baseado KaAPC <ol><li> Preparar tampão de borato estéril. Adicione uma solução de ácido bórico em água de 0,1 M e ajustar o pH para 7,0. Filtro estéril (0,22 mm) de tampão e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar o tampão de lavagem talão estéril. Utilize tampão fosfato salino (PBS) sem cálcio e magnésio. Adicionar soro AB humano a 3% de concentração final. Adicionar ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para uma concentração final de 2 mM. Adicionar azida de sódio (NaN3) a 0,01% para a concentração final. Filtro estéril (0,22 mm) de tampão e armazenar a 4 ° C. </li><li> Transferir 250 mL de contas de epóxi (cerca de 100 x 10 6 esferas) de estoque em um estéril, tampa de rosca frasco de vidro. </li><li> Adicionar 250 ul de tampão de borato. </li><li> Coloque frasco de vidro em um ímã e deixe contas aderir por 2 min; tampão aspirado e remover frasco de vidro do ímã. </li><li> Lavar as pérolas uma vez com 1 ml de tampão de borato. </li><li> Ressuspender as esferas em 550 ul de 0,018 ug/ Ml de HLA-A2-Ig e 3,64 ug / ml de anti-humano CD95 mAb (clone CH11) e misturar suavemente por agitação. (Por favor, consulte a seção de discussão para obter mais informações.) </li><li> Incubar frasco de vidro em uma extremidade rotador durante final, a 4 ° C durante 24 hr. </li><li> Girar as pérolas a 300 xg durante 2 min. </li><li> Coloque frasco de vidro em um ímã para 2 min e aspirar a &quot;solução de carregamento KaAPC&quot;; remover frasco de vidro do ímã, adicionar 1 ml de tampão de lavagem talão e ressuspender cuidadosamente por agitação. </li><li> Repita o passo 1.10 duas vezes. </li><li> Incubar frasco de vidro num rotor a 4 ° C durante 24 h, em 1 ml de tampão de lavagem de grânulo. Neste ponto, todos os locais de ligação de proteína residual será bloqueada pelo soro AB humano contido no tampão de lavagem talão. </li><li> Girar as pérolas a 300 xg durante 2 min. </li><li> Coloque frasco de vidro em um ímã para 2 min e tampão aspirado lavagem talão; remover frasco de vidro do ímã e solução substituir com 1 ml de PBS. </li></ol> 2 Controle de Qualidade, Peptide Carregando, Wcalcinação, Armazenamento e Estabilidade da KaAPC <ol><li> Transferir 1,5 x 10 5 KaAPC para um tubo de FACS e lava-se com 1 ml de tampão de lavagem de FACS. </li><li> Ressuspender as pérolas em 100 ul tampão de lavagem de FACS e adicionar 1 ml de anti-IgG1 de ratinho PE (para a detecção de a parte Fc do HLA-A2-Ig) e 1 uL de anti-IgM de ratinho FITC (clone R6-60.2, para detecção do mAb anti-CD95 humano). </li><li> Incubar durante 15 minutos a 4 ° C, lava-se com 1 ml de tampão de lavagem de FACS, e ressuspender em 250 ul de tampão de lavagem de FACS e ler coloração por citometria de fluxo. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 QC mancha de um lote KaAPC feito como indicado na secção de protocolo. Coloração foi realizada como descrito na secção de protocolo 2 de HLA-A2-Ig foi detectada utilizando um anti-murganho-PE mAb IgG1, ao passo que anti-humano CD95 (anti-Fas) foi detectada com um anticorpo anti-ratinho-FITC mAb IgM (ver protocolo sicção 2.2) (linha azul). Gráficos pretos, cheios representam pérolas vazias corados com anti-mouse-IgG1 PE mAb ou anti-mouse-IgM FITC mAb, respectivamente. Números no canto superior direito indicam a intensidade de fluorescência média (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="4"><li> Para peptídeo transferência de carga 20 x 10 6 KaAPC em um novo frasco de vidro esterilizado, coloque em um ímã para 2 min, aspirar PBS e ressuspender em pérolas 500 mL PBS fresco com 5 mg peptídeo (Tenha em mente, apenas peptídeos HLA-A2 restritas vai ligar-se ao dímero!). </li><li> Loja carregado KaAPC a 4 ° C até à sua utilização, por pelo menos 3 dias, para permitir o carregamento de péptido suficiente para o dímero de HLA-A2-Ig. </li><li> Imediatamente antes da utilização, lavar o péptido carregado KaAPC como indicado em 1,14; repita este passo pelo menos 6x. NOTA: Este é um passo fundamental para garantir que o peptídeo livre tem to ser removido completamente para evitar falsos resultados positivos de extermínio; péptido livre residual foi mostrado para induzir apoptose em culturas de células T específicas para o antigénio 9. Para excluir um efeito peptídeo solúvel, executar amostras de controlo de sobrenadante de peptídeo carregado e lavado KaAPC (ver 3.8). </li><li> Contagem contas usando hemocitômetro e etiqueta com data, nome do peptídeo e concentração. NOTA: carregados KaAPC permanecer funcional, a 4 ° C durante pelo menos um mês. Após um mês, re-carregamento com o mesmo péptido permite KaAPC para ser utilizada até um ano. </li></ol> 3. KaAPC In Vitro Ensaio Killing <ol><li> Prepare a mídia de co-cultura. Preparar meio RPMI completo suplementado com factor de crescimento de células T de 3% (fabricado no laboratório 6) e 3% de doadores de plasma autólogo. Se doador de plasma autólogo não estiver disponível, usar soro AB humano inativado pelo calor. </li><li> Preparar tampão de ligação AnnexinV preparação. Dissolve-se 8,12 g de cloreto de sódio (NaCl) e 0,12 g calccloreto de io (CaCl 2) em 990 ml de ddH 2 O.Add 10 ml de tampão de HEPES 1M. </li><li> Gerar células T específicas de antigénios humanos. (Para um protocolo detalhado, consulte a publicação anterior 7 utilizando artificiais células apresentadoras de antígenos (AAPC)). Certifique-se de que a especificidade de peptídeo é, pelo menos,&gt; 75%, como determinado por coloração de tetrâmero. </li><li> Para cada amostra incubar por 2 x 10 5 células T específicas de antigénio / poço (em 96 poços redondos de fundo da placa), em 200 ul de meio de co-cultura a uma razão de 1: 1 com KaAPC durante 48 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Amostras de colheita e transferir para um tubo de FACS; lava-se com 1 ml de tampão de ligação AnnexinV, girar a 300 xg durante 5 minutos, rejeitar o sobrenadante e ressuspender em 100 ul de tampão de ligação AnnexinV </li><li> As amostras de manchas com 1 ul AnnexinV FITC e 5 ul de 7-AAD para 10-15 min à temperatura ambiente, lava-se com 1 ml de tampão de ligação AnnexinV; girar a 300 xg por 5 min, elimine o sobrenadante umd ressuspender em 250 ul de tampão de ligação AnnexinV </li><li> Leia amostras imediatamente em citômetro de fluxo. </li><li> Prepare as seguintes amostras para determinar assassinato antígeno-específica por KaAPC: apenas células T; As células T anti-CD95 + solúvel; As células T + descarregado KaAPC; Células T + péptido não carregado KaAPC cognato; Células T + péptido cognato carregado KaAPC; Células T + sobrenadante de peptídeo cognato carregado KaAPC. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figura 2 KaAPC matando ensaio Peptide carregado KaAPC ou esferas de controlo (HLA-A2-Ig apenas grânulos) foram cultivadas durante 48 horas a uma razão de 1: 1 com células T específicas CMVpp65 (~ 80%), recolhido e subsequentemente corados com AnnexinV e iodeto de propídio (PI) para determinar a apoptose por citometria de fluxo (ver secção protocolo de 3,3-3,7). &quot;cognato&quot; refere-se a esferas carregadas com CMVpp65 e &quot;não-cognato&quot; para seranúncios carregados com Mart-1 péptido. Os números indicam a porcentagem de células T viáveis ​​no quadrante inferior esquerdo de cada parcela. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="9"><li> Para executar as experiências cruzadas-, gerar células T específicas para o antigénio de duas especificidades diferentes. </li><li> Além disso avaliar a depleção-capacidades específicas de antigénio de KaAPC com uma análise simultânea da eliminação específica de antigénio de células T na população de células T heterogénea. (Para um protocolo detalhado consulte Schütz et al. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS e MF não têm nada a revelar. Sob um acordo de licenciamento entre NexImmune e da Universidade Johns Hopkins, drs. Schneck e Oelke têm direito a ações de royalties recebidos pela Universidade em vendas de produtos AAPC descritos neste artigo. Eles também possuem ações NexImmune, que está sujeita a certas restrições no âmbito da política da Universidade. Dr. Schneck é um membro da companhia &quot;s Conselho de Administração e do Conselho Consultivo Científico. Os termos deste acordo estão a ser geridos pela Universidade Johns Hopkins, de acordo com o seu conflito de políticas de interesse.

