Os estudos foram conduzidos no Irving Moskowitz e Cherna Centro de Nano e Nano Bio-Imagem no Instituto Weizmann de Ciência. Somos gratos a Orna Yeger por sua ajuda na concepção e execução deste protocolo.

1. Preparação de amostras <ol><li> Depois de extrair o tecido que está a ser examinado, tecidos mineralizados pode ser posicionado no instrumento e imagens. Para a imagem do fêmur um rato deve seguