Os autores gostariam de agradecer a S Castorani, AJ Eustis, GA Gambetta, CM Manuck, Z Nasafi, e A Zedan. Este trabalho foi financiado por: o Departamento de Agricultura dos EUA-Agricultural Research atual financiamento Serviço de Pesquisa do Sistema de Informação (projeto de pesquisa não 5306-21220-004-00; fonte de luz avançada é apoiada pelo diretor do Escritório de Ciência, Instituto de Basic. ciências da energia, do Departamento de Energia dos EUA sob Contrato n º DE-AC02-05CH11231);. Especiais e Nifa culturas pesquisa iniciativa subvenção para AJM.

Protocolo detalhes descritos abaixo foram escritas especificamente para o trabalho no Fonte de Luz Avançado 8.3.2 linha de luz. Adaptações podem ser necessárias para o trabalho em outras instalações síncrotron. Segurança e formação adequada de radiação é necessário para o uso desses recursos. 1. Preparação de amostras das plantas vivas <ol><li> Crescer plantas em vasos de ~ 10 cm de diâmetro, e de assegurar que a haste principal (ou uma porção da planta a ser digitalizada) é centrado possível e orientado verticalmente no vaso. As dimensões físicas do instrumento TCAR hutch nos limites Fonte de Luz Avançada plantas vivas para ~ 1 m de altura. Como conseqüência, a imagem de plantas vivas é melhor realizado em mudas / mudas cultivadas em vasos pequenos. Dependendo da experiência, diferentes tipos de solo pode ser usado para controlar o teor de humidade do solo (por exemplo, em experiências de seca), e para algumas plantas com rebentos flexíveis (por exemplo, vinha) rebentos mais longos podem ser cuidadosamente tucked no tubo acrílico descrito abaixo (ver Figuras 1 e 2). </li><li> Monte os vasos de plantas vivas em um pegador de panela feito por encomenda de alumínio rígido. A altura da placa superior pode ser ajustada para acomodar uma gama de alturas de panela. O topo da placa é desenhado para se alinhar com a parte superior da superfície do solo, e as plantas sobressai a partir do centro da placa de duas partes. A finalidade do titular pote é garantir o caule é mantido firmemente no lugar para minimizar a vibração ou movimento da amostra. Minimizando movimento amostra durante uma varredura é essencial. </li><li> Uma vez montado no suporte, medir o potencial da água ou do caule de transpiração da folha usando uma câmara de pressão Scholander estilo ou um clip-on porómetro de folha, respectivamente, para determinar o estado fisiológico da planta antes da digitalização. </li><li> Coloque um cilindro de acrílico de paredes finas sobre a planta e em cima do titular da fábrica de alumínio e fixá-lo no lugar com argila putty para estabilizar aamostra (Figura 2). Qualquer vibração ou movimento da folha superior será transmitido para baixo a haste e fazer com que o tecido da planta na zona digitalizada a mover-se, em última análise conduzindo à distorção da imagem. O cilindro é usado para conter folhagem das plantas e evitar que folhas de plantas de raspar outros equipamentos no hutch que resultariam em vibrações durante uma varredura. Plástico adicional, toalhas de papel, e a fita deve ser usada para reduzir ainda mais a vibração e movimento de partes de plantas (ver problemas associados com o movimento da amostra na Figura 4). Para reduzir a absorção de raios-x (que pode diminuir a qualidade da imagem a um dado tempo de exposição), o cilindro contendo deveria ter como paredes finas quanto possível, mantendo ao mesmo tempo uma rigidez suficiente para realizar a sua função. </li><li> Fixe o suporte de potenciômetro personalizado para o palco rolamento de ar e bloquear (parafuso) no lugar entre a fonte de raios-x e do sensor de imagem e equipamentos de câmera. Positina haste vertical possível e um centro de base de bucha magnética para assegurar que a amostra permanece no campo de visão durante a rotação. </li></ol> 2. Preparação de amostras para Fresh de Tecidos Vegetais, excisadas <ol><li> O material vegetal fresco, geralmente caules ou pecíolos, podem ser verificados após a remoção imediata de uma planta viva. Se a intenção do experimento é visualizar a totalidade da água no xilema de rede, no interior dos vasos deve ser evacuado e substituído por ar. Para fazer isso, montar a amostra, numa câmara de pressão e estilo Scholander empurrar o ar comprimido ou de azoto através da amostra, a baixa pressão (&lt;MPa 0,05) durante cerca de 5 min. Espécies diferem no tempo necessário para evacuar a rede de vasos. Se a intenção é a de avaliar a extensão da formação de embolia no tecido de planta fresco e, em seguida amostras de consumo a partir da planta utilizando uma lâmina de barbear fresco e fazer os cortes debaixo de água. </li><li> Enrole a amostra em uma camada de Parafilm para prdessecação evento durante a varredura. </li><li> Montar a amostra num mandril, fixado a uma placa de metal, que é aparafusado na fase rolamento de ar. Centro e orientar a amostra verticalmente como descrito acima, para assegurar que a amostra permanece no campo de visão. </li></ol> 3. Preparação de Amostras para tecidos Woody secos <ol><li> Para a visualização de tecido óptima da amostra e o contraste da imagem, é necessário para desidratar lentamente a amostra de tecido inteiro lenhosa. Cortar amostras para cerca de 6 cm de comprimento. Seleccionar amostras que são tão direito quanto possível na zona de verificação alvo e têm um diâmetro de ≤ 1 cm. </li><li> Colocar a amostra de tecido lenhoso em um forno de secagem a baixa temperatura para secar a amostra lentamente, sem causar qualquer quebra ou separação do tecido. Este processo é susceptível de variar entre espécies e tecidos. Para caules lenhosos, 12 h em estufa a 40 ° C é geralmente suficiente para proporcionar um contraste excelente sem causar cha significativasnges na estrutura física da haste (ver problemas com secagem rápida demonstrada na Figura 3). </li><li> Em algumas situações, é desejável dispor de um marcador fiduciária dentro da amostra de tal modo que a dissecção posterior e visualização com microscopia electrónica de varrimento podem ser orientados para pontos específicos no TCAR. Para fazer isso, apor um metal ou esferas de vidro ou um fio para o exterior da haste com Parafilm. Um outro método é a utilização de uma resina de silicone (por exemplo, RTV-141, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ), que pode ser injectado numa conduta de xilema único (ver exemplos no Brodersen et al 2010). Uma vez endurecida, a resina de silicone é claramente visível na amostra e facilmente distinguidos dos outros recipientes cheios de ar. Utilizar este marcador para localizar precisamente as regiões específicas da amostra. </li><li> Montar a amostra no centro do mandril e tal como descrito acima. </li></ol> 4. Preparação de Amostras para Folha Tissue de duas dimensões (2D) radiogramas <ol><li> Para visualizar o conteúdo dos vasos em folhas, quase em tempo real, as folhas podem ser digitalizados para produzir um radiograma 2D, semelhante a uma radiografia dentária. Monte a folha entre duas folhas de plástico acrílico fino, e fixar as bordas com clipes. Em seguida, coloque a amostra montada para um sistema de titular do cargo e posição da breadboard óptica ao lado do sistema de imagem e raio-x fonte. </li></ol> 5. Digitalização da amostra no Hutch 8.3.2 <ol><li> Decida a ampliação que irá funcionar melhor para sua aplicação. ALS Beamline 8.3.2 tem a capacidade de digitalizar com lentes com ampliações de 2x, 5x e 10x. Isto resulta em tamanhos de imagem de pixel de 4,5, 2,25 e 0,9 uM, respectivamente. Dependendo da ampliação, a amostra deve ser de tamanho adequado, tal como o campo de visão diminui com o aumento da ampliação. Veja os detalhes para escolha da câmera e lente e os parâmetros de imagem resultante da Tabela 1.</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> PCO.4000 (4008x2672) </td><td colspan="2"> PCO.Edge (2560x2160) (Optique Pedro) </td></tr><tr><td> Lente </td><td> pixel (mm) </td><td> campo de visão (mm) </td><td> pixel (mm) </td><td> campo de visão (mm) </td></tr><tr><td> 10x </td><td> 0,9 </td><td> 3,6 </td><td> 0.65 (0.69) </td><td> 1.7 (1.7) </td></tr><tr><td> 5x (4x) </td><td> 1,8 </td><td> 7,2 </td><td> 1.3 (1.72) </td><td> 3.3 (4.4) </td></tr><tr><td> 2x </td><td> 4,5 </td><td> 18 </td><td> 3.25 (3.44) </td><td> 8.3 (8.8) </td></tr><tr><td> 1x </td><td> 9 </td><td> 36 </td><td> 6.5 (-) </td><td> 16,6 (-) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Detalhes sobre disponívelcâmeras e lentes em ALS 8.3.2. <ol start="2"><li> Definir a energia de raios-x a 15 keV. Isto tem sido mostrado para fornecer o contraste da imagem excelente para a maioria das aplicações de plantas (ver Brodersen et al. 2010, 2011, 2012a incumbentes, b). Os tempos de exposição são geralmente dependentes da espessura e da densidade da amostra (e, portanto, a ampliação usada) variam entre 100 e 1000 mseg. Tempos de exposição mais longos (desde pixels do detector não são saturados) conduzem geralmente a uma maior relação sinal-ruído, mas à custa de tempos de leitura mais elevados. </li><li> Escolha um incremento angular que é apropriado para sua aplicação. As amostras são rodadas 180 ° durante uma varredura, e o número de imagens captadas durante a rotação pode ter um impacto significativo sobre o tamanho do conjunto de dados de comprimento do intervalo de pesquisa, e a qualidade da imagem final, mas não são geralmente decrescentes em qualidade. As digitalizações são realizados em incrementos de 0,25 °, produzindo 721 imagens por digitalização. Diminuindo os increment para 0,125 resultados ° em melhores imagens para visualizar detalhes, mas os rendimentos 1.440 imagens e, assim, um conjunto de dados muito maior (para uma região típica de interesse, isto significa ~ 10-30 GB de dados contra 5 GB). No entanto, a relação sinal-ruído é frequentemente melhorado e vale tanto o tempo de verificação e aumentou o tamanho dos dados. Talos secos que não são susceptíveis de deformar / encolher durante a digitalização pode ser submetido a intervalos mais longos (incremento angular menor) sem detrimento. Quando as plantas de imagem ao vivo, onde os processos biológicos (por exemplo, reparação embolia) ocorrem em escalas de tempo curtas, optando por intervalos mais curtos de varredura é preferível limitar os potenciais efeitos nocivos da radiação de raios X sobre este tecido, embora isso tem um potencial perda de qualidade da imagem. Intervalos mais curtos de digitalização pode ser conseguida usando a configuração de Tomografia contínua, durante o qual a amostra continuamente gira enquanto as imagens são capturadas. </li><li> Para cada exame, &quot;campo claro&quot; e &quot;escuro&quot; de campo imagens devem ser corrected. As imagens de campo brilhante são imagens sem a amostra no feixe. Estes são muitas vezes colhidos antes e após a verificação da amostra pela horizontalmente traduzindo a amostra. Campos escuros são recolhidos por fechar o x-ray-obturador esta medida a quantidade de sinal a câmera mostra sem raios-x. </li></ol> 6. Informática <ol><li> Transfira os &quot;brutos&quot; imagens 2D. TIF, que foram exportados a partir do computador de aquisição de um servidor de arquivos para um computador, processamento de dados. Se o computador tem RAM suficiente, os dados podem ser copiados de um assim chamado &quot;Drive RAM&quot; (uma porção da RAM aparece como uma unidade de disco rígido do computador). Deste modo, o software não tem de aceder a uma unidade de fiação rígido, o que é relativamente lenta em comparação com uma unidade de estado sólido ou memória flash. Este passo reduz significativamente a quantidade de tempo necessário para processar conjuntos de dados. </li><li> As imagens devem ser convertidos para uma escala de percentagem de transmissão. Beamline 8.3.2 tem um ba personalizadockground normalização plug-in que pode ser baixado e usado com o software disponível gratuitamente pacotes ImageJ ou Fiji ( <a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a> ). Subtrai as contagens escuras a partir das imagens e normaliza as imagens de amostra pelos campos brilhantes para produzir imagens que mostram a transmissão por cento. Carregar imagens normalizadas para o pacote de software Octopus ( <a href="http://www.inct.be/en/software/octopus" target="_blank">http://www.inct.be/en/software/octopus</a> ) e &quot;reconstruir&quot; o conjunto de dados 3D a partir do 2D-primas. TIF arquivos usando as etapas de processamento designadas (Normalize imagens, remoção Anel , criação Sinogram, reconstrução feixe Paralela). Esse processo gera uma série de. TIF transversal (transversal) imagens compostas de &quot;voxels&quot; (elementos de pixels volumétricos), cada um com valores de x, y, z de coordenadas e intensidade representando o raio-x coeficiente de absorção linear. </li></ol> 7. Visualização <ol><li> Visualize a pilha de imagens em um de uma variedade de pacotes de software. Freeware (eg Drishti, <a href="http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml" target="_blank">http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml</a> ) pode ser usado para visualizar ou volumes individuais ou pilhas de imagens (por exemplo ImageJ ou FIJI). Outros pacotes de software pode ser utilizado para a visualização 3D. Nosso grupo de pesquisa utiliza o pacote de software Avizo ( <a href="http://www.vsg3d.com/avizo/overview" target="_blank">http://www.vsg3d.com/avizo/overview</a> ), mas outros, como Amira ( <a href="http://www.amira.com/ " target="_blank">http://www.amira.com/</a> ) e VGStudioMax ( <a href="http://www.volumegraphics.com/" target="_blank">http://www. volumegraphics.com /</a> ) também são comumente usados. </li><li> Carregar conjuntos de dados na memória do sistema e apresentar a amostra em virtual transversal, longitudinal ou orientações radiais fatia. Por causa dos atributos do conjunto de dados 3D, fatias virtuais através do sample pode ser rodado em qualquer plano para alinhar com as regiões de interesse, uma melhoria significativa sobre microscopia de luz tradicional de série (ver Filmes 1-3 para exemplos detalhados). </li><li> Para visualizar a amostra, se necessário, em 3D, o &quot;segmento&quot; da amostra, utilizando a variedade de rotinas semi-automáticas e manuais em Avizo para separar lúmens dos vasos ou outras estruturas do tecido circundante. Segmentação refere-se a definição de fronteiras entre os objetos de interesse, separando assim ou segmentá-los em regiões separadas. Volumes de renderização em 3D é feita pelo software de visualização. Um método para fazer isto é o volume de processamento directo, em que cada ponto de um volume é assumido que emitem e absorvem luz, a quantidade e cor de emissão e absorção pode ser definida usando um &quot;mapa de cores&quot;, e a projecção resultante numa dada direcção é apresentada no ecrã. Alternativamente, uma estrutura de arame ou superfície de malha 3D que representa os limites segmentados é construído para mostrar um modelo 3D de tele estrutura de interesse. A malha 3D é composto de elementos poligonais, e o número total de elementos que afectam tanto a fidelidade de reprodução estrutura e o tamanho do ficheiro de dados associada (isto é, elementos mais leva a uma maior fidelidade, mas de tamanho maior de arquivo). Uma variedade de módulos de processamento de imagem estão disponíveis dentro do software de visualização para controlar as saídas de volume de processamento, bem como o controle de brilho da imagem, contraste, transparência, redução de ruído, etc </li></ol> 8. Quantificação <ol><li> Uma vez que a segmentação tem sido realizado, é possível quantificar as estruturas alvo de plantas ou de alterações funcionais do volume, o comprimento, a largura, a presença ou ausência de água, ar, etc Por exemplo, Brodersen et al. (2010) utilizado para quantificar software Avizo a variação do volume de gotículas de água no interior dos vasos de videira de recarga. As plantas foram verificados a cada 30 minutos ao longo de quatro a oito horas a criação de um momento-lapse seqüência de navio de reabastecimento. Cada varrimento foi reconstruído e carregado em Avizo, onde gotículas individuais foram medidos ao longo do tempo como o seu volume aumentado. </li></ol>

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Não temos nada a revelar.

Synchotron TCAR fornece biólogos de plantas com uma ferramenta poderosa, não-destrutivo para explorar o funcionamento interno dos vasos de plantas com detalhes incríveis. Esta tecnologia tem sido usada recentemente para identificar previamente não descritas estruturas anatômicas do xilema videira que diferencialmente alteram a conectividade de rede do xilema em espécie de videira diversas (Brodersen et al 2012b, no prelo.) - Essa conectividade pode alterar drasticamente a capacidade de patógenos...

Água é transportada das raízes para as folhas em um tecido vascular chamado xilema - uma rede de condutas interligados, fibras e vivos, células metabolicamente ativas. Função de transporte do xilema da planta deve ser mantida para fornecer nutrientes e água para as folhas para a fotossíntese, o crescimento e, finalmente, de sobrevivência. O transporte da água nas condutas do xilema pode ser interrompida quando a rede do xilema é comprometida por organismos patogénicos. Em resposta a tais plantas infecções muitas vezes produzir geles, gomas, e Tilos como um meio para isolar propagação agente patogénico (por exemplo, McElrone et al 2008; 2010). O estresse hídrico também pode limitar o transporte de água no xilema. Como as plantas perdem água durante a seca prolongada, a tensão na seiva do xilema. Água sob tensão é metastãvel (isto é, a um certo limiar, a tensão torna-se suficientemente grande para cavitar colunas de água contida nas condutas de xilema). Após a cavitação ocorre, uma bolha de gás (embolismo) podem formar e encher as conduit, o movimento da água de forma eficaz de bloqueio (Tyree e Sperry, 1989), um fenômeno análogo a doença de descompressão (ou seja, &quot;as curvas&quot;) em mergulhadores de águas profundas. Apesar da importância do transporte de água no xilema para a função planta ideal, como demonstrado por um vasto corpo de literatura histórica e contemporânea sobre este tema (Tyree &amp; Zimmermann, 2002;. Holbrook et al, 2005), ainda há aspectos de redes do xilema que permanecem indescritível . Vários grupos de pesquisa começaram recentemente a utilização de alta resolução de raios-x computadorizada micro-tomografia (TCAR) para avaliar pequenos detalhes de anatomia da madeira e tecido vascular (por exemplo, Mayo et al; 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a incumbentes, b; Maeda e Miyake, 2009; Estepe et al 2004).. TCAR é uma técnica não destrutiva utilizada para visualizar as características do interior de objectos sólidos e de obter a informação digital sobre os seus 3-D propriedades estruturais. TCARdifere da medicina convencional CAT-scanning na sua capacidade de resolver os detalhes tão pequenos quanto um micron de tamanho, até mesmo para os objectos de alta densidade. Os recentes avanços na tecnologia síncrotron TCAR melhorou a resolução da imagem e relação sinal-ruído suficiente para que as redes de recursos de navios e conexões intervasculares pode ser visualizado, atribuído coordenadas 3D, e exportado para simulações hidráulicas. Brodersen et al. (2011) recentemente avançou esta técnica combinando reconstruções 3D gerados pelo síncrotron TCAR com um modelo de Fortran que extrai automaticamente os dados da rede xilema em resolução muito maior do que jamais foi possível com os tradicionais métodos anatômicos (ou seja, o corte de série com um micrótomo e captura de imagem com microscopia de luz, por exemplo, Zimmermann 1971). Este trabalho também tem sido utilizada para optimizar modelos hidráulicos do sistema de xilema e identificadas características únicas de transporte (isto é, o fluxo reverso em algumas vessels durante os períodos de pico de transpiração) (Lee et al., em revisão). Síncrotron TCAR pode agora ser usado para visualizar a funcionalidade do xilema, a susceptibilidade a cavitação, e capacidade de plantas para reparar condutas embolização. A falta de restabelecer o fluxo nas condutas embolizados reduz a capacidade hidráulica, a fotossíntese limites, e resulta na morte das plantas, em casos extremos (McDowell et al. 2008). As plantas podem lidar com êmbolos pelo desvio da água em torno de bloqueios através de poços de ligação adjacentes condutas funcionais, e pela crescente xilema novo para substituir perdeu capacidade hidráulica. Algumas plantas possuem a capacidade de reparar quebras nas colunas de água, mas os detalhes deste processo no xilema sob tensão não está claro por décadas. Brodersen et al. (2010) recentemente visualizado e quantificado o processo de recarga em videiras ao vivo usando TCAR. Vaso sucesso reenchimento foi dependente influxo de água a partir de células vivas em torno do xylin condutas, onde gotículas de água individuais expandiram ao longo do tempo, vasos cheios, e forçaram a dissolução do gás aprisionado. A capacidade de plantas diferentes para reparar vasos do xilema comprometidos e os mecanismos que controlam esses reparos estão sendo investigadas. Descrição da instalação de ALS Beamline 8.3.2 Nosso trabalho até à data tem sido realizados sobre o Hard X-ray Micro-Tomografia Beamline 8.3.2 na fonte avançada Luz no Laboratório Nacional Lawrence Berkeley (Berkeley CA EUA). As amostras de plantas são colocadas em um revestida de chumbo hutch localizado a 20 m da fonte de raios-x, gerado por um ímã curva 6 Tesla supercondutor dipolo dentro da Fonte de Luz Avançado elétron operacional anel de armazenamento com uma energia crítica de 11,5 KeV. Um esquema da estação final é mostrado na Figura 1. As radiografias entrar na gaiola com um tamanho de feixe de 40x ~ 4,6 mm e passar através da amostra que está montado sobre uma fase de rotação motorizada. Otransmitido raios X colidem com um cintilador de cristal (dois materiais vulgarmente utilizados são LuAG CdWO ou 4) que convertem raios X em luz visível que é transmitido através de lentes sobre um CCD de recolha de imagem. A câmara de cintilação, e ópticas estão contidos dentro de uma caixa de luz que é apertado sobre trilhos que permite que a distância de amostra-para-cintilador para ser optimizado para imagens de contraste de fase. Todas as amostras são montadas na etapa 10 cm de diâmetro de rotação que por sua vez está montada sobre as fases de tradução horizontal e vertical para o posicionamento da amostra. Uma amostra de planta viva, com o sistema de raiz montado em um suporte de panela planta construída personalizado e a folhagem contido em um tubo de acrílico, pode ser visto na Figura 2. Tempos de exposição típica pode variar 0,1-1 seg usando 10-18 keV, e durações de varredura irá variar 5-40 min, dependendo das configurações optimizadas para uma determinada amostra. Para amostras de altura (típica das redes de xilema de plantas), varreduras de dados podem serladrilhado, repetindo a medição com a amostra em alturas diferentes, o que é controlado automaticamente, permitindo seamless secções seriadas ao longo de uma altura de amostragem máxima de ~ 10 cm. Largura máxima da amostra, quando imagiologia em 4,5 uM resolução é ~ 1 cm em relação às amostras que são quase perfeitas na orientação vertical. Geração de dados e processamento é concluído usando o protocolo listados abaixo. Por causa da diferença de atenuação de raios X entre o ar e a água, o contraste da imagem pode ser obtida excelente nas plantas sem a utilização de soluções de contraste típico de sistemas médicos de TC. O lúmen do vaso cheio de ar é facilmente distinguível do tecido circundante cheia de água em plantas hidratadas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Material Name/Equipment </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature

Alta resolução de raios-X a tomografia computadorizada (TCAR) é uma técnica não-destrutiva de diagnóstico por imagem com sub-mícron capacidade de resolução que está sendo usada agora para avaliar a estrutura e função da rede de xilema de plantas em três dimensões (3D) (por exemplo, Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a incumbentes, b). TCAR de imagem baseia-se nos mesmos princípios que o médico CT sistemas, mas uma alta intensidade de sincrotrão resultados de raios-x de fonte na maior resolução espacial e diminuição do tempo de aquisição de imagem. Aqui, demonstramos detalhadamente como síncrotron baseado TCAR (realizado na Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, EUA) em combinação com Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, EUA), está a ser utilizada para explorar xilema de plantas em excisadas do tecido e plantas vivas. Esta ferramenta permite que os usuários de imagem nova para ir além tradicional luz estática, 2D ou microscopia eletrônica e amostras de estudo usando virtuais cortes seriados em qualquer plano. Um número infinito de fatias em qualquer orientação cum ser feitas com a mesma amostra, uma característica que é fisicamente impossível utilizar métodos de microscopia tradicionais. Os resultados demonstram que a TCAR pode ser aplicada a ambos herbáceas e espécies de plantas lenhosas, e uma variedade de órgãos da planta (folhas, ou seja, pecíolos, caules, troncos, raízes). Os números apresentados aqui ajudar a demonstrar tanto uma gama de anatomia representante plantas vasculares e do tipo de detalhe extraído de conjuntos de dados de TCAR, incluindo verificações de costa sequóias (Sequoia sempervirens), nogueira (Juglans spp.), Carvalho (Quercus spp.), E de bordo ( Acer spp.) mudas de árvores para girassóis (Helianthus annuus), videiras (Vitis spp.) e samambaias (Pteridium aquilinum e Woodwardia fimbriata). Amostras excisadas e secas de espécies lenhosas são mais fáceis de digitalizar e normalmente produzem as melhores imagens. No entanto, as melhorias recentes (varreduras ou seja, mais rápidos e de estabilização da amostra), tornou possvel para usar esta técnica de visualização de tecidos verdes (por exemplo, pecíolos) e em plantas vivas. Na ocasião algum encolhimento de tecidos vegetais verdes hidratados fará imagens para borrão e métodos para evitar estes problemas são descritos. Esses avanços recentes com TCAR fornecer promissores novos insights sobre a função vascular da planta.

Scans Synchotron TCAR foram implementados com sucesso numa vasta variedade de tecidos e espécies vegetais utilizando beamline 8.3.2 (Figura 5), e proporcionaram novas perspectivas sobre a estrutura e função do xilema de plantas de resolução sem precedentes em 3D. As capacidades de visualização e exploração fornecidos pelas reconstruções 3D (como ilustrado nas Figuras 6-8, e 1-3) Filmes permitir a determinação precisa da localização e orientação das estruturas com as red...

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Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature | Biology | Video

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Alta resolução de raios-X de tomografia computadorizada (PCA), é um não-destrutiva técnica de imagiologia de diagnóstico que pode ser utilizada para estudar a estrutura e função dos vasos de plantas em 3D. Demonstramos como TCAR facilita a exploração de redes de xilema através de uma ampla variedade de tecidos e espécies vegetais.

Usando tomografia de tórax para visualizar a estrutura tridimensional e Função da Usina Vasculatura

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

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20.9K visualizações.  U.S. Department of Agriculture. Alta resolução de raios-X de tomografia computadorizada (PCA), é um não-destrutiva técnica de imagiologia de diagnóstico que pode ser utilizada para estudar a estrutura e função dos vasos de plantas em 3D. Demonstramos como TCAR facilita a exploração de redes de xilema através de uma ampla variedade de tecidos e espécies vegetais.

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Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Biologia

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography (Micro-CT) Imaging Method

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an International Space Station (ISS) mission. However, the underlying mechanisms of these spaceflight-induced changes are currently unknown. The purpose of the present study was to determine the impact of the spaceflight environment on ocular structures by evaluating the thickness of the mouse retina, the retinal pigment epithelium (RPE), the choroid and the sclera layer using micro-CT imaging. Ten-week-old C57BL/6 male mice were housed aboard the ISS for a 35-day mission and then returned to Earth alive for tissue analysis. For comparison, ground control (GC) mice on Earth were maintained in identical environmental conditions and hardware. Ocular tissue samples were collected for micro-CT analysis within 38(&#177;4) hours after splashdown. The images of the cross-section of the retina, the RPE, the choroid, and the sclera layer of the fixed eye was recorded in an axial and sagittal view using a micro-CT imaging acquisition method. The micro-CT analysis showed that the cross-section areas of the retina, RPE, and choroid layer thickness were changed in spaceflight samples compared to GC, with spaceflight samples showing significantly thinner cross-sections and layers compared to controls. The findings from this study indicate that micro-CT evaluation is a sensitive and reliable method to characterize ocular structure changes. These results are expected to improve the understanding of the impact of environmental stress on global ocular structures.

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method

We present a protocol using high-resolution micro-computed tomography imaging to determine whether spaceflight induced damage on ocular structures. The protocol shows the micro-CT-derived measurement of ex vivo rodent ocular structures. We demonstrate the ability to assess ocular morphological changes following spaceflight using a non-destructive tridimensional technique to evaluate ocular damage.

Avaliação da estrutura ocular global após o voo espacial usando um método de imagem de tomografia microcomputada (Micro-CT)

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an ...

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron spin echo, diffraction, and inelastic scattering. Unlike neutron scattering techniques that obtain information in reciprocal space, attenuation-based neutron imaging measures a signal in real space that is resolved on the order of tens of micrometers. The principle of neutron imaging follows the Beer-Lambert law and is based on the measurement of the bulk neutron attenuation through a sample. Greater attenuation is exhibited by some light elements (most notably, hydrogen), which are major components of biological samples. Contrast agents such as deuterium, gadolinium, or lithium compounds can be used to enhance contrast in a similar fashion as it is done in medical imaging, including techniques such as optical imaging, magnetic resonance imaging, X-ray, and positron emission tomography. For biological systems, neutron radiography and computed tomography have increasingly been used to investigate the complexity of the underground plant root network, its interaction with soils, and the dynamics of water flux in situ. Moreover, efforts to understand contrast details in animal samples, such as soft tissues and bones, have been explored. This manuscript focuses on the advances in neutron bioimaging such as sample preparation, instrumentation, data acquisition strategy, and data analysis using the High Flux Isotope Reactor CG-1D neutron imaging beamline. The aforementioned capabilities will be illustrated using a selection of examples in plant physiology&#160;(herbaceous plant/root/soil system)&#160;and biomedical applications&#160;(rat femur and mouse lung).

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory&#039;s High Flux Isotope Reactor

This manuscript describes a protocol for neutron radiography and computed tomography of biological samples using a High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D beamline to measure a metal implant in a rat femur, a mouse lung, and an herbaceous plant root/soil system.

Radiografia de Nêutrons e Tomografia Computadorizada de Sistemas Biológicos no Reator de Isótopos de Alto Fluxo do Oak Ridge National Laboratory

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches have rarely been used to study equine athletic injury. Degenerative osteoarthritis caused by mechanical stress can originate from chronic postural dysfunction, which, because the primary dysfunction is often distant from the site of tissue injury, is best identified through modeling whole-body biomechanics. To characterize whole-body equine kinematics, a realistic skeletal model of a horse was created from equine computed tomography (CT) data that can be used for functional anatomical and biomechanical modeling. Equine CT data were reconstructed into individual three-dimensional (3D) data sets (i.e., bones) using 3D visualization software and assembled into a complete 3D skeletal model. The model was then rigged and animated using 3D animation and modeling software. The resulting 3D skeletal model can be used to characterize equine postures associated with degenerative tissue changes as well as to identify postures that reduce mechanical stress at the sites of tissue injury. In addition, when animated into 4D, the model can be used to demonstrate unhealthy and healthy skeletal movements and can be used to develop preventative and rehabilitative individualized therapies for horses with degenerative lamenesses. Although the model will soon be available for download, it is currently in a format that requires access to the 3D animation and modeling software, which has quite a learning curve for new users. This protocol will guide users in (1) developing such a model for any organism of interest and (2) using this specific equine model for their own research questions.

The purpose of this protocol is to describe the method of creation of a realistic, whole-body, skeletal model of a horse that can be used for functional anatomical and biomechanical modeling to characterize whole-body mechanics.

Construção de um modelo esquelético equino realista, de corpo inteiro e tridimensional usando dados de tomografia computadorizada

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...