O passo mais importante no protocolo é garantir a proporção adequada de sinal 1 (peptídeo MHC) e sinal de 2 (anti-Fas mAb). Realizamos experimentos de titulação intensivos para definir a relação perfeita para o sinal 1 e 2; , tornou-se evidente que variações mínimas, devido às diferenças no dímero de HLA-A2 ou concentrações de Ig anti-Fas de mAb pode interferir com a funcionalidade do KaAPC. Assim, a concentração de ambos os sinais deve ser sempre verificada e a qualidade de ambas as proteínas devem ser frequentemente testado mesmo que foi pedido de uma fonte comercial. Além disso, as concentrações deverão ser sempre determinada pelo mesmo ensaio como ensaios de detecção de diferentes pode resultar em diferentes concentrações. Funcionalidade do HLA-A2-Ig também pode ser prejudicada devido a refolding incompleto e / ou carregamento peptídeo ineficiente. Além disso moléculas dímero pode agregar em diferentes graus, o que pode ter impacto sobre a atividade funcional da proteína. Portanto, a actuai quantidade de dímero necessário para a geração de um KaAPC funcional específico e pode variar. Além disso, verificou-se que o intervalo ideal para a indução da morte de sinal de anti-Fas sobre mAb KaAPC é extremamente apertado. Nas nossas mãos quantidades maiores 3,64 ug / ml de levar a morte não específica de células T positivas para Fas, enquanto quantidades inferiores a 3,64 ug / ml resultou numa reduzida actividade de morte, dependendo da dose. Embora estas condições parecem muito apertado, a atenção a estes detalhes irá resultar na geração de um KaAPC funcional e específico. Embora a corrente de fenótipo KaAPC é funcional para a depleção de células T específicas de antigénio activadas, as experiências iniciais de segmentação de células específicas para o antigénio T naive em repouso ou não demonstrou nenhuma indução significativa de apoptose específica de antigénio, como estas populações reduziram a expressão de Fas. Portanto, pode-se prever a adição de um sinal co-estimulador para a KaAPC para induzir o aumento da regulação do Fas em células T em repouso para se transformá-losem uma meta para o KaAPC. Embora isto seja possível, todos os três sinais terá de ser cuidadosamente ajustada para garantir um fenótipo KaAPC funcional. Ajustar a plataforma de talão a uma matriz biocompatível ou biodegradáveis ​​irá melhorar KaAPC na aplicabilidade vivo. Recentemente, Shen et al. Relatam a utilização bem sucedida em vivo dos KaAPC 5 utilizando esferas de látex iM conjugado com anti-Fas (clone JO2) e anti-His / H2-K b -TRP2 11. Temos sido capazes de mostrar que o conceito geral de células apresentadoras de antígenos artificiais (AAPC) podem ser transferidos com sucesso de mM dimensionado para partículas de tamanho 12 nm e que a funcionalidade é influenciada pela geometria da partícula 13. Assim, fazendo variar o tamanho e / ou forma de um futuro KaAPC desenhos pode ser capaz de afectar a funcionalidade in vivo e a biodistribuição, a qual pode ser a chave para o sucesso do tratamento de doenças auto-imunes específicas de órgãos. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC superar os principais problemas da estratégias depleção de células com base em um fácil de usar &quot;off the shelf&quot;, tempo e custo abordagem eficiente, que é independente da condição de doador e pré-tratamento. KaAPC não são alvos de auto ou de sinalização parácrina assassinato e não é sensível a funções efetoras citoléticas dos CTL. KaAPC exigirá a identificação do antígeno da doença em causa e contamos com o seu tipo de HLA específico. Embora actualmente numerosos antigénios de HLA-A2 restrito adequados para a diabetes tipo 1, esclerose GvHD e múltiplos foram identificados 2, o desenvolvimento de HLA de classe I suplementar dímero moléculas, bem como a identificação de novos antigénios em curso relevantes autoimunes irá aumentar e alargar a aplicabilidade de outro KaAPC. Além disso pode-se pensar em usar KaAPC dirigida a diferentes epítopos para atingir múltiplos antígenos simultaneamente. Em resumo, KaAPC representam uma tecnologia de plataforma flexível para umaespecíficos do tigen depleção de células T. Sua natureza &quot;lego-like&quot; possibilita a inclusão de novos sinais, como sinais co-estimulatórios ou inibitórios adicionais, como PD1 ou TRAIL em várias matrizes, o que poderia ampliar e melhorar a sua posterior in vitro e in vivo aplicabilidade. Nós apresentamos aqui o protocolo de passo-a-passo para gerar KaAPC, a abordagem baseada em primeiro talão para a eliminação de células T específicas de antigénios a partir de misturas de células T com especificidades diferentes. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. KaAPC eliminar CTL de uma forma específica para o antigénio marcado com PKH26 activado Fas + CTL efectoras da memória e PKH67-rotulado CTL específica CMVpp65-a partir do mesmo dador foram misturados com uma mistura 1:. Proporção e co-cultivadas com 1 CMVpp65 KaAPC durante 48 h. As culturas de controlo foram tratados com KaAPC descarregado, ou 1 ug / mlsolúvel de anti-Fas-mAb (clone CH11). Perda mínima de células viáveis ​​foi determinado em culturas não tratadas CTL mistos (mistura T). FACS dados originais para cada população CTL da mistura T são mostrados. Análise de apoptose foi realizada como anteriormente publicado por gating separado em ambas as populações de células T 10. Os números representados nos quadrantes superior esquerdo representa% de células totais. A figura ilustra é derivado de uma experiência representativa de três experiências independentes. Esta pesquisa foi originalmente publicado em Sangue. . Schutz, C. et al assassino células apresentadoras de antigénios artificiais: uma nova estratégia para eliminar as células T específicas de sangue.. 2008; 111, 3546-52. Direitos de autor da Sociedade Americana de Hematologia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Ao longo das duas últimas décadas muito progresso foi feito na compreensão dos mecanismos patogénicos de doenças auto-imunes. No entanto, os tratamentos mais comuns ainda dependem de corticosteróides, bem como drogas imunossupressoras, como análogos de purina, agentes alquilantes e inibidores da calcineurina 1. O uso de tais drogas tem melhorado muito o prognóstico dos pacientes, no entanto, o tratamento não fornece uma cura do mau funcionamento imunológico subjacente. Além disso, os pacientes tornam-se vulneráveis ​​a infecções e ao desenvolvimento de câncer. Por isso, o objectivo final no tratamento de doenças auto-imunes mediadas por células T e a rejeição do enxerto é alvejar especificamente apenas as células T causadoras de doenças, enquanto, ao mesmo tempo, deixando o restante do sistema imunitário intacto e competente para lutar contra distúrbios imunológicos. Utilizando células apresentadoras de antígenos (APC), como um tratamento para suprimir respostas de células T do sangue periférico foi descrito pela primeira vez já emdécada de 1970 por vários grupos. Desde então, diversos métodos à base de células têm sido desenvolvidos (revisto em Schutz et ai. 2). Estratégias utilizando-expressando FasL assassino-APC como células imunorregulatórios mostrou resultados promissores, indicando potencial terapêutico para o tratamento de auto-imunidade, rejeição do enxerto e infecções crônicas. No entanto, existem limitações significativas com as estratégias que utilizam FasL Killer-APC que, em última análise limita a sua aplicabilidade clínica; (I) a geração ou isolamento de APC é de tempo, trabalho e custos intensivos (ii) pacientes que sofrem de citopenia devido a imunossupressão fornecer quantidades e qualidade de células limitadas (iii) revestimento ou a transdução de sinais com a APC indução de apoptose, tais como os resultados de FasL altamente fenótipos e (iv) Killer-APC são sensíveis a citotóxica funções efectoras de células T, reduzindo, consequentemente, o seu potencial terapêutico. Portanto, é difícil garantir um reprodutível fenótipa Killer-APC definidatipo que pode ser utilizado para a modulação específica de antigénio de respostas de células T in vivo. Com base no nosso trabalho anterior com FasL expressando Killer-APC e 3-5 células apresentadoras de antigénios artificiais (AAPC) 6,7 nós desenvolvida uma abordagem baseada no talão (KaAPC) para a inibição específica de antigénio ou eliminação de células T auto-reactivas, em vitro. KaAPC consistem de um dímero de HLA-A2-Ig (sinal 1) e um mAb anti-Fas (apoptose sinal indutor) covalentemente imobilizada sobre uma superfície de um 4.5 mm de paramagnética esférula de látex. Eles depleção das células T específicas de antigénio de uma maneira mediada pelo Fas / FasL, a partir de culturas de células T de múltiplos especificidades de uma maneira específica do antigénio e independente da morte celular induzida por activação (AICD) via. Dose apoptose dependente de células T-alvo é induzida rapidamente já depois de 30 min 8. KaAPC podem ser facilmente gerados, de forma controlada garantindo uma definida fora do phenot prateleiraYpê e superar a maioria das deficiências das estratégias de depleção de células baseado. Consequentemente, KaAPC exibir um grande potencial para o tratamento de doenças auto-imunes mediadas por células T e a rejeição do enxerto, o avanço do campo de estratégias de tratamento específicos de células T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

