This protocol follows any and all animal care and use guidelines and regulations set by IACUC at the University of Cincinnati. This work is funded by NIH/NINDS NS07722 and the Gardner Family Center for Parkinson&#8217;s Disease and Movement Disorders.

Todos os passos do protocolo de seguir a cuidados com os animais e usar directrizes e regulamentos estabelecidos pelo IACUC da Universidade de Cincinnati. 1. Considerações Gerais <ol><li> Se possível, testar os ratos em sua fase ativa do ciclo escuro. Normalmente, realizar testes em condições de pouca luz e pelo menos 1 hora no ciclo escuro. No entanto, se os testes no ciclo escuro não é viável, executar todos os três testes durante o ciclo de luz. Tenha em mente que os tempos de sniffing pode diminuir quando os ratos são testados durante o seu ciclo de sono. Nota: Embora os testes podem ser realizados durante o ciclo de sono os ratinhos podem mostrar menos interesse no sedimento enterrado, blocos, ou cartucho perfumado. </li><li> A fim de reduzir o efeito de qualquer pistas olfactivas fora, usar um par de luvas de base em todos os tempos ao longo de cada teste e, em seguida, colocar um par de luvas limpa sobre o par de base para cada rato e em cada ensaio. Como regra geral, em caso de dúvida, colocar em um jogo limpo de luvas. Ter uma caixa de luvas de lerily disponível, uma vez que vai ser alterado com freqüência. NOTA: Nós usamos luvas de borracha nitrílica para toda a manipulação animal. </li><li> Limpeza materiais de teste e de gaiolas entre indivíduos com um desinfectante / agente de esterilização é também um passo importante nesta série de testes a fim de reduzir o potencial para a propagação da doença bem como remover pistas olfactivas indesejados. </li></ol> 2. Enterrado Teste Pellet <ol><li> Pelo menos, dois dias antes do ensaio, registar o peso de cada rato e em seguida alimentar restringir a 90% do peso corporal. Antes do ensaio e durante a restrição alimentar, dão cada rato 1-2 pedaços dos peletes a ser utilizados durante o ensaio (por exemplo, um pedaço de cereal edulcorado). Não pule esta etapa porque os ratos são neofóbicas com alimentos e não podem procurar o sedimento durante o teste, caso não tenham comido as pelotas anteriormente. </li><li> Em todos os dias do teste, os ratos habituam durante 1 hora antes do teste, colocando a sua gaiola na sala de ensaio, sem a garrafa de água ou b alimentadorem. abrigá-los em sua gaiola com apenas uma tampa superior do filtro. </li><li> Durante habituação, preencher uma gaiola limpa rato ~ 3 centímetros de altura, com roupa de cama limpa assegurando a roupa de cama é distribuído uniformemente por toda a gaiola. Defina um temporizador para 5 min. </li><li> Após 1 hora de habituação, enterrar um adoçados pellet cereal 0,5 centímetros abaixo da cama de modo que não é visível. </li><li> Remover o rato de ensaio a partir da sua gaiola, colocá-lo no centro da gaiola de ensaio, colocar a tampa de topo do filtro sobre a gaiola e iniciar o temporizador. </li><li> Pare o cronômetro quando o mouse descobre a pelota e começa a comê-lo. Observe o tempo para descobrir o sedimento enterrado. </li><li> Se o mouse não encontrar a pelota dentro de 5 min, terminar o julgamento e observe uma pontuação de 300 segundos para que mouse. Mover o sedimento para o topo do leito de modo que o rato tem acesso a ele, e permitir que o rato para comer o sedimento. </li><li> Após o julgamento, o retorno do mouse para sua gaiola. </li><li> Esvazie a cama da gaiola de teste e limpar o cidade com uma solução de limpeza do quarto animal. </li><li> Repita os passos de 2,4-2,9 para cada rato, e trocar as luvas antes e depois de cada rato. </li><li> Depois de todos os ratos são testados, dar-lhes comida apenas o suficiente para mantê-los em 90% do peso corporal. </li><li> Realizar testes nos dias 2-5 da mesma forma que um dia de teste com uma exceção; enterrar o sedimento em um ponto diferente na gaiola para cada ensaio. </li><li> No teste de dia 6, realizar o julgamento de pellet superfície. </li><li> Para o ensaio da pelota da superfície, siga o mesmo procedimento para o dia do teste 1, mas em vez de enterrar a pelota sob o lugar da cama-lo em cima da cama. Anotar o tempo que o mouse para encontrar e começar a comer o sedimento. </li></ol> 3 Bloco de Teste <ol><li> Individualmente abrigar ratos em gaiolas limpas e colocar 5 blocos na gaiola (rotulado AE), mudando as luvas antes de configurar cada gaiola. </li><li> Realizar o teste 24 horas mais tarde. Mover ratinhos de teste para a área de teste, retirar a garrafa de água e alimentador de compartimento, e colocar ail 5 quadras da gaiola, juntamente com um punhado de roupas de cama em um saco plástico etiquetados com a identificação do animal. Coloque o saco plástico selado no topo da gaiola do mouse. </li><li> Habituar os animais nas suas gaiolas de origem sem a garrafa de água, alimentador de compartimento, e blocos de 1 h antes do teste. </li><li> Mudar de luvas entre cada gaiola para que os aromas não são trocados entre animais / blocos. </li><li> Alinhe as gaiolas de rato ao lado do outro em uma tabela com pelo menos 10 cm entre cada gaiola. A posição de uma câmara de vídeo de modo que a parte da frente da gaiola (não do lado longo da gaiola) é claramente à vista. </li><li> Ajustar o cronômetro para 30 seg e rotular um cartão com os detalhes importantes da experiência (data, identificação do mouse, experimentação, etc). Videotape o rótulo de 2-3 segundos. </li><li> Remova os blocos AD do saco de plástico com a identificação desse rato e colocá-los no meio da gaiola de modo que eles são claramente visíveis na câmera de vídeo. Verifique se há ~ 1 centímetro of espaço entre cada um dos blocos. Coloque a parte superior do filtro de volta na gaiola. Inicie o cronômetro e fita de vídeo durante 30 segundos. </li><li> Depois de 30 segundos, parar a gravação e remover os blocos da gaiola e colocá-los de volta para o saco plástico. </li><li> Mudar de luvas e depois passar para o próximo rato, repetindo o mesmo procedimento utilizado para o primeiro ensaio. Faça isso por um total de 6 ensaios para cada rato certificando-se de que há um intervalo inter-julgamento de ~ 5 min. </li><li> No dia 7 de julgamento, siga o mesmo procedimento para os ensaios 1-6, exceto em vez de colocar bloco D da própria gaiola do rato adicionar bloco E da jaula de um outro rato para que o mouse é exposto aos blocos A, B, e C a partir de sua gaiola própria e bloco de E a partir de uma outra gaiola do rato. Observe no livro de laboratório cujo bloco E cada rato é exposto e alternativo onde bloco E é colocado na gaiola de cada mouse (por exemplo, ABCE ou AEBC). Tome bloco de E a partir de um rato do mesmo sexo, mas não a partir de um cagemate original. Videotape durante 30 seg. </li><li> Após as sete ensaios, os animais retornam para uma nova gaiola limpa com seus cagemates originais. Limpo blocos utilizados no ensaio com água e detergente neutro e deixar secar ao ar para uso em testes posteriores. </li></ol> 4. Habituação / Dishabituation <ol><li> Realizar o teste de habituação / dishabituation de um modo semelhante ao teste de bloco, mas em vez de utilizar blocos que têm o odor de um rato, utilizar cartuchos de tecidos de algodão que prendem perfumado com diferentes pares de extractos. </li><li> Siga passos 3,1-3,4 usando um cartucho de tecido único, sem cheiro, em vez de blocos. </li><li> Habituar os ratos na sala de prova. </li><li> Prepare os cartuchos de tecido perfumado em uma sala separada. Coloque uma bola de algodão pequena em um cartucho limpo e, em seguida, adicionar 5 mL de extrato (por exemplo, extrato de amêndoa) no algodão. Encaixe a parte superior do cartucho sobre o algodão e coloque em uma caixa específica ou saco rotulado com aquele cheiro. </li><li> Faça o mesmo procedimento fou um segundo perfume (por exemplo, extracto de anis). Mudar de luvas entre a manipulação de diferentes aromas. Certifique-se que a bola de algodão é completamente envolto no cartucho de tecido. NOTA: Exposed fibras do algodão pode causar o animal ter interesse na bola de algodão para fins de assentamento, em vez de o próprio cheiro. </li><li> Em seguida, siga os passos 3,6-3,10 usando um cartucho de tecido perfumado para os primeiros seis ensaios, eo segundo cartucho tecido perfumado para o sétimo julgamento. </li></ol> 5 Análise de vídeos <ol><li> Para o bloco e os testes de habituação / dishabituation, tem um cego avaliador a condição experimental medir o tempo gasto farejando cada bloco, com sniffing definida como contato nasal com esse bloco. Se desejado, medir a outros comportamentos, tais como o tempo para se aproximar do novo bloco (P) durante o Ensaio 7 e a actividade total (o número de movimentos realizados ao longo do comprimento e largura da gaiola) durante cada ensaio. Marque o tempo gasto farejando umatempo d se aproximar do vídeo usando um cronômetro. </li><li> Do mesmo modo, para o teste de habituação / dishabituation, tem um avaliador cego para a condição experimental medir o tempo gasto cheirar o cartucho, o tempo para se aproximar do cartucho, e a actividade locomotora. </li></ol> 6. Estatísticas <ol><li> Analisar o teste de pellet enterrado usando estatísticas não paramétricas, porque a latência para encontrar a pelota pontuações tendem a mostrar a heterogeneidade de variância. Média, a latência para localizar o pellet através 3-5 dias e, em seguida, comparar entre os grupos de ratos usando um U-Mann-Whitney. Do mesmo modo, para a parte da superfície do sedimento o teste, analisar a latência para encontrar a pastilha utilizando um teste-U de Mann-Whitney para comparar os genótipos. </li><li> Para o teste bloco, analisar os dados do estudo 7 (introdução do bloco cheiro de romance). Normalmente, empregam análises não paramétricas para explicar a heterogeneidade de variância. Para analisar as diferenças de tempo gasto farejando ªe novo bloco, assim como o tempo para se aproximar dos blocos para diferentes grupos experimentais, utilizar o teste-U de Mann-Whitney. Use o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon para comparar o tempo gasto farejando o romance bloco de tempo gasto farejando os blocos familiares. </li><li> Para o teste de habituação / dishabituation, analisa conduta paramétrico em Trials 1, 6 e 7, semelhante a estudos anteriores 20. Se os ratos apresentam pouca ou nenhuma sniffing, use análises não paramétricas. </li></ol>

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We have no conflicts of interest.

Cada um dos ensaios descritos no presente estudo medir diferentes aspectos da função olfactiva em ratinhos. O teste de pellet enterrado mede o aspecto do olfato motivação comida, testando a capacidade de fome (restrição alimentar, não alimentar privado) ratos para detectar um pedaço saboroso de cereal adoçado enterrado sob cama. O teste bloco mede mais do aspecto social da função olfativa, testando a capacidade dos ratos de discriminar entre o seu próprio perfume e que de uma mesma espécie. O teste de habituação / dishabituation avalia a capacidade do rato de discriminar entre cheiros inofensivos familiares e novos,. O uso de vários testes é importante na caracterização de um novo modelo porque anomalias na motivação comida ou medo podem contribuir para diferenças observadas nos ratos mutantes em comparação aos controles. Por exemplo, se apenas o bloco de teste é realizado, e diminuiu a cheirar do bloco que se observa o odor de outro rato, não é claro se existe uma olfactdéficit ory ou uma resposta de medo aprimorado para a mesma espécie que pode levar a evitar esse bloco. Quando vários testes são realizados e os déficits são observados em todos os testes, é fortemente favorável a uma interpretação de deficiência olfativa. No entanto, se as diferenças são observadas em apenas um teste, mas não os outros, então pode haver uma deficiência olfativa mais sutil, mas será essencial para descartar outras explicações (ou seja, maior o medo ou a redução da motivação dos alimentos). Outros fatores importantes para manter em mente ao testar camundongos função olfativa incluem a tensão de fundo e sexo dos camundongos. Diferentes estirpes de fundo genético (isto é, C57BL / 6, DBA, etc) podem ter efeitos profundos sobre o comportamento do rato, por conseguinte, recomenda-se a adaptar-se a cada protocolo em ratinhos de tipo selvagem com o mesmo plano antes de executar todo o experimento. Recomenda-se também que homens e camundongos fêmeas ser testados separadamente um do outro porque o sistema olfativo masculino é altaly sensível às fêmeas na detecção de estro e olfativa de uma fêmea em estro poderia interferir no desempenho de todos os três testes. Alguns passos são absolutamente críticos para seguir ao testar o olfato em camundongos. É importante estar ciente dos odores o experimentador está introduzindo aos animais. O uso de luvas para os procedimentos de mudança é essencial e freqüente de luvas entre os animais é necessária. É sempre uma boa prática para o experimentador não usar colônia ou perfume em dias de teste olfato. Enquanto algumas partes do procedimento são inflexíveis, existem outras partes que podem ser modificados e adaptados, sem reduzir a validade ou a sensibilidade do ensaio. Por exemplo, o número de tentativas de habituação pode ser aumentada ou diminuída, dependendo da estirpe de murganhos sendo testada e a rapidez com que se habituam ao estímulo. A principal limitação desses testes é que todos eles são conduzidos por alguma forma de motivação, seja comida ou social, fazendodifícil excluir completamente anomalias na motivação como uma explicação quando uma resposta alterada observado. Isto pode ser minimizado através da análise de parâmetros adicionais, tais como a actividade e o tempo durante o teste, para aproximar os estímulos. Uma vez dominado, os testes podem ser facilmente utilizados para examinar o fenótipo de novos modelos de rato de doença neurodegenerativa. Além disso, os testes que tem a maior potência, podem ser incluídos em estudos pré-clínicos testando potenciais agentes terapêuticos (para um exemplo, ver ref. 25).

Disfunção olfativa é ligado a um número de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), doença de Alzheimer, e doença de Huntington 1. Na DP, deficiências olfativas incluem déficits na identificação odor, detecção e discriminação e são encontrados em até 70-95% dos pacientes 2-5. Estes déficits podem preceder os sintomas motores da DP cardeal por até 4 anos, indicando que a disfunção olfativa pode sinalizar os primeiros estágios de PD 6-10. A ocorrência precoce de déficits olfativos na DP levou a um grande interesse em disfunção olfativa e os mecanismos subjacentes envolvidos. Em estudos pré-clínicos em roedores, disfunção olfactiva pode ser uma medida do resultado sensível para prever o potencial terapêutico de novas estratégias terapêuticas. Muitos testes foram concebidos e amplamente utilizado para caracterizar deficiências sensório-motoras em modelos de roedores de PD e test o potencial terapêutico de novos tratamentos 11-15. Embora déficits olfativos estão bem documentados na DP, a função olfativa não tem sido realizada rotineiramente em muitos modelos. Essa visão está mudando, embora com a descoberta de formas genéticas de PD ea noção mais aceita que a DP é uma doença sistêmica que afeta mais do que apenas a função sensório-motor. Atualmente, existem vários estudos em modelos genéticos do rato do PD e outras doenças neurodegenerativas, que agora incluem a análise do olfato na caracterização 16-24. Dado o crescente interesse dos disfunção olfactiva em desordens neurodegenerativas, procurou-se montar uma bateria de testes olfactivos que podem ser utilizados para caracterizar novos modelos de neurodegeneração, assim como potenciais terapias modificadoras da doença de teste em estudos pré-clínicos. Os ensaios descritos no presente estudo tenham sido utilizados em ambas caracterização e os estudos pré-clínicos 18,25. Os testes highlighted neste estudo tenha sido mostrado para ser sensível para detectar disfunção olfactiva em um modelo de ratinho que sobre-expressam frequentemente utilizadas alfa-sinucleína de doença de Parkinson 18. Eles incluem o teste de sedimento enterrado 26,27, uma versão modificada do teste de bloco 23,24,28,29, e o teste de habituação / dishabituation 30. É importante notar que existem várias adaptações dos testes descritos neste estudo que são medidas sensíveis da função olfativa em camundongos, os destacados neste estudo são os testes de nosso laboratório tem mais experiência e utilizar rotineiramente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="352">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Cap&#39;n Crunch</td>
			<td style="width:88px;">Quaker Oats</td>
			<td align="right" style="width:88px;">3E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Wooden Blocks</td>
			<td style="width:88px;">Lara&#8217;s Crafts</td>
			<td align="right" style="width:88px;">10144</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="379" rowspan="6" style="height:379px;width:88px;">Flavor Extracts</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;">Kroger</td>
			<td style="width:88px;">Almond: 011110664716</td>
			<td rowspan="6" style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Anise: 011110615619</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Banana: 011110669919</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Coconut: 011110669889</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:88px;">Lemon: 011110669957</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:88px;">Orange: 0011110669964</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="59" rowspan="2" style="height:59px;width:88px;">Tissue Cartridges</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Z672122-500EA</td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">Manufactured by Simport no: M490-2</td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Cotton Balls</td>
			<td style="width:88px;">Kroger</td>
			<td align="right" style="width:88px;">1.1111E+10</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">Mouse Cages</td>
			<td style="width:88px;">Ancare</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:88px;">19 x 29 x 12.7 cm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:88px;">Camcorder</td>
			<td style="width:88px;">Sony</td>
			<td style="width:88px;">&#160;HDR-HC9</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:88px;">MiniDV Tapes</td>
			<td style="width:88px;">Sony DVC premium</td>
			<td align="right" style="width:88px;">2.7243E+10</td>
			<td style="width:88px;">60 minute long play&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

olfactory assays for mouse models of neurodegenerative disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

A pelota, bloco, e testes de habituação / dishabituation enterrados são todas as avaliações altamente vantajosas de olfato em camundongos. Usando estes testes, encontramos alterações significativas no olfato em vários modelos de mouse genética da doença de Parkinson, incluindo a superexpressão de alfa-sinucleína (Thy1-ASYN) 18 e camundongos knockout Atp13a2. Ambos Thy1-ASYN e Atp13a2 camundongos knockout levar mais tempo para encontrar o pellet enterrado do que os controles 18. Figuras 1-3 mostram os dados coletados a partir de tipo selvagem e Atp13a2 camundongos knockout. No teste de sedimento enterrado, ratinhos knockout Atp13a2 mostram um aumento de latência para encontrar a pastilha enterrado em comparação com ratinhos de controlo do tipo selvagem (Figura 1). No teste bloco, tanto do tipo selvagem e camundongos knockout Atp13a2 farejar o romance quadra da gaiola de um outro rato em comparação com os blocos de sua própria gaiola (Figura 2). Nos camundongos teste de habituação / dishabituation tipo selvagem mostrar habituação a um odor e<html> em seguida, aumentou quando cheirar um romance odor é introduzida (figura 3). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 enterrada sedimento teste. Latência para encontrar o sedimento em tipo selvagem (n = 10) e Atp13a2 KO (n = 14) a 20-27 m de idade. * P &lt;0,05, Mann-Whitney U. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51804/51804fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 teste Bloco Tempo farejando o novo bloco (E) no teste de bloco em wildtype (n = 10) e Atp13a2 KO (n = 12) ratos do sexo feminino em 20 -. 27m de idade. ΔΔ representa p &lt;0,01 em comparação com os blocos A, B, e C do mesmo genótipo. Mann-Whitney U. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51804 / 51804fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3 teste de habituação / dishabituation. Tempo farejando um cartucho perfumado em camundongos de tipo selvagem média (9 m idade, n = 7) por 6 ensaios e da introdução de um cartucho com um novo perfume em julgamento 7.

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Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Ensaios olfativas para o Rato modelos de doenças neurodegenerativas

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

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21.9K visualizações.  University of Cincinnati. Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Vídeo: Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature infants and the most common antecedent of cerebral palsy. PVL is characterized by periventricular white matter damage with prominent oligodendroglial injury. Hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation are the primary causes of PVL. We use P6 mice to create models of neonatal brain injury by the induction of hypoxia/ischemia with or without systemic infection/inflammation with unilateral carotid ligation followed by exposure to hypoxia with or without injection of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS). Immunohistochemistry of myelin basic protein (MBP) or O1 and electron microscopic examination show prominent myelin loss in cerebral white matter with additional damage to the hippocampus and thalamus. Establishment of mouse models of PVL will greatly facilitate the study of disease pathogenesis using available transgenic mouse strains, conduction of drug trials in a relatively high throughput manner to identify candidate therapeutic agents, and testing of stem cell transplantation using immunodeficiency mouse strains.

We established mouse models of periventricular leukomalacia (PVL), the predominant brain injury in premature infants characterized by periventricular white matter lesions. Hypoxia/ischemia with/without systemic infection are the primary causes of PVL. Unilateral carotid ligation and hypoxia exposure with/without lipopolysaccharide injection creates PVL-like lesions in P6 mice.

Modelos de mouse de leucomalácia periventricular

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

Neurociência

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

Avaliando fenótipos Neurodegenerativas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios dopaminérgicos subindo Ensaios e toda Imunocoloração Cérebro

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Avaliação da permeabilidade da barreira hemato - encefálica por infusão intravenosa de albumina FITC-etiquetadas em um modelo do rato da doença neurodegenerativa

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.