Obrigado a Elena Mitsi (assistente de Investigação) e Ir. Carole Hancock (enfermeira Research) eo pessoal do teatro para a sua contribuição para as filmagens, e David Shaw (enfermeira da pesquisa) por seu apoio com os nossos bronchoscopies pesquisa. Agradeço também ao nosso Rebecca Dunphy voluntário para permitir que este procedimento a ser filmado.

1. Os assuntos são recebido à chegada pela enfermeira Respiratory Research <ol><li> O assunto tem sido jejum de&gt; 4 horas para alimentos sólidos e 2 horas para líquidos claros 1. </li><li> O procedimento é realizado como um caso dia com cheques pré-e pós-procedimento adequado (de acordo com a política do hospital padrão). </li><li> O sujeito usa um vestido hospital. </li><li> É inserida uma cânula de pequeno calibre (idealmente para o lado esquerdo) e permanece in situ até ao final do período de recuperação pós-procedimento 1. </li><li> Observações pré-procedimento são tomadas (pressão arterial, freqüência cardíaca, saturação de oxigênio [SATS]). </li><li> O assunto é transferido para a suíte broncoscopia. </li></ol> 2. O assunto está preparado para o procedimento na Suite por uma Research Clínico Respiratório Experiente em broncoscopia <ol><li> O equipamento de monitorização está em anexo, incluindo, 3-lead ECG, oxímetro de pulso e 1,10 esfigmomanômetro. Anestésicosapoio ic não é necessária, incluindo consentimento informado por escrito. </li><li> O oxigénio pode ser fornecido através de uma cânula nasal de até 4 L / min, para atingir sats&gt; 90% 1. </li><li> O operador verifica o broncoscópio, isso inclui a garantia de sucção eficaz por aspiração de soro fisiológico estéril. </li><li> A anestesia tópica com lidocaína é atingida nas vias nasais (utilizando Instillagel 1) e da mucosa oral (usando xilocaína) </li><li> Se a sedação é apropriado e solicitado pelo sujeito, midazolam é administrado 1. Um agente de reversão apropriado (flumazenil) está imediatamente disponível. </li><li> Equipamento de reanimação devem estar prontamente disponíveis 1,10. </li></ol> 3. O broncoscópio é inserido e posicionado <ol><li> A intubação é geralmente através do nariz. Se isto não é possível devido a pólipos nasais, cornetos inflamados, ou qualquer desconforto, então o assunto é entubados através da boca (boca-guarda é usado para prevenirdanificar o âmbito ou os dentes do assunto). </li><li> A anestesia tópica da laringe é completada usando 4% de lidocaína, geralmente um total de 4-6 mL é utilizado. Normalmente este provoca tosse em instilação. </li><li> As cordas vocais são passados, e mais anestesia mucosas utilizando 2 ml alíquotas de lidocaína a 2% na carina, na divisão do lobo inferior direito (MID) e lobo médio direito (RML) e na entrada RML. </li><li> O broncoscópio é posicionado dentro da RML, de preferência no segmento medial, numa posição em que é afastada o suficiente para estar em uma posição segura, mas não muito distante, de modo que as vias aéreas colapsa quando a sucção é aplicada (&quot;teste de interesse&quot; utilizando o botão de sucção ). </li><li> Bom posicionamento é indicado durante o teste piscadela por um broncoscópio, que pode ser totalmente mantido em posição pelo broncoscopista e uma via aérea que não fechar totalmente imediatamente na sucção suave. </li></ol> 4. O LBA é realizado <ol><li> Quatro de 60 ml são seringas précheio com soro fisiológico normal aquecido - 60 ml, 50 ml, 50 ml e 40 ml em seringas sucessivas. Quando o assunto e broncoscopista estão prontos a