O tratamento atual das doenças autoimunes mediadas por células T se baseia principalmente sobre as estratégias de imunossupressão global, o que, no longo prazo, é acompanhado de efeitos colaterais adversos, tais como redução da capacidade para o controle de infecções ou neoplasias. Portanto, novas abordagens precisam ser desenvolvidas que visam apenas as células da doença mediação e deixar o sistema imunológico restante intacto. Ao longo da última década, uma variedade de estratégias de imunoterapia com base em células de modular as respostas imunitárias mediadas por células T tem sido desenvolvido. A maioria destes métodos baseiam-se em células apresentadoras de antigénio de indução de tolerância (APC). No entanto, além de ser tecnicamente difícil e incómodo, tais abordagens baseadas em células são altamente sensíveis a respostas de células T citotóxicas, o que limita a sua capacidade terapêutica. Aqui é apresentado um protocolo para a geração de células apresentadoras de antigénios artificiais assassinas não celular (KaAPC), que permite a depleção das células T patológicas, deixando o remaining sistema imunológico intacto e funcional. KaAPC é uma solução alternativa para imunoterapia celular, que tem potencial para o tratamento de doenças auto-imunes e rejeição de aloenxertos por regulação das respostas de células T indesejáveis ​​num local específico do antigénio.

As características deste protocolo definido incluem a geração de um fenótipo KaAPC que apresenta HLA-A2-Ig (sinal 1) e anti-Fas mAb (sinal de apoptose), ao mesmo tempo, o que em comparação com métodos baseados em células não é alterada pelo revestimento ou eficácias de transdução, e pode ser facilmente modulada durante a produção (Figura 1). Além disso, KaAPC, não são sensíveis às funções efectoras das células T citotóxicas e a sua funcionalidade não é dependente da qualidade das células apresentadoras de antigénios autólogos pré e pós manipulação in vitro. KaAPC são capazes de reduzir o número de células T específicas para o antigénio in vitro, quando carregado com o péptido cognato, enquanto a não-cognato carregado KaAPC não esgotam as células T (Figura 2). Portanto, KaAPC induzir a apoptose das células T de uma maneira especifica para o antigénio. Subsequentemente, utilizou-se KaAPC para depleção selectiva de células T específicas de antigénio a partir de uma mistura de diferentes células T specificities, demonstrando que apenas citotoxicidade mínimo estava vazando em células vizinhas T (Figura 3). Assim, KaAPC representam uma ferramenta excelente para a depleção in vitro específico de antigénio de células T específicas para o antigénio humano activadas com potencial aplicabilidade clínica para o tratamento de doenças auto-imunes e rejeição de aloenxerto.

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Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Orientações são apresentados para a produção de antigénio de células apresentadoras artificial assassino, KaAPC, uma ferramenta eficaz para a depleção in vitro de células T específicas de antigénios humanos e de uma solução alternativa para imunoterapia celular para o tratamento de doenças mediadas por células T auto-imunes num antígeno forma específica, sem comprometer o sistema imunitário remanescente.

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; Depleção de células T humanas antígeno específico da

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.6K visualizações.  Johns Hopkins University.  Orientações são apresentados para a produção de antigénio de células apresentadoras artificial assassino, KaAPC, uma ferramenta eficaz para a depleção in vitro de células T específicas de antigénios humanos e de uma solução alternativa para imunoterapia celular para o tratamento de doenças mediadas por células T auto-imunes num antígeno forma específica, sem comprometer o sistema imunitário remanescente. 

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Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Specific Antigen In Vivo Ensaio Killing usando células CFSE rotuladas Alvo

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Imunologia e Infecção

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Quantificação de células T antígeno-específicas humanas proliferating de CD4+ usando o éster do Succinimidyl do carboxyfluorescein

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...