Os autores agradecem a Faculdade Regional VA-MD da medicina veterinária para a prestação de núcleo e suporte técnico para este projeto. Este trabalho é apoiado por uma NIH Career Award Desenvolvimento (K01DK092355).

Todos os estudos foram realizados no âmbito da aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso (IACUC) para Virginia Tech e de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Intratraqueal (IT) A inoculação de LPS usando a administração orofaríngea <ol><li> Certifique-se de que cada animal é identificado exclusivamente usando um soco ouvido, marca auricular, ou outro método aprovado institucionalmente. </li><li> Registe o peso do corpo de linha de base e da temperatura corporal de cada animal. </li><li> Prepare o estoque de trabalho de LPS. Cada ratinho recebe uma dose de 50 ul de 1 mg / kg de LPS em 1x tampão fosfato salino (PBS). Animais tratados Mock irá receber uma dose de 50 ul de PBS 1x. </li><li> Prepara-se uma câmara apropriada para a administração de isoflurano utilizando o seguinte método de gota. Diretrizes institucionais variar em relação ao uso de isoflurano e outros agentes anestésicos e antes deram inícioção a todos os estudos, as pessoas devem entrar em contato Departamento de Animal Care / Bem-estar da sua instituição para garantir as todas as diretrizes são adequadamente atendidas. Se o método queda isoflurano não é uma opção, outros agentes anestésicos são alternativas aceitáveis. <ol><li> Em um gabinete de segurança apropriado, aplicar cerca de 3 ml de isoflurano para uma toalha de papel absorvente dobrado e coloque no fundo de um copo de 500 ml. </li><li> Coloque um pequeno pedaço de uma folha de alumínio na parte superior da toalha de papel e cobrir o recipiente com uma tampa transparente. </li></ol></li><li> Preparar as ferramentas e os reagentes que serão utilizadas durante a ele inoculação. Coloque o elástico que irá garantir os animais cabeça no stand intubação. Este procedimento será necessário um par de fórceps em linha reta, um par de pinças angulares ou curvas, e uma pipeta p200 com dicas. </li><li> Carga 50 mL de LPS na ponta da pipeta e coloque em um local de fácil acesso, ao lado do stand intubação. </li><li> Anestesiar o mousea colocação do animal na câmara de isoflurano e cobrindo a câmara com uma tampa transparente. Observar os padrões de respiração do animal, que será rápida e superficial quando o primeiro colocado na câmara. O animal será suficientemente anestesiados quando as taxas de respiração aproximar 1 respiração / 2 seg, que normalmente é alcançado dentro de 30 segundos de colocar na câmara. O mouse deve ser anestesiado como indicado no protocolo aprovado animais utilizando o método de queda de isoflurano. </li><li> Retire o rato anestesiado da câmara e suspender o animal na intubação ficar por seus incisivos. Garantir que o animal está bem contido e da boca e língua são acessíveis. </li><li> Gentilmente garantir a língua com a pinça retas. Segure a língua com a pinça em ângulo e puxe-o para fora da boca até ligeira resistência é sentida. Esta ação é suficiente para bloquear a epiglote e ter acesso a traquéia. </li><li> Embora continuando a segurar a língua naposição prolongada, administrar a dose de 50 ul de LPS na parte de trás da garganta e cobrir imediatamente narinas do animal com um dedo de luva. O LPS será visível na parte de trás da garganta até que o mouse inala. </li><li> Continue a cobrir as narinas e segure a língua estendida para 5-10 respirações adicionais. </li><li> Retire o mouse do suporte intubação e coloque o animal de volta para uma nova gaiola até que ele se recupera da anestesia. </li><li> Monitorar marcadores substitutos associados à progressão da doença. O peso corporal ea temperatura do corpo devem ser monitorados a cada 4-8 horas para a duração do estudo. Da mesma forma, avaliar as características comportamentais e sintomas clínicos associados com o aumento da morbidade. </li><li> Para avaliar progressão da doença, os ratos de colheita no tempo pontos-específicos após a exposição LPS. Pontos de tempo típicos para a colheita, após exposição ao LPS incluem 0, 6, 12, 18, 24, e 48 horas. Para avaliar a recuperação e sobrevivência, avaliar os ratos para 7 days pós-inoculação. </li></ol> 2. Soro e Líquido da Lavagem Broncoalveolar (LBA) Coleção <ol><li> Sacrifique o mouse usando um método aprovado institucionalmente. </li><li> Colocar o animal em suas costas e prenda-o a uma placa de necropsia, idealmente 0,5 em (1,27 cm) de altura. </li><li> Molhe todo o rato com etanol 70%. </li><li> Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 27 G, realizar uma punção cardíaca antes de fazer qualquer incisões. Deve ser possível retirar 500-800 mL de sangue total a partir de um único rato. </li><li> Retirar a agulha da seringa e transferir todo o sangue para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml prelabeled. Para a recolha de soro, permitindo que todo o sangue de coagular durante, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente. Em adição à recolha de soro, este procedimento também pode ser modificado por incorporação de um anti-coagulante, no tubo e na seringa, antes da recolha do sangue total, para o estudo de células imunitárias em circulação. </li><li> Faça uma incisão horizontalatravessar o comprimento da cavidade peritoneal e feita uma incisão vertical a partir da cavidade peritoneal, para o maxilar inferior do rato. </li><li> Utilizando uma pinça, segure ambos os lados da incisão e puxe a pele longe das cavidades peritoneais e torácicos subjacentes. </li><li> Fazer uma grande incisão ao longo do comprimento da cavidade peritoneal dos genitais para o esterno, tendo o cuidado de evitar o corte do diafragma. Suavemente deslocar os intestinos na cavidade peritoneal, para permitir o acesso a um dos rins. </li><li> Cortar a veia renal que conduz ao rim para servir como um ponto de drenagem para perfusão. </li><li> Nick o diafragma com uma tesoura, tendo o cuidado de evitar os pulmões e coração, para expor o lado esquerdo do coração. </li><li> Perfuse manualmente o coração usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 27 G e solução 1x PBS. Evitar a aplicação de força excessiva durante a perfusão para assegurar que a solução salina não é forçado para dentro dos pulmões. O restante sangue é drenada a partir da incisão da veia porta.</li><li> Corte cuidadosamente a caixa torácica ao longo do esterno com uma tesoura sem corte / sem corte, tendo o cuidado de evitar o corte do coração e pulmões. Acidentalmente cortar os pulmões durante este processo irá reduzir de forma significativa a quantidade de LBA recolhido e irá resultar numa incapacidade para inflar os pulmões adequadamente com fixador. </li><li> Gentilmente isolar o coração e os pulmões de distância da caixa torácica com fórceps. Corte cuidadosamente cada seção da caixa torácica com uma tesoura sem corte / sem corte o mais próximo à coluna vertebral quanto possível e totalmente remover ambas as seções. </li><li> Separe as glândulas salivares, usando uma pinça ou removê-los com uma tesoura, para expor a traquéia. </li><li> Retirar cuidadosamente os músculos que revestem a traquéia com uma tesoura. É essencial que a traqueia não ser cortado durante este processo. </li><li> Com uma tesoura, separe a clavícula que recobre a traquéia. </li><li> Gentilmente segure o timo com a pinça e retire o tecido para fora do coração. Retire o timo com uma tesoura, tendo o cuidado deevitar o corte do coração ou os pulmões. </li><li> Faça uma pequena incisão horizontal na traquéia 1-2 anéis abaixo da laringe com uma tesoura em ângulo (45-90 º ângulo, afiada / afiada). A incisão deve ser grande o suficiente para prender firmemente a cânula. </li><li> Inserir a cânula de modo a que a extremidade afunilada prolonga-se 2-3 anéis de traqueia abaixo da incisão, e fixar a cânula no lugar utilizando uma sutura de seda. Certifique-se que a sutura passa entre a traquéia eo esôfago e está bem apertada na cânula. </li><li> Encher uma seringa de 1 ml com 1 ml de solução salina tamponada de Hanks (HBSS) e inserir o luer suavemente para dentro da cânula. </li><li> Com um movimento lento, mas constante, injetar ~ 900 mL na traquéia, inflando os pulmões, e retirar imediatamente o HBSS. Coloque o LBA recuperado num tubo cónico de 15 ml. </li><li> Repita esta lavagem duas vezes adicionais para coletar cerca de 3 ml de LBA para análise futura. Armazenar o LBA em gelo ou a 4 º C até que esteja pronto para uso. </li></ol><ol><li> Insira uma seringa de 10 ml no suporte inflação de pulmão. Montar o tubo para o luer, o luer da torneira, e a torneira de passagem para a seringa. Assegurar a torneira estiver na posição fechada. A seringa de 10 ml irá servir como um reservatório de escoamento por gravidade. O reservatório deve ser ligada ao suporte de inflação 4,75 em cima do animal e da parte superior do reservatório deve estender em 10,5 acima do animal. </li><li> Encha a seringa com solução neutra de formalina tamponada. Certifique-se de que a seringa está completamente cheio com o fixador. </li><li> Coloque uma toalha absorvente sob a extremidade aberta do tubo e abrir a torneira para permitir que o fixador para encher o tubo. Uma vez que o fixador começa a fluir a partir da tubulação, imediatamente fechar a torneira e encher a seringa até o topo com fixador. É importante que a seringa estar completamente cheio de fornecer a quantidade apropriada da pressão da inflação do pulmão. </li><li&gt; Passar suavemente um segundo pedaço de fio de sutura sob a traqueia, aproximadamente 1-2 anéis de traqueia abaixo da extremidade da cânula. </li><li> Amarre um único nó frouxo na sutura; no entanto, não puxe o apertado nó. </li><li> Insira o tubo da inflação do mouse ficar na cânula. </li><li> Abra a torneira e permitir que os pulmões para encher pela inflação gravidade. </li><li> Uma vez que os pulmões atingem o seu nível máximo inflação, puxe a sutura apertado e dê um segundo nó. </li><li> Fechar a torneira e remover o tubo a partir da cânula. </li><li> Remova cuidadosamente a cânula da traqueia, segurando a sutura com um par de fórceps e segurando a cânula com os dedos. Puxe firmemente a sutura para baixo em direção a cavidade torácica ea cânula de volta para o nariz do mouse. </li><li> Suavemente compreender a traqueia ou as suturas com uma pinça e levantar a traqueia de distância da cavidade do gargalo. </li><li> Sever do caudal traquéia para a sutura amarrado com uma tesoura sem corte. </li><li> Uma vez que o tracheum está livre dos tecidos subjacentes, começam a puxar a traqueia longe do rato. Levante cuidadosamente os pulmões para fora da cavidade torácica. </li><li> Corte cuidadosamente o tecido conjuntivo que prende os pulmões na cavidade torácica. Continue puxando a traquéia longe do corpo do mouse e aplicar a força ascendente constante ao cortar as conexões subjacentes. Tome cuidado para evitar o corte dos pulmões. Note-se que o coração deve ser deixado ligado para os pulmões usando esse método. </li><li> Uma vez que os pulmões foram retirados, colocá-los em 10 ml de formalina tamponada. </li><li> Remover uma seção da cauda do rato para genotipagem. </li><li> Descarte a carcaça do mouse seguindo as diretrizes institucionais adequados. </li></ol> 4. Avaliação de citocinas <ol><li> Centrifugar o sangue total, coletados na etapa 2.5, a 12.000 xg por 5 min para isolar o soro. Transferir o soro para um tubo de 1,5 ml prelabeled microcentrífuga e armazenar a -80 ° C. </li><li> Avaliar o seruníveis de citocinas por ELISA m ou outro ensaio semelhante. Diluir o soro de 1:05 - 1:20 em tampão de diluição adequado, dependendo do ensaio, seguindo as instruções do fabricante. Estas diluições devem ser determinados empiricamente antes de executar a maior parte das amostras. </li><li> Devido ao baixo volume de soro recolhido, reduzir o volume da amostra carregada na placa de ELISA para metade. Por exemplo, a maioria dos testes ELISA comerciais utilizam volumes de 100 ul dos padrões e amostras. Para conservar as amostras, carga 50 ul de normas e soro diluído por poço. </li><li> Centrifugar o LBA numa centrífuga de mesa refrigerada a 200 xg durante 5 min. Transferir o sobrenadante isento de células para dois tubos de 1,5 ml prelabeled e armazenamento de microcentrífuga a -80 ° C. </li><li> Avaliar citocinas LBA por ELISA ou outro ensaio semelhante, sem diluir. </li><li> Loja soro não utilizada e LBA a -80 ° C. </li></ol> 5. Coloração Diferencial e celularidade do LBA Avaliação <ol><li> Após centrifugação e remoção do LBA HBSS completa, a lise das células vermelhas do sangue peletizadas usando solução salina hipotónica. Ressuspender as células em 900 ul de água destilada. Imediatamente adicionar 100 ul de PBS 10x. </li><li> Individualmente lisar cada amostra. Se as amostras contêm uma quantidade excessiva de células vermelhas do sangue, as células podem ser sedimentadas no topo da mesa de centrifugação a 400 xg durante 5 minutos e o sangue protocolo de lise dos glóbulos vermelhos pode ser repetido. </li><li> Determinar a celularidade total de LBA na suspensão de 1 ml utilizando um hemacitómetro sob 10X ou ampliação de 20 X com coloração de Azul de Tripano. Avaliar e apresentar esses dados como células / ml. </li><li> Preparar materiais para a cytospin e coloração diferencial. Rotular lâminas de microscópio padrão usando um lápis ou uma caneta resistente a solventes. Fixe os slides em um suporte cytospin e funil. Fixe o conjunto de slides no rotor cytospin. </li><li> Cytospin 150 uL de BALF a 100 xg durante 5 min. Se a densidade de células é demasiado grande para efectivamenteavaliar a morfologia celular, reduzir o volume centrifugadas nas lâminas. Permitir que as lâminas para o ar durante a noite seca. </li><li> Diferencial manchar os slides seguindo os protocolos fabrica. Permitir que as lâminas para o ar durante a noite seca. Lamela os slides usando Permount e avaliar os slides usando um microscópio equipado com um objetivo 20X e 40X. </li><li> Colher as células restantes para análise posterior, como FACS, microscopia eletrônica, microscopia confocal, extração de RNA para avaliação da expressão gênica e / ou extração de proteínas por western blot. </li></ol> 6. Avaliação Histopatologia <ol><li> Prepare os pulmões para avaliação histopatológica. Após 24-48 horas de fixação em formalina, ventrally orientar todo os pulmões inflados e embebidos em parafina. Cortar os blocos resultantes para expor o condutor principal da via aérea. </li><li> Para melhorar a precisão de pontuação, posicione os pulmões na mesma posição e aparar cada bloco para produzir a visualização máxima longitudinal de tele intrapulmonar principal via aérea axial. A partir deste ponto, corte de 5 mícrons cortes seriados e mancha com hematoxilina e eosina (H &amp; E). Secções adicionais podem ser cortadas e preparadas para hibridação in situ, utilizando protocolos padrão. </li><li> Avaliar histopatologia usando um sistema de pontuação semi-quantitativo com base nos seguintes parâmetros inflamatórios, que são marcados entre 0 (ausente) e 3 (grave): mononucleares e polimorfonucleares infiltração de células; vias aéreas hiperplasia das células epiteliais e lesões; extravasamento; perivascular e cuffing peribroncheolar; e a percentagem do pulmão envolvido com a inflamação. Histopatologia do pulmão devem ser avaliadas por um patologista experiente. </li><li> Média de todas as notas de parâmetros para gerar uma pontuação total histopatologia ou utilizar os resultados individuais de quantificar aspectos específicos da progressão da doença. Exercer as pontuação de forma duplo-cego, com revisores cegos para ambos genótipo e tratamento. Este sistema de pontuação foi previously descrito 6,7,10. </li></ol>

<ol>
	<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report:+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals.">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).</li><li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology.">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry.">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Revelli, D. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(NALP3,+Cryopyrin)+facilitates+in+vivo+caspase-1+activation,+necrosis,+and+HMGB1+release+via+inflammasome-dependent+and+-independent+pathways.">NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways.</a> J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).</li><li>Kline, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+airway+responsiveness+to+inhaled+lipopolysaccharide.">Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide.</a> Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).</li><li>Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+chronic+mucin+secretion+to+airway+disease+in+normal+and+CFTR-deficient+mice.">The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais críticos para avaliar com sucesso a resposta imune do hospedeiro no pulmão do rato é a seguinte: 1) escolher a tensão do mouse apropriado e sexo para o modelo que está sendo avaliado; 2) otimizar a entrega PAMP para os pulmões; 3) coletar e processar corretamente o LBA; e 4) devidamente corrigir e preparar os pulmões para avaliações histopatológicas. A escolha do rato tensão é um fator importante na avaliação da resposta imune do hospedeiro. C57BL / 6 são tipica...

As infecções pulmonares associadas com espécies de bactérias patogênicas são uma causa comum de morbidade e mortalidade global. Determinar os mecanismos que impulsionam a resposta imune do hospedeiro para estes patógenos vai promover o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e agentes terapêuticos que atenuam o impacto destas infecções. O objetivo geral do protocolo descrito aqui é fornecer ao usuário um método flexível para avaliar o anfitrião resposta imune inata à infecção do patógeno usando um associado padrão molecular de patógenos (PAMP) como um substituto para bactérias vivas. A maioria dos estudos anteriores que avaliaram a resposta imune do hospedeiro natural para as bactérias têm-se centrado em modelos peritoneal devido à relativa facilidade de execução. Embora estes modelos são muito úteis e têm resultado em avanços significativos no campo das interações patógeno-hospedeiro e inflamação sistêmica, os dados gerados a partir desses modelos nem sempre são adequadas para estudos involving do sistema respiratório. Aqui, um modelo pulmonar de inflamação pulmonar aguda é proposto como uma expansão prático e clinicamente relevante dos intraperitoneal (ip) de injeção de modelos clássicos. A técnica proposta permite a avaliação local da resposta imune inata em um sistema modelo específico do órgão. Os métodos descritos aqui são projetados para fornecer uma técnica simples e robusta para permitir que os usuários para avaliar a resposta imune do hospedeiro ao LPS, que é um PAMP comum. Os métodos baseiam-se na via intratraqueal (it) instilação de LPS, que induz uma resposta imune inata robusta nos pulmões dos ratos e imita muitas das características fisiopatológicas observadas em pacientes humanos que sofrem de infecções respiratórias e lesão pulmonar aguda 1. A principal vantagem desta técnica é que ela permite ao usuário avaliar a resposta imune do hospedeiro, sem os fatores de confusão e problemas de segurança associados à realização de estudos in vivoutilizando bactérias vivas. Do mesmo modo, a via de administração que orofaríngea de exposição descrito neste processo tem vantagens significativas sobre outras técnicas geralmente utilizadas, incluindo intranasal (em) a administração e que a administração cirúrgica. Por exemplo, ele permite que a dosagem de administração orofaríngea relativamente preciso e deposição nos pulmões em comparação com a administração, que normalmente sofre de um aumento da variabilidade da deposição nos pulmões, devido à perda de agentes na cavidade nasal e os seios 2-4. A rota que contorna administração destas cavidades e permite acesso direto à traquéia e vias aéreas. Da mesma forma, a abordagem cirúrgica que é um método de administração significativamente mais mórbida e requer extenso treinamento para dominar. Os protocolos descritos aqui também incluir uma descrição das técnicas comuns e marcadores substitutos utilizados para avaliar a progressão da inflamação e termina com um protocolo descrevendo as técnicas apropriadas para a preparação da lungs para avaliações de histopatologia. Estes protocolos são focados em minimizar o número de ratinhos necessários para cada estudo, maximizando os dados gerados a partir de cada animal. Os protocolos descritos são altamente flexível e pode ser facilmente modificado para avaliar uma diversificada gama PAMPs e padrões moleculares danos associados (amortece). Além disso, com algumas modificações adicionais, estes protocolos podem também ser aplicadas a estudos de avaliação das vias aéreas alérgica progressão da doença ou interações patógeno-hospedeiro com bactérias vivas, vírus ou fungos 5-10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:269px;">C57Bl/6J</td>
			<td style="width:181px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:147px;">Stock 000664</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:269px;">Compact Scale</td>
			<td style="width:181px;">Ohaus Scale Corporation</td>
			<td style="width:147px;">71142845</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Small Animal Rectal Thermometer</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">TH 5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rectal Probe for Rodents</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RET 3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ear Punch</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">EP-S 901</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4</td>
			<td style="width:181px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:147px;">LPS-EB</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Baxter</td>
			<td style="width:147px;">40032609</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand</td>
			<td style="width:181px;">ICAP Manufacturing</td>
			<td style="width:147px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/sharp)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-806-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps (straight)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">forceps (45&#186;, curved)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/blunt)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pipette (200 &#181;l Capacity)</td>
			<td style="width:181px;">Gilson</td>
			<td style="width:147px;">F123601</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">459844</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">&#160;1 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301604</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">27 G x 0.5 in. needle</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-100-676</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">732836</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">14025-076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">4-0 Silk Braided Surgical Suture</td>
			<td style="width:181px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">A183</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer to Tube Connector Kits</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721406</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer Stopcock Kit</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721664</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tygon formula E-3603 laboratory tubing</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">HT501128-4L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-1&#946; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">559603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">550950</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse TNF-&#945; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">560478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:181px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:147px;">3520</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">22-021-801&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SV3008401</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funel Clips</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funels</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-354</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter Cards</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-030-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-544-1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-540A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cytospin Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A78300003&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Diff Quick Staining Kit</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">47733150</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SP15-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utilization of oropharyngeal intratracheal pamp administration and bronchoalveolar lavage to evaluate the host immune response in mice

A resposta imune do hospedeiro contra patógenos é um processo biológico complexo. A maioria dos estudos in vivo classicamente utilizada para caracterizar as interações patógeno-hospedeiro tirar proveito de injeções intraperitoneais de selecionar bactérias ou padrões moleculares de patógenos associados (PAMPs) em camundongos. Embora essas técnicas têm rendido dados tremendos associados pathobiology doença infecciosa, os modelos de injeção intraperitoneal nem sempre são adequados para estudos de interação patógeno-hospedeiro no pulmão. Utilizando um modelo de inflamação pulmonar aguda em ratos, é possível realizar uma análise de alta resolução do anfitrião resposta imune inata utilizando lipopolissacarídeo (LPS). Aqui, descrevemos os métodos para administrar LPS usando administração intratraqueal orofaríngea não cirúrgico, monitorar parâmetros clínicos associados com a patogênese da doença, e utilizar lavado broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro. As técnicas que estão descritassão amplamente aplicáveis ​​para o estudo da resposta imune do hospedeiro inata de uma gama diversificada de PAMPs e patógenos. Da mesma forma, com pequenas modificações, estas técnicas também podem ser aplicados em estudos que avaliam a inflamação alérgica das vias aéreas e em aplicações farmacológicas.

As paredes celulares de bactérias gram-negativas são compostos de LPS, o que é muito abundante no ambiente. A inalação de LPS em populações humanas sensíveis exacerba a reactividade das vias aéreas e que é capaz de desencadear uma response11 imune robusta. LPS é também um PAMP comum utilizado em modelos de ratinho para induzir uma resposta imune inata robusta. No protocolo aqui descrito, os ratos receberam uma dose que de LPS isolado a partir de E. coli (sorotipo 0111: B4) usando-administração oro...

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The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.

A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K visualizações.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença. 

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Imunologia e Infecção

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In Vitro Análise do mediada por Myd88 Cellular resposta imune a vírus do Nilo Ocidental Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

A eficácia de protecção e Pulmonar resposta imune Seguindo subcutânea e intranasal BCG Administração em Ratinhos

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

inoculando<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Os mosquitos com grânulos para induzir e medir a melanizacao Resposta Imunológica

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.