primeira seringa de soro fisiológico é instilada pela assistente broncoscopia, enquanto o broncoscopista mantém a posição na RML. </li><li> Sucção mão suave é então realizada pelo assistente usando a mesma porta e 50 ml seringa. </li><li> Este procedimento é repetido mais uma 3x, com um volume máximo de 200 ml usados ​​no nosso técnica específica. </li><li> O LBA recuperado é expelido suavemente em recipientes rotulados já realizada no derretimento do gelo. Embalagens de vidro podem ser presiliconized, a fim de inibir a adesão celular e maximizar o retorno celular. </li><li> O LBA parece nebuloso contra a luz com bolhas de sabão superfície formada por surfactantes. </li><li> O broncoscópio é lentamente totalmente retirado. </li><li> O LBA é transportado sem demora no gelo para processamento imediato. </li></ol> 5. Recuperação Assunto </p&gt; <ol><li> O assunto é recuperado para 2-4 hr pela enfermeira investigação respiratória em uma enfermaria. </li><li> Durante esse tempo, eles estão autorizados a descansar e só então comer e beber&gt; 60 min 1 após o procedimento (quando sua andorinha é avaliado como seguro), a fim de reduzir o risco de aspiração. </li><li> Observações Mensagem processuais são monitorados e registrados. Um exame clínico ocorre antes da descarga. </li><li> O assunto é informado predischarge sobre os efeitos colaterais comuns (febre, desconforto no peito submamária direita moderada, dor de garganta) e dado um número de contacto em caso efeitos colaterais significativos ocorrem 1. </li><li> O assunto é acompanhado em 1-5 dias após o procedimento com um contato clínico. Isto pode ser por telefone ou pessoalmente. </li></ol> 6. As células são isoladas no Laboratório - Executar em Degelo Onde Possível <ol><li> O volume de fluido de BAL é gravado e filtrada através de uma camada dupla de gaze estéril cotoneteremover tampões de muco em previamente arrefecido, estéreis tubos de centrífuga de 50 ml. </li><li> As células são sedimentadas por centrifugação a 500 xg, a 4 ° C durante 5-10 min e lavou-se por rotação em 50 ml de solução salina normal de frio. A centrifugação é repetida uma vez. </li><li> As células são novamente suspensas em meio de cultura (RPMI-1640 + 10% de soro fetal de bovino + 2 mM de L-glutamina + penicilina [40 IU / ml], estreptomicina [75 IU / mL], e anfotericina B [0,5 IU / ml]) e contagem diferencial realizadas utilizando um volume igual de azul de tripano e um hemocitómetro. </li><li> A suspensão de células é normalizado para a densidade necessária (usamos 1 x 10 6 células / ml), introduzido por pipeta em placas de cultura de tecidos adequados, e incubados a 37 ° C durante 3 horas para permitir a aderência de macrófagos. 1 ml desta suspensão de células por poço é adequado para placas de cultura de 24 poços. </li><li> Para o trabalho de linfócitos, após 3 horas de incubação, o meio de cultura é suavemente pipetados para cima e para baixo 3x, e recolhida. Este meio contém linfócitose macrófagos não aderentes e podem ser utilizados para avaliar a função dos linfócitos, mas também pode ser usado em passos de purificação, por exemplo, com pérolas magnéticas CD14 para remover os macrófagos. </li><li> Para o trabalho de macrófagos, após 3 horas de incubação, o meio é cuidadosamente removido com pipeta mínima e substituído com meio fresco, quente, sem antibióticos (RPMI 1640 + 10% de soro fetal de bovino + 2 mM de L-glutamina). Os macrófagos são aderentes à placa de cultura de tecido (ver Figura 1). </li></ol>

<ol>
	<li>BTS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+British+Thoracic+Society+Bronchoscopy+Guideline+Committee+-+A+sub-Committee+of+the+Standards+of+Care+Committee+of+the+British+Thoracic+Society.">The British Thoracic Society Bronchoscopy Guideline Committee - A sub-Committee of the Standards of Care Committee of the British Thoracic Society.</a> Thorax. 56 (Suppl I), 1-21 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+recommendations+and+guidelines+for+bronchoalveolar+lavage+(BAL)+report+of+the+European+Society+for+Pneumology+Task+Group.">Technical recommendations and guidelines for bronchoalveolar lavage (BAL) report of the European Society for Pneumology Task Group.</a> Eur. Respir. , 561-585 (1989).</li><li>Gordon, S. B., Irving, G. R., Lawson, R. A., Lee, M. E., Read, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+and+killing+of+Streptococcus+pneumoniae+by+human+alveolar+macrophages+are+influenced+by+opsonins.">Intracellular trafficking and killing of Streptococcus pneumoniae by human alveolar macrophages are influenced by opsonins.</a> Infect. Immun. 68, 2286-2293 (2000).</li><li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+immunoglobulin+responses+to+Streptococcus+pneumoniae+are+altered+but+not+reduced+in+human+immunodeficiency+virus-infected+Malawian+adults.">Pulmonary immunoglobulin responses to Streptococcus pneumoniae are altered but not reduced in human immunodeficiency virus-infected Malawian adults.</a> J. Infect. Dis. 188, 666-670 (2003).</li><li>Fullerton, D. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+CD4++T+cell+responses+to+respiratory+antigens+are+impaired+in+HIV-infected+adults.">Bronchoalveolar CD4+ T cell responses to respiratory antigens are impaired in HIV-infected adults.</a> Thorax. 66, 375-382 (2011).</li><li>Eagan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+fluid+immunoglobulin+from+HIV-infected+subjects+has+impaired+opsonic+function+against+pneumococci.">Lung fluid immunoglobulin from HIV-infected subjects has impaired opsonic function against pneumococci.</a> Clin. Infect. Dis. 44, 1632-1638 (2007).</li><li>Rose, A. S., Knox, K. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERS/ATS+statement+on+interventional+pulmonology+European+Respiratory+Society/American+Thoracic+Society.">ERS/ATS statement on interventional pulmonology European Respiratory Society/American Thoracic Society.</a> Eur. Respir. J. 19, 356-373 (2002).</li><li>Ettensohn, D. B., Jankowski, M. J., Duncan, P. G., Lalor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+in+the+normal+volunteer+subject.+I.+Technical+aspects+and+intersubject+variability.">Bronchoalveolar lavage in the normal volunteer subject. I. Technical aspects and intersubject variability.</a> Chest. 94, 275-280 (1988).</li><li>Ettensohn, D. B., Jankowski, M. J., Redondo, A. A., Duncan, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+in+the+normal+volunteer+subject.+2.+Safety+and+results+of+repeated+BAL,+and+use+in+the+assessment+of+intrasubject+variability.">Bronchoalveolar lavage in the normal volunteer subject. 2. Safety and results of repeated BAL, and use in the assessment of intrasubject variability.</a> Chest. 94, 281-285 (1988).</li><li>De Brauwer, E. I., Jacobs, J. A., Nieman, F., Bruggeman, C. A., Drent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage+fluid+differential+cell+count.+How+many+cells+should+be+counted.">Bronchoalveolar lavage fluid differential cell count. How many cells should be counted.</a> Anal. Quant. Cytol. Histol. 24, 337-341 (2002).</li><li>Mtunthama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malawians+permit+research+bronchoscopy+due+to+perceived+need+for+healthcare.">Malawians permit research bronchoscopy due to perceived need for healthcare.</a> J. Med. Ethics. 34, 303-307 (2008).</li><li>Pereira, W., Kovnat, D. M., Snider, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+cooperative+study+of+complications+following+flexible+fiberoptic+bronchoscopy.">A prospective cooperative study of complications following flexible fiberoptic bronchoscopy.</a> Chest. 73, 813-816 (1978).</li><li>Huang, Y. C., Bassett, M. A., Levin, D., Montilla, T., Ghio, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+phase+reaction+in+healthy+volunteers+after+bronchoscopy+with+lavage.">Acute phase reaction in healthy volunteers after bronchoscopy with lavage.</a> Chest. 129, 1565-1569 (2006).</li><li>Gritzfeld, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Human+Pneumococcal+Carriage.">Experimental Human Pneumococcal Carriage.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li></ol>

Andrea M. Collins é financiada pela Fundação Bill e Melinda Gates, e sem conflito de interesses em potencial. Ela recebeu fundos da Merck (MSD) e GSK para participar de conferências e taxas de palestras. 50 BALs pesquisa realizada de forma independente. Jamie Rylance é financiado pelo Wellcome Trust, e não tem nenhum conflito de interesse. Ele não recebeu outros fundos. 70 BALs pesquisa realizada de forma independente. Daniel G. Wootton é financiado por uma NIHR PhD Fellowship, e não tem conflitos de interesse. 40 BALs pesquisa realizada de forma independente. Angela D. Wright não tem conflito de interesses em potencial. Assistido com mais de 100 BALs pesquisa. Adam KA Wright não tem conflito de interesses em potencial. Ele processou mais de 50 amostras de LBA. Duncan G. Fullerton </strong&gt; Não tem conflito de interesses em potencial. 100 BALs pesquisa realizada de forma independente. Stephen B. Gordon não tem conflito de interesses em potencial. Ele recebeu fundos da Merck (MSD) e Novartis para participar de conferências. 400 BALs pesquisa realizada de forma independente.

Para alcançar bons resultados a seguir são úteis: <ol><li> Bom anesthetisation na base da língua e posterior orofaringe. Isto é importante porque melhora a tolerância processual do sujeito e conforto geral. </li><li> Ou um pediátrica (diâmetro externo 3,4-3,6 mm) ou broncoscópio adulto (4,8-5,9 mm de diâmetro externo) pode ser utilizado. </li><li> Se não houver qualquer desconforto durante a intubação nasal, entubação oral é a preferida. Em geral intubação nasal ou é uma técnica simples ou deve ser abandonada. </li><li> Após instilação inicial de lidocaína a orofaringe, o sujeito pode preferir broncoscópio de ser retirado pendente o início da anestesia, especialmente se o broncoscópio é inserido oralmente. </li><li> Certifique-se de, no mínimo, 10 x 10 ml seringas são pré-preenchido com apenas 2-4 ml de lidocaína. O ar deve ser deixada nas seringas que permitam melhorar a entrega dos anestesia diretamente sobre os fios e muco endobrônquicasa. </li><li> Desde tosse durante o procedimento reduz significativamente o rendimento BAL, usando salina aquecida e ter bons anestesia mucosas são importantes para reduzir isso. </li><li> Os 50 ml seringas devem ser previamente preenchido com soro fisiológico aquecido. É comum que os primeiros 50 ml de soro fisiológico instilado para produzir entre 10-20 ml devido à perda de espaço morto eo restante em execução nas vias aéreas terminais. Mais alíquotas retornar uma proporção maior de fluido. </li><li> O operador deve sempre verificar o broncoscópio antes da intubação, incluindo a garantia de sucção eficaz por aspiração de soro fisiológico estéril. A perda de sucção pode geralmente ocorrem devido à dobragem do tubo ou fugas em torno das ligações com o broncoscópio ou dispositivo de sucção. </li><li> Durante sucção manual, de preferência a via aérea não deve entrar em colapso. Se sucção recorrentemente colapsa as vias aéreas, os retornos do LBA são reduzidos a um mecanismo de válvula, e inflamação local e sangramento é mais provável: que por sua vez faz com que as vias aéreas mminério irritável e tosse mais provável. Escolhendo o subsegmentares ramo RML mais adequada e utilizando baixas pressões de sucção, portanto, são ambos importantes. </li><li> Quando o ar é constantemente aspirada verificar novamente a ligação da seringa para o broncoscópio e também a posição do broncoscópio nas vias aéreas distais. Se este é um problema recorrente, pós-procedimento garantir que não há buracos no próprio broncoscópio. </li><li> BAL dos fumadores é muitas vezes mais escura, devido à presença de partículas intracelulares. Fumantes podem tolerar a broncoscopia menos bem, e têm aumento da tosse. </li><li> O rendimento de volume preferível BAL é&gt; 100 ml. Um rendimento de 150 ml&gt; é excelente. Nós não tiveram quaisquer rendimentos&gt; 170 ml. Não existe uma relação linear entre o rendimento das células e BAL rendimento volume. </li><li> Rendimentos de &lt;100 ml são, em nossa experiência, mais propensos a levar a efeitos colaterais, como tosse, dor torácica e febre. Aconselhamos que os indivíduos com rendimentos de &lt;100 ml ser recoVered em decúbito lateral esquerdo, isso pode ajudar a drenagem de todo o líquido do pulmão remanescente. </li><li> Contato clínico deve ser feita com o assunto dentro de 1-5 dias para garantir que não haja efeitos colaterais. </li><li> Midazolam sedação é usada para &lt;50% dos indivíduos no Reino Unido e &lt;5% no Malawi. Midazolam não parece melhorar diretamente a tolerabilidade; alguns operadores acham que a sedação pode às vezes ser contraproducente na manutenção de um diálogo coerente (e reconfortante) com o assunto. </li><li> Na nossa experiência, não é uma curva de aprendizagem significativa com esta técnica. Por exemplo coordenação entre médico e enfermeiro, leva tempo e os rendimentos são muitas vezes inferiores no início do processo de aprendizagem. </li><li> Em indivíduos HIV positivos, usamos antibióticos profilaticamente prebronchoscopy. </li></ol>

Fundo A fibrobroncoscopia foi desenvolvido para a prática clínica, que é amplamente utilizado tanto para diagnóstico e terapêutica 1,2. A lavagem broncoalveolar (BAL) remove as células não aderentes e pulmão revestimento fluido a partir da superfície da mucosa, a biópsia é utilizado para recolher amostras de tecidos da mucosa e da submucosa. Em ambientes de pesquisa, BAL permite respostas de amostragem de inata (macrófagos pulmonares 3-5), celular (e B células T 6) e humoral (imunoglobulinas 7) dentro do pulmão. BAL é internacionalmente aceito para fins de pesquisa e 8 desde 1999 a técnica foi realizada em&gt; 1.000 indivíduos no Reino Unido e Malawi por nosso grupo. Nós usamos esta técnica em estudos de respostas imune inata, celulares e humoral ao antígeno pneumocócica incluindo experimental transporte humano pneumocócica 9,17, fumaça de biomassa 5, HIV e vacinação, e adjunto stu tratamentomorre em recuperação da pneumonia. Nossa técnica utiliza sucção de mão suave do líquido instilado, o que é projetado para maximizar o volume BAL voltou e aplicar a força mínima de cisalhamento em epitélio ciliado, a fim de preservar a estrutura e função das células dentro do LBA. Em um contexto de pesquisa BAL utiliza uma técnica diferente daquela praticada por médicos de cuidados respiratórios e intensivos (muitas vezes chamado de lavagem brônquica, lavagens, lavagem, ou LBA) que desejem obter o benefício terapêutico ou diagnóstico. A técnica de pesquisa foi concebida para a colheita de células e preservar a viabilidade para facilitar o crescimento de células em cultura ex vivo. Por estas razões, a técnica de pesquisa utiliza um maior volume instilado (tipicamente na ordem de 200 ml) e emprega aspiração manual para reduzir os danos celulares. Os pacientes recebem anestesia local, sedação consciente oferecido (midazolam), e toleram bem o procedimento com efeitos secundários mínimos. Subjetividade verbal e escritainformações t melhora a tolerância e consentimento informado é obrigatória 1. Objetivo O objetivo geral é que o procedimento deve ser seguro e eficaz. Assuntos não deve sentir qualquer perturbação fisiológica e os operadores devem sempre coletar mais de 100 ml de BAL de indivíduos. Após o procedimento, os indivíduos devem experimentar efeitos secundários mínimos. Segurança Segurança do assunto é de suma importância. Os assuntos são cuidadosamente selecionados de acordo com critérios de inclusão e exclusão claras. Este protocolo inclui uma descrição dos riscos potenciais e as medidas tomadas para mitigá-los. Contra-indicações para a broncoscopia pesquisa pode ser expressa como absoluto ou relativo, e estão incluídos em nosso protocolo de estudo como critérios de exclusão e inclusão. Nossos temas são todos selecionados para garantir plena saúde. Contra-indicações absolutasincluir coluna cervical instável, a hipóxia sem resposta, angina instável, diátese hemorrágica, e arritmia cardíaca maligna. Contra-indicações relativas, incluindo as condições associadas com o aumento das taxas de complicação, incluem: Geral: mal cooperativa assunto 1, qualquer problema médico significativo geral por exemplo, epilepsia, anterior broncoscopia mal tolerada, conhecido reações adversas à lidocaína ou midazolam, gravidez, má nutrição. Respiratória: hipoxia [saturações (SATS) no ar &lt;94%], hipercapnia, asma instável 1, prejudicado significativamente a função respiratória 1 (FEV 1 &lt;1 L), hipertensão pulmonar. Cardiovascular: uremia, no prazo de 6 semanas de infarto do miocárdio 1, obstrução da veia cava superior. Outros: imunossupressão (nosso grupo realiza regularmente este procemento em indivíduos HIV-positivos). Ver Tabela 1 - Riscos associados a BAL para a pesquisa.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:966px;" width="966">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:25px;">
			Material
			</td>
			<td style="width:161px;height:25px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:151px;height:25px;">
			Catalogue Number
			</td>
			<td style="width:410px;height:25px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Fibreoptic bronchoscope, light and suction source
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Surgical gown, sterile gloves
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sphygnomanometer
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For continuous patient monitoring
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Pulse oximeter
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For continuous patient monitoring
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			3 lead ECG monitor
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For continuous patient monitoring
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Nasal oxygen delivery 2-4l/min
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Lidocaine 10% spray (Xylocaine)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			AstraZeneca
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For topical anaesthesia
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Lidocaine hydrochloride 2%
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For topical anaesthesia
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Lidocaine gel (Instillagel)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Farco-Pharma, Germany
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Normal saline, sterile 200ml
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Warm to 30oC
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			10ml taper-end syringe (x10)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For administration of lidocaine
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Intravenous cannula 18G
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For administration of midazolam
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Midazolam
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For sedation
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Flumazenil
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Reversal of benzodiazepine sedation (emergency use only)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			60ml taper-end syringes (x4)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For normal saline injection and BAL fluid withdrawal.
			May require connector to attach to the injection port of the bronchoscope
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sterile gauze swab
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Vernaid, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sterile container for BAL fluid
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			See text and comments
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Siliconised glass bottles reduce macrophage adherence. Alternatively, 50ml centrifuge tubes may be used (total capacity 200ml)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Sigmacote
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			SL2
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Only if siliconised glass bottles used. NB: Harmful and flammable. If used, follow precautions detailed in manufacturer&#8217;s MSDS
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Centrifuge
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;"></td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			At least 4x50ml tube capacity. Refrigeration to 4oC preferred.
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Shandon Cytospin centrifuge
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Thermo Scientific, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			RPMI 1640 medium with L-glutamine
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			R8758
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Fetal bovine serum
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			F6178
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Penicillin-Streptomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			P4333
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Amphotericin B
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Sigma, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			A2942
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Tissue culture plates
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Greiner Bio-One, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			662160
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Alternative products available from other suppliers
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Glass microscope slides
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			unspecified
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Shandon cytofunnel
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Thermo Scientific, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			A78710003
			
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Shandon cytoclip
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Thermo Scientific, UK
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			59910052
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			For differential count only
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:244px;height:26px;">
			Hemacolor staining set (fixative, red and blue reagents)
			</td>
			<td style="width:161px;height:26px;">
			Merck, Germany
			</td>
			<td style="width:151px;height:26px;">
			111661
			</td>
			<td style="width:410px;height:26px;">
			Use according to manufacturer&#8217;s instructions
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bronchoalveolar lavage (bal) for research; obtaining adequate sample yield

Nós descrevemos uma técnica de pesquisa para fibrobroncoscopia com lavado bronco-alveolar (BAL), utilizando mão manual de sucção realizada, a fim de remover as células não aderentes e fluido de revestimento do pulmão a partir da superfície da mucosa. Em ambientes de pesquisa, BAL permite amostragem de inato (macrófagos do pulmão), celulares (B-e T-células), e humoral (imunoglobulina) respostas dentro do pulmão. BAL é internacionalmente aceito para fins de pesquisa e, desde 1999, a técnica foi realizada em&gt; 1.000 indivíduos no Reino Unido e Malawi por nosso grupo. Nossa técnica utiliza sucção de mão suave do líquido instilado, o que é projetado para maximizar o volume BAL voltou e aplicar a força mínima de cisalhamento em epitélio ciliado, a fim de preservar a estrutura e função das células dentro do LBA e de preservar a viabilidade para facilitar o crescimento de células em cultura ex vivo. Assim, a técnica de pesquisa usa um maior volume de instillate (tipicamente na ordem de 200 ml) e emprega aspiração manual para reduzir os danos celulares. Os pacientes recebem anestesia local, sedação consciente oferecido (midazolam), e toleram bem o procedimento com efeitos secundários mínimos. Informações sujeitas verbal e escrita melhora a tolerância e consentimento informado é obrigatório. Segurança do assunto é de suma importância. Os assuntos são cuidadosamente selecionados de acordo com critérios de inclusão e exclusão claras. Este protocolo inclui uma descrição dos riscos potenciais, e as medidas tomadas para mitigá-los, uma lista de contra-indicações, pré e cheques pré-procedimento, bem como técnicas de broncoscopia e laboratoriais precisos.

Bons resultados clínicos são um volume de mais de BAL 100 ml e um sujeito que tenha experimentado na maior parte, menor desconforto (ver Tabela 1). Isso requer um sujeito relaxado e cooperativo. O médico deve ser confiante, totalmente preparado (Materiais), e compreensão para com o voluntário. Variabilidade inter e intra-sujeito no rendimento celular (incluindo contagem diferencial) tem sido descrita. As contagens de células diferenciais de indivíduos saudáveis ​​são geralmente&gt; 90% de macrófagos com um pequeno número de neutrófilos (&lt;2%) e os linfócitos (5-10%). Células do LBA centrifugadas em lâminas de microscópio pode ser manchado com uma mancha nuclear diferencial para obter essa informação (Figura 1). Na Figura 1, as células de BAL foram fixadas e coradas com Hemacolor coloração de acordo com as instruções do fabricante. Pelo menos 300 células devem ser contados para a obtenção de resultados confiáveis ​​para os macrófagos,neutrófilos e linfócitos, células para 500 tipos de células mais raras. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Perigo </td><td> Risco </td><td> Redução neste protocolo: </td></tr><tr><td colspan="3"> Efeito da broncoscopia e BAL 1, 14 </td></tr><tr><td> Leve desconforto </td><td> &lt;25% 14, # </td><td> Analgesia e sedação adequada. Abordagem confiante e cuidar do assunto. </td></tr><tr><td> A epistaxe </td><td> &lt;1% # </td><td> Pressão leve por apenas intubação nasal. Se o desconforto assunto ou abertura estreitada - intubação oral, em seu lugar. </td></tr><tr><td> Hemorragia endobrônquica (hemoptise) </td><td> &lt;0,1% * 15 </td><td> Sem biópsias feita. O controle cuidadoso durante a broncoscopia - evitando mucosa respiratória. </td></tr><tr><td> Nausea, pneumonia vômito e aspiração </td><td> &lt;0,02% 14, # </td><td> Jejum para o alimento sólido&gt; 4 horas pré-procedimento 1. Anestesia tópica adequada. Posição Semirecumbent durante o procedimento. Observação pós-procedimento cuidadoso. </td></tr><tr><td> Febre </td><td> 0,01 14 - 1% #, 16 </td><td> Relaciona-se com a inflamação, e pode minimizado pela coleta máxima de BAL. Lóbulo único BAL só. # </td></tr><tr><td> Sore nariz / garganta e rouquidão </td><td> &lt;25% 14, # </td><td> Anestesia tópica adequada do nariz, garganta e laringe (minimizando tosse). </td></tr><tr><td> Infecção </td><td> &lt;0,1% em HIV negativo, 1% em HIV positivo 14, # </td><td> Procedimento de lavagem broncoscópio Standard 1. Lóbulo único BAL só. # O reconhecimento precoce da infecção: exame clínico dentro de 1 hora umad contato clínico de 1-5 dias após a broncoscopia. </td></tr><tr><td> Dor no peito / tosse </td><td> &lt;0,2% 14, # </td><td> Lóbulo único BAL só. Coleção Maximal BAL. # </td></tr><tr><td colspan="3"> Efeitos das drogas: a lidocaína, midazolam </td></tr><tr><td> Arritmia </td><td> Muito raro * </td><td rowspan="3"> Máximo de 5 mg / kg 14 de lidocaína utilizada. Soro fisiológico aquecido incutiu. # A oximetria de pulso (SATs&gt; 90% com suplementação de oxigênio), monitorização cardíaca durante todo o procedimento. Antagonista de benzodiazepínicos (flumazenil) imediatamente disponível. </td></tr><tr><td> Desorientação / agitação </td><td> &lt;0,1% † # </td></tr><tr><td> Depressão respiratória Cardio </td><td> Muito raro * </td></tr></tbody></table> * Não experientes no nosso grupo em mais de 1.500 procedimentos de pesquisa. † idiosyncratic vez de reacção dependente da dose. # Experiência do nosso grupo em mais de 1.500 procedimentos de pesquisa. Tabela 1. Os riscos associados à BAL para a pesquisa. Isto inclui o perigo ou risco e como esta é reduzida por meio da técnica descrita. Efeitos da broncoscopia / BAL e também os efeitos de quaisquer medicamentos utilizados estão incluídos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/4345/4345fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Uma lâmina de microscópio Mostrando BAL macrófagos e neutrófilos ocasionais. Células do LBA foram corrigidos em metanol e corados com Hemacolor vermelho (eosina Y) e azul (azul B).

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Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Nós descrevemos uma técnica de pesquisa para fibrobroncoscopia e lavado bronco-alveolar utilizando baixa pressão de sucção. A técnica é utilizada para colher células do sistema imunológico das superfícies broncoalveolar de pulmão. A anestesia local e sedação consciente leve (midazolam) é usado. Assuntos toleram bem o procedimento e experimentar efeitos colaterais mínimos.

Lavagem Broncoalveolar (BAL) de Investigação; Obtenção adequada Rendimento Amostra

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

bronchoalveolar-lavage-bal-for-research-obtaining-adequate-sample

Research

JoVE Journal

Medicine

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

73.0K visualizações.  National Institute for Health Research.  Nós descrevemos uma técnica de pesquisa para fibrobroncoscopia e lavado bronco-alveolar utilizando baixa pressão de sucção. A técnica é utilizada para colher células do sistema imunológico das superfícies broncoalveolar de pulmão. A anestesia local e sedação consciente leve (midazolam) é usado. Assuntos toleram bem o procedimento e experimentar efeitos colaterais mínimos. 

Vídeo: Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

Generation of Comprehensive Thoracic Oncology Database - Tool for Translational Research

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer specimens and clinical data to be available to researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database also captures a large volume of genomic and proteomic data obtained from various tumor tissue studies. A team of clinical and basic science researchers, a biostatistician, and a bioinformatics expert was convened to design the database. Variables of interest were clearly defined and their descriptions were written within a standard operating manual to ensure consistency of data annotation. Using a protocol for prospective tissue banking and another protocol for retrospective banking, tumor and normal tissue samples from patients consented to these protocols were collected. Clinical information such as demographics, cancer characterization, and treatment plans for these patients were abstracted and entered into an Access database. Proteomic and genomic data have been included in the database and have been linked to clinical information for patients described within the database. The data from each table were linked using the relationships function in Microsoft Access to allow the database manager to connect clinical and laboratory information during a query. The queried data can then be exported for statistical analysis and hypothesis generation.

A thoracic oncology database was developed to serve as a comprehensive repository for clinical and laboratory data for the purposes of translational research. The database will serve translational cancer researchers within the Thoracic Oncology Research Program. This database is adaptable to other cancer models, as well as other human diseases.

Geração de banco de dados de Oncologia Torácica Comprehensive - Ferramenta para Pesquisa Translacional

The Thoracic Oncology Program Database Project was created to serve as a comprehensive, verified, and accessible repository for well-annotated cancer ...

Medicina

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Oclusão bilateral artéria carótida comum como um estímulo pré-condicionamento adequados para induzir a tolerância isquêmica início da Isquemia Cerebral Focal

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Método para obtenção de células do cancro do ovário primárias de amostras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Trabalhando com tecidos humanos para Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future therapies. Severe lung injury with a reproducible deterioration of pulmonary gas exchange and hemodynamics can be induced in anesthetized pigs using repeated lung lavages with warmed 0.9% saline (50 ml/kg body weight). Including standard respiratory and hemodynamic monitoring with clinically applied devices in this model allows the evaluation of novel therapeutic strategies (drugs, modern ventilators, extracorporeal membrane oxygenators, ECMO), and bridges the gap between bench and bedside. Furthermore, induction of lung injury with lung lavages does not require the injection of pathogens/endotoxins that impact on measurements of pro- and anti-inflammatory cytokines. A disadvantage of the model is the high recruitability of atelectatic lung tissue. Standardization of the model helps to avoid pitfalls, to ensure comparability between experiments, and to reduce the number of animals needed.

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Repeated pulmonary lavages in anesthetized pigs induce lung injury resembling major aspects of human acute respiratory distress syndrome (ARDS). For this purpose the lungs are repeatedly lavaged with 0.9% saline at 37 &#176;C. The goal of the protocol is a reproducible mitigation of gas exchange and hemodynamics for research in ARDS.

induzida por lavagem de surfactante Esgotamento em porcos como modelo da Síndrome da Angústia Respiratória Aguda (SARA)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ function. Clarifying the mechanism of blood vessel formation is therefore extremely useful for elucidating developmental processes and pathological mechanisms. Murine hind-limb vessels are often used as a model for physiological and pathological angiogenesis. Evaluation is mainly performed via a two-dimensional method using tissue sections. However, methods for evaluating three-dimensional (3D) vascular morphology are particularly limited. This paper introduces a method for visualizing murine hind-limbs using computed tomography (CT). Radiation-opaque resin is injected through the descending aorta, and whole vessels are filled with dye. By adjusting the time of dye injection, arterial-specific filling is also possible, and samples can be obtained with any micro-X-ray CT device. This contrast method provides a basic technique for the 3D evaluation of murine blood vessels in the lower extremities. Furthermore, this method can be used to visualize all blood vessels below the diaphragm and evaluate blood vessels in the abdominal organs.

Here, we describe a visualization and quantification method for murine hind-limb vessels using micro-X-ray computed tomography.

Preparação amostral para visualização tridimensional baseada em tomografia computadorizada de vasos de membros traseiros murinos

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

Técnica para obtenção de células-tronco mesenquimais a partir da caracterização do tecido adiposo e da fração vascular estromal em criopreservação a longo prazo

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Preparing Zanba-Stir-Fried Tiebangchui (TBC) Sample for Processing Technology Optimization

To begin a single factor experiment to compare Tiebangchui, or TBC slice thickness, for processing technology optimization, prepare five test groups each having 30 grams of TBC, but different slice thickness. Then weigh 90 grams of Zanba, which is three times as much as that of the TBC in each group. Set the temperature and the time of the automatic stir fry machine to 140 degrees Celsius and 40 minutes respectively.After the machine has heated up to the set temperature, add the weighed amounts of TBC and Zanba into the machine. Then using a high speed smashing machine, grind the Zanba stir-fried TBC into powder. Next, weigh two grams of Zanba stir-fried TBC powder in a conical flask.To the sample in the flask, add three milliliters of ammonia solution followed by 50 milliliters of a mixture of isopropyl alcohol and ethyl acetate, having a volume ratio of one is to one. After recording the weight of the conical flask with the contents, ultrasonicate the TBC sample for 30 minutes at 220 volts and 40 kilohertz maintaining a temperature below 25 degrees Celsius. Weigh the conical flask with the sample once again after the ultrasonic extraction.Make up for the lost weight by adding the isopropyl alcohol and ethyl acetate mixture mentioned previously, and filter the sample solution. Evaporate 25 milliliters of the filtrate to dryness using a rotary evaporator at 40 degrees Celsius. Then dissolve the residue in five milliliters of a solution of 0.05 hydrochloric acid in methanol.Filter the solution through a 0.2 micron syringe filter, and analyze it by performing high performance liquid chromatography, or HPLC. Calculate the contents of the MDA and DDAs in different processing products according to the standard curve. Calculate the comprehensive score based on the results via the critic method.Following the method demonstrated above, compare the amounts of Zanba, processing temperatures, and times for processing technology optimization. The results of the single factor tests revealed that the comprehensive scores of Zanba stir-fried TBC were highest when the sliced thickness is two centimeters, the amount of Zanba is three times, the processing temperature is 120 degrees Celsius, and the processing time is 60 minutes. The results revealed the range of slicing thickness, amount of Zanba, processing temperature, and processing time to be used for future experiments.

Preparando a amostra de Tiebangchui (TBC) Zanba-Stir-Fried para otimização da tecnologia de processamento

Descoberta de biomarcadores não invasivos para proteômica lacrimal usando LC-MS

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

Autor em destaque: Avançando na análise do fluido lacrimal usando um protocolo padronizado para pesquisa proteômica 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

Preparação de amostra de suspensão de proteínas para proteômica lacrimal por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...