Este projecto de investigação foi apoiada pelo Prêmio Número R21AA017735 (YS) do Instituto Nacional de Abuso do Álcool e Alcoolismo. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva do autor e não representam necessariamente a posição oficial do Instituto Nacional de Abuso do Álcool e Alcoolismo ou o National Institutes of Health. O autor também gostaria de agradecer a Charisse Montgomery para a edição deste manuscrito.

1. Animais reprodutores e Trófico Tratamento Peptide <ol><li> Raça C57BL/mice colocando os ratinhos fêmeas (~ 6 semanas de idade, peso médio de 20 g) em gaiolas macho durante 2 horas. </li><li> Verifique se há uma ficha de espermatozóides e / ou esfregaço vaginal imediatamente depois. </li><li> Se positivo, designar este ponto de tempo como dia embrionário 0 (E0). </li><li> Em E7, peso do jogo fêmeas grávidas para grupos controlo e de tratamento (3 grupos) são designados como descrito recentemente 4: 1) O álcool (etanol) do grupo de dieta líquida (ALC), 2) a par-alimentados grupo de controlo (PF), 3) grupo de tratamento com Peptídeo, que deve receber a injecção intraperitoneal (ip) de ADNF-9 péptido juntamente com álcool de dieta líquida de exposição (ALC/ADNF-9). Os detalhes da preparação da ALC e PF dietas eo procedimento de injeções IP pode ser encontrado em nosso recente trabalho 4. </li><li> Medir dieta líquida álcool diariamente, que pode ser fornecido como o acesso livre como a única fonte de nutrientes. Dieta líquida PF jugo individualmente to uma barragem ALC pode ser medido diariamente também. </li><li> O volume de dieta líquida consumida durante o 24 hr anterior pode ser gravado a partir de 30 ml graduada tubos de tampa de rosca e dieta preparada na hora deve ser prestado diariamente a partir E7 a E13. </li></ol> 2. Dissecção dos fetos e microdissecção dos cérebros fetais <ol><li> Sacrifício ratas grávidas no E13 por profundamente eutanásia os ratos com um processo de CO 2, seguido de um deslocamento cervical. </li><li> Limpar o local da incisão abdominal com etanol a 70%. </li><li> Faça uma incisão abdominal usando tesouras e pinças esterilizadas. </li><li> Quando o abdómen é aberto, dissecar o útero, mantendo-a com uma pinça e usando os outros pinça de rasgar mesometrial longe do útero. Certifique-se de tal procedimento, lentamente, a fim de evitar a perfuração dos embriões. </li><li> Remover os embriões do útero e transferi-los para um prato de cultura de células (60 mm x 15 mm), contendo solução salina equilibrada de Hanks &#39;<html> (HBSS) em água gelada. </li><li> Dissecar cérebros fetais a partir dos embriões inteiros sob microscópio estereoscópico para microdissection. </li><li> Usando fórceps ultra-finas por microdissecção, retirar a pele dos embriões na parte superior da cabeça para expor o crânio. </li><li> Uma vez que o crânio está exposto e claramente visualizados sob o microscópio estereoscópico microdissection, em seguida, retire o crânio a partir da parte posterior do cérebro a medula espinhal e as áreas do tronco cerebral. </li><li> Não se esqueça de retirar a peça do crânio por parte de posterior para partes anteriores da cabeça. </li><li> Uma vez que o cérebro do feto são visualmente exposto, prossiga com a extraí-los. </li><li> Dissecar os cérebros fetais a partir da base do bolbo olfactivo primórdio da base do metencéfalo. </li><li> Postfix tudo dissecado cérebros fetais em paraformaldeído a 4% por 2-3 dias. Você também pode congelar outros cérebros fetais de cada barragem, se você estiver testando-os para Western blot ou ensaios enzimáticos. </li></ol>nt &quot;&gt; Nota: Os procedimentos para uso de animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade de Toledo, que estão de acordo com as diretrizes da Institutional Animal Care e do Comitê Use no National Institutes of Health e do Guia para a Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 3. Incorporação Brains fetal em gelatina para Seccionamento <ol><li> Prepare a 10% de gelatina de grau A. </li><li> Preencha um molde peel-away incorporação até a metade e esperar até que os solidifica de gelatina. </li><li> Controle local e pré-natal tratado fetal cérebros side-by-side em cima da gelatina solidificada. Isso é para manter condições consistentes de imunodetecção de morte celular entre ambos os grupos controle e experimental. </li><li> Adicionar gelatina líquida no topo dos cérebros fetais para fazer um molde completo (certificar-se que a gelatina não é muito quente). </li><li> Refrigerar o molde de gelatina preparada que mantém o cérebro fetal por 15 min. </li><li> Peel offo molde plástico de incorporação e, em seguida, transferir os pré-fabricados de gelatina contendo cérebros fetais em paraformaldeído 4% por dois dias. </li><li> Local e seção fixa cérebros fetais em gelatina usando vibratome máquina de corte (Leica VT 1000S) a 50 m de espessura para seccionamento coronal. Essa espessura é testado em nossos estudos, pois oferece melhores características anatômicas. Além disso, a espessura de 25 um e maiores também podem ser testados com esta técnica envolvendo incorporado de cérebros fetais em 10% de gelatina. Note-se que cortes coronais foram cortadas usando vibratome no nível eminência gânglios basais no cérebro anterior </li><li> Recolha as seções do cérebro fetal em-tampão fosfato (PBS). </li><li> Montar as seções do cérebro fetal em Superfrost lâminas Plus em água. </li><li> Secam-se as secções montadas durante 15 min. </li><li> Coloque os slides (montada com as seções do cérebro do feto) em PBS para o próximo dia de testes de reação de TUNEL. </li></ol> 4. Reação de TUNEL Deproteção de morte celular ou apoptose (TUNEL: TdT mediada dUTP Nick End Labeling; TdT: Terminal deoxynucleotidyl transferase). Este ensaio é destinado a determinar a morte celular. <ol><li> Tratar secções de cérebro fetal montados em Superfrost Além disso as lâminas com Proteinase K (20 ug / ml) durante 5 min a 37 ° C (300 ul de proteinase K, misturado em 20 ml de PBS). As lâminas são montadas em 5 Plend aberto maile). </li><li> Enxágüe seções do cérebro fetal (montado em slides) com PBS três vezes por 5 min em agitador orbital. </li><li> Incubar as secções com 3% de H 2 O 2 em metanol durante 10 minutos à temperatura ambiente (3 ml de 30% de H 2 O 2 em 27 ml de metanol a 100%) (lâminas não deve ser num agitador). </li><li> Enxaguar secções com PBS três vezes durante 5 min em agitador orbital. </li><li> Incubar as secções em solução de permeabilização (0,1% TritonX-100 em citrato de sódio a 0,1%) durante 2 minutos em gelo (4 ° C) (100 ul tritonX + 0,1 g de citrato de sódio + 99,9 ml Distilled água). </li><li> Enxaguar secções em PBS duas vezes durante 5 min em agitador orbital. </li><li> Área seca em torno de seções nos slides. </li><li> Desenhe barreira em lâminas Superfrost Plus com PAP Pen. Este destina-se a evitar qualquer vazamento de solução que é usada para tratar as secções para a detecção de células positivas TUNEL. </li><li> Incubar as secções com mistura de reacção de TUNEL (50 ul do frasco 1 e 450 ul do frasco 2) durante 1 hora a 37 ° C, o controlo irá ser utilizada por incubação em solução de garrafa 2. </li><li> Lavar com PBS três vezes 5 min sob Orbit shaker. </li><li> Área seca ao redor dos tecidos. </li><li> Incubar as secções com conversor-POD durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Lavar as secções três vezes durante 5 min em Tris-HCl (pH 7,5, 0,05 M). </li><li> Incubar as secções durante 7 minutos em 0,05% tetracloridrato 3&#39;-3&#39;-diaminobenzidina (DAB) e 0,003% de H 2 O 2 (25 mL de Tris HCl, pH 7,5, 0,05 M + 25 ul de 3% de H 2 0 2 + 500 DAB mL) Sob Oribtal shaker a 4 ° C (em gelo) e no escuro (certifique-se de fazer este procedimento em novo 5 Plend aberto mailer). </li><li> Lavar as seções com PBS três vezes 5 min em agitador orbital. </li><li> Mantenha as seções de slides em PBS por mais de 24 horas em PBS, em seguida, processá-los para a coloração de Nissl, conforme detalhado na próxima seção de protocolo. </li></ol> Nota: DAB é uma substância cancerígena. Use luvas e limpar todos os pratos usados ​​com a água sanitária, uma vez terminado com todos os experimentos. 5. Nissl para Preparação de Fetais seções do cérebro para observação microscópica <ol><li> Procedimento de coloração de Nissl deve ser feito em uma capa de segurança biológica. </li><li> Lavar as secções de deslizamento com água desionizada durante 2 minutos. </li><li> Incubar as seções em etanol 70% por 2 min. </li><li> Incubar as secções em etanol a 95% durante 6 min. </li><li> Incubar as seções em etanol 70% por 2 min. </li><li> Lavar as seções deionizada water por 2 min. </li><li> Incubar as seções Violet Cresyl Mancha para a 3 min. </li><li> Lavar as seções em água deionizada por 2 min. </li><li> Incubar as seções em etanol 70% por 2 min. </li><li> Incubar as secções em etanol a 95% + 3 ml de ácido acético glacial durante 3 min. </li><li> Incubar as secções em etanol a 95% durante 2 min. </li><li> Incubar as secções em etanol a 100% durante 2 minutos, três vezes. </li><li> Incubar as seções em xileno por 10 minutos três vezes. </li><li> Slides segurando as seções do cérebro fetal pode ser montado usando Permount e cobertura de lâminas de vidro de deslizamento. </li><li> Deixe o montado desliza durante a noite antes de observação microscópica e análises. </li><li> A observação microscópica e fotomicrografias pode ser realizada sob microscópio Leica vertical. </li></ol>

<ol>
	<li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide,+NAP,+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li><li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+peptide,+colivelin,+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mice:+signaling+pathway+investigations.">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li><li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL/6+mice:+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li><li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis,+in+part,+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li><li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL/6+mice:+a+proteomic+investigation.">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li><li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide.">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li><li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor:+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides.">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li><li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome.">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li><li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected,+in+part,+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li><li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide.">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li><li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li><li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoactive+intestinal+peptide+(VIP)+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures:+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson's+disease.">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li><li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress.">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li></ol>

Não há informações a serem apresentadas.

A metodologia e tecnologia apresentada neste estudo demonstram os efeitos da exposição pré-natal ao álcool em cérebros fetais e o papel dos péptidos tróficos na prevenção destes efeitos. Estes podem fornecer informações sobre como estudar outras drogas de abuso ou outros produtos químicos tóxicos no cérebro do feto durante as diferentes fases da gravidez. No que diz respeito ao paradigma de reprodução, em alguns casos, a detecção do bujão de esperma não pode ser observado...

O objetivo dos métodos experimentais descritas aqui é avaliar os efeitos neuroprotetores de peptídeos tróficos em um modelo de exposição fetal ao álcool através de várias técnicas que envolvem a criação, alimentação, microdissecting, e detectar a morte celular. Trabalhar em nosso laboratório tem envolvido uma dieta líquida misturada com o álcool como um modelo de beber álcool moderada, o que pode ser semelhante a um paradigma de beber humano em termos de a quantidade de álcool consumido 1-5. Nós e outros autores identificaram três derivados peptídicos que são neuroprotectores contra os efeitos deletérios da exposição alcoólica fetal. Estudos que investigaram a exposição ao álcool durante os estágios embrionários utilizando modelos animais podem levar à identificação de potenciais mecanismos de neuroprotecção e permitir o desenvolvimento de procedimentos de intervenção. Isto pode fornecer uma ampla informação sobre os efeitos neuroprotectores e de atenuação dos efeitos deletérios da exposição do álcool durante a gravidez. Possível prevenção dos efeitos do álcool exposição pré-natal pode envolver o tratamento de ratinhas grávidas com péptidos que foram mostrados para ser envolvido na neuroprotecção in vitro e in vivo 6,7 1,2,4,8,9. Entre estes péptidos, SALLRSIPA, conhecido como ADNF ou SAL-9, é derivado da actividade dependente de factor neurotrófico (ADNF) 7,10. Outro peptídeo com o NAPVSIPQ peptídeo seqüência, denominado NAP, derivado de proteína neuroprotetora dependente de atividade (ADNP) 6,11, demonstraram um efeito protetor potente contra o estresse oxidativo associado com a exposição ao álcool 12,13. Além disso, foram recentemente identificados um péptido sintetizado de novo, colivelin que parece desempenhar um papel fundamental neuroprotector no modelo de exposição fetal ao álcool 2. Colivelin é composto de ADNF-9 e AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). A importância da utilização destes péptidos é que eles têm a capacidade deatravessam a barreira cérebro-sangue para evitar os efeitos de apoptose induzida por álcool e défices cerebrais de crescimento. Os métodos experimentais usados ​​camundongos C57BL / 6 para testar os efeitos neuroprotetores contra a apoptose induzida pelo álcool. Adoptámos uma janela em vez de reprodutores durante a noite 2 h de modo a determinar com precisão o dia embrionário 0 (E0), como pode ser revelado através da detecção de uma vela de esperma e esfregaço vaginal 1-5. Nós usamos uma dieta líquida com tubos de alimentação, já que este é considerado o livre acesso, em vez de entrega do álcool por via sonda gástrica, o que pode induzir estresse para ratas grávidas. Por outro lado, microdissection pode ser desafiador devido à suavidade do tecido cerebral fetal, o que pode ser encontrado ao dissecar o cérebro do feto em estágios embrionários iniciais. Aqui, vamos mostrar técnicas visualizadas para lidar com todos os desafios que envolvem microdissection. Além disso, uma vez que a secção do cérebro fetal também pode ser um desafio, adotamosuma técnica que envolve a incorporação do cérebro fetal em gelatina usando peel-away incorporação de moldes. Temos sido bem sucedidos em cortar o cérebro do feto em seções flutuantes livres a 50 m de espessura. Isto permite-nos investigar as alterações de concentração de proteína em secções de cérebro fetal, incluindo a identificação de morte celular.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus Slides</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48311-703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAP PEN</td>
 <td>Research Products Int. Corp.</td>
 <td>195506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-Plend Open Mailer </td>
 <td>Heathrow Scientific, LLC</td>
 <td>HS 15983G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peel away embedding molds</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70182</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In situ cell death detection kit, POD</td>
 <td>Roche Diagnostics, Inc</td>
 <td>11684817910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14170-120 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelatin Type A</td>
 <td>FisherScientific</td>
 <td>G8-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc </td>
 <td>Leica M60, KL 200 LED</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro-Vibratome</td>
 <td>Leica, Inc </td>
 <td>Leica VT 1000S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Ultra Fine Forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11370-40</td>
 <td>2 pairs</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Graduate 30 ml feeding tubes</td>
 <td>Dyets, Inc </td>
 <td>900012 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vitamin Mix </td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8031 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral Mix</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8598 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maltose Dextrin</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>3650 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons</td>
 <td>111000190-SS05 </td>
 <td>Pharmco-AAPER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc</td>
 <td>LEICA DM 4000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

experimental methods for testing the effects of neurotrophic peptide, adnf-9, against alcohol-induced apoptosis during pregnancy in c57bl/6 mice

Projetos experimentais para investigar os efeitos da exposição pré-natal álcool durante a fase embrionária precoce em crescimento do cérebro fetal são desafiadoras. Isto é principalmente devido à dificuldade de microdissecção de cérebros fetais e de seccionamento para a determinação de células apoptóticas causadas por exposição pré-natal ao álcool. As experiências aqui descritas fornecem técnicas visualizadas a partir de ratinhos de melhoramento para a identificação de morte celular em tecido de cérebro fetal. Este estudo utilizou ratinhos C57BL / 6 como um modelo animal para o estudo da exposição do álcool fetal e o papel do péptido trófico contra a apoptose induzida por álcool. A criação consiste em uma janela de esteiras de 2 horas para determinar a fase exata da idade embrionária. Um modelo de exposição do álcool fetal estabelecida foi usado neste estudo para determinar os efeitos da exposição pré-natal de álcool nos cérebros fetais. Trata-se de livre acesso ao álcool ou par-alimentados com dietas líquidas como a única fonte de nutrientes para as ratas grávidas. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; As técnicas que envolvem dissecção dos fetos e microdissecção do cérebro fetal são descritos cuidadosamente, pois este pode ser um desafio. Microdissecção exige uma lupa e uma pinça ultra-finas. Procedimentos passo-a-passo para dissecar o cérebro do feto são fornecidos visualmente. Os cérebros fetais são dissecados a partir da base do bolbo olfactivo primórdio da base do metencéfalo. Para a análise da apoptose, os cérebros fetais são incorporados em primeiro lugar gelatina usando um molde da casca-de distância para facilitar o seu seccionamento com um aparelho de vibratome. Cérebros fetais embutidos e fixados em paraformaldeído são facilmente seccionado, e as secções de flutuação livre pode ser montado em Superfrost mais lâminas para a determinação da apoptose ou morte celular. TUNEL (TdT Nick-End dUTP mediado Rotulagem; TdT: desoxinucleotidil-transferase terminal) ensaio tem sido utilizado para identificar a morte celular ou apoptose. Vale ressaltar que apoptosis e citotoxicidade mediada por células, são caracterizadas por fragmentação do DNA. Assim, as células positivas TUNEL visualizadas são indicativas de morte celular ou apoptose. Os modelos experimentais aqui fornecem informações sobre a utilização de uma dieta líquida estabelecido para o estudo dos efeitos do álcool e o papel dos péptidos neurotróficos durante a gravidez em cérebros fetais. Trata-se de reprodução e alimentação ratas grávidas, microdissecting cérebro do feto e determinar apoptose. Juntas, estas técnicas visuais e textuais podem ser uma fonte para investigar a exposição pré-natal de agentes nocivos nos cérebros fetais.

Os métodos experimentais aqui descritos mostram que a janela de criação de 2 horas é essencial para estimar a fase gestacional precisa. Demonstrámos a dissecação de embriões com a idade de E13. Também demonstramos microdissection de cérebros fetais no E13. O procedimento envolve diversas fases (de corrente alternada), como descrito na Figura 1. Cérebros fetais são dissecados a partir da base do bolbo olfactivo primórdio da base do metencéfalo (Figura 1). Cérebros fetais s...

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Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

O delineamento experimental proposto aqui se concentrar em estudar os efeitos da exposição ao álcool na apoptose e da aplicação de peptídeo neurotrófico durante a gravidez no cérebro fetal. Uma descrição detalhada da criação para a coleção de cérebros fetais é descrito. As técnicas para a determinação da apoptose são também descritos em detalhe.

Métodos experimentais para testar os efeitos de Peptide Neurotrophic, ADNF-9, contra a apoptose induzida pelo álcool durante a gravidez em camundongos C57BL / 6

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K visualizações.  University of Toledo. O delineamento experimental proposto aqui se concentrar em estudar os efeitos da exposição ao álcool na apoptose e da aplicação de peptídeo neurotrófico durante a gravidez no cérebro fetal. Uma descrição detalhada da criação para a coleção de cérebros fetais é descrito. As técnicas para a determinação da apoptose são também descritos em detalhe.

Vídeo: Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Neurociência

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra a isquemia cerebral

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the application of these techniques to identify gait deficits in a mouse model of MS, known as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Paralysis and motor deficits in mice subjected to EAE are typically assessed using a clinical scoring scale. However, this scale yields only ordinal data that provides little information about the precise nature of the motor deficits. EAE disease severity has also been assessed by rotarod performance, which provides a measure of general motor coordination. By contrast, kinematic gait analysis of the hind limb in the sagittal plane generates highly precise information about how movement is impaired. To perform this procedure, reflective markers are placed on a hind limb to detect joint movement while a mouse is walking on a treadmill. Motion analysis software is used to measure movement of the markers during walking. Kinematic gait parameters are then derived from the resultant data. We show how these gait parameters can be used to quantify impaired movements of the hip, knee, and ankle joints in EAE. These techniques may be used to better understand disease mechanisms and identify potential treatments for MS and other neurodegenerative disorders that impair mobility.

Kinematic gait analysis in the sagittal plane yields highly precise information about how movement is executed. We describe the application of these techniques to identify gait deficits for mice subjected to autoimmune-mediated demyelination. These methods may also be used to characterize gait deficits for other mouse models featuring impaired locomotion.

Análise cinemática da marcha de sagital em camundongos C57BL/6 sujeitado a MOG35-55 induzido encefalomielite auto-imune Experimental

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

Uma abordagem simples para induzir a neurite auto-imune Experimental em camundongos C57BL/6 para avaliações funcionais e neuropatológicas

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Cirurgia de implante coclear e gravações de resposta eletricamente evocado auditivo do tronco encefálico em camundongos C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

Medição quantitativa de proteínas sintetizadas intrathecally em camundongos

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal abrasion, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Next, position the mouse on its side on a heated plate. Gently use a cotton swab to absorb the artificial tear, and brush aside the mouse's eyelashes without making contact with the eye. Turn on the ocular burr, and carefully open the mouse's eyelid with two fingers.Simultaneously shield the vibrancy to prevent them from entangling in the burr. Locate the pupil or the eye center and gently apply the ocular burr to the eye's surface in circular motions until the epithelium is removed. Alternatively, perform about 20 circular movements on the cornea.Now apply a drop of fluorescent staining solution on the abraided eye. After 20 seconds, dab the eye with a tissue to absorb the solution. Then rinse it with a drop of artificial tear.Finally, absorb the artificial tear with a tissue, and illuminate the eye using a blue cobalt lamp. Prior to the surgery, the basal epithelium was intact and the nerve fibers in the sub basal plexus formed a vortex. The burr tip removed the outer corneal layer, leaving the stroma and endothelium intact with a visible gap at the basal epithelium and sub basal plexus.Regeneration of the epithelium occurred over a week post-surgery. However, the vortex remained absent from the corneal center.

Abrasão do Nervo Corneano Murino na Indução de Ceratite Neurotrófica

Paradigma de estresse social adolescente em camundongos C57BL / 6 para pesquisa comportamental

Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL&#47;6 Male and Female Mice

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female rodents is needed to understand its effects on ongoing brain development and behavioral outcomes. The chronic social defeat stress paradigm (CSDS) has been widely used to model social stress in adult C57BL/6 male mice by leveraging on the aggressive behavior displayed by an adult male rodent to an intruder invading its territory. An advantage of this paradigm is that it allows to categorize defeated mice into resilient and susceptible groups based on their individual differences in social behavior 24 h after the last defeat session. Implementing this model in adolescent C57BL/6 mice has been challenging because adult or adolescent mice do not typically attack early adolescent male or female mice and because adolescence is a short period of life, encompassing discreet temporal windows of vulnerability. This limitation was overcome by adapting an accelerated version of the CSDS to be used for adolescent male and female mice. This 4-day stress paradigm with 2 physical attack sessions per day uses a C57BL/6 male adult to prime the CD-1 mouse for aggressiveness such that it readily attacks the male or female adolescent mouse. This model was termed accelerated social defeat stress (AcSD) for adolescent mice. Adolescent exposure to AcSD induces social avoidance 24 h later in both males and females, but only in a subset of defeated mice. This vulnerability occurs despite the number of attacks being consistent across sessions between resilient and susceptible groups. The AcSD model is short enough to allow exposure during discrete periods within adolescence, allows the segregation of mice according to the presence or absence of social avoidance behavior, and is the first model available to study social defeat stress in adolescent C57BL/6 female mice.

Autor em destaque: Compreendendo os efeitos da adversidade social do adolescente no neurodesenvolvimento em camundongos

We developed an accelerated social defeat stress model for adolescent C57BL/6 mice, which works in both males and females and allows exposure during discrete adolescent periods. Exposure to this model induces social avoidance, but only in a subset of defeated male and female mice.

Modelo de estresse de derrota social para camundongos adolescentes C57BL / 6 machos e fêmeas

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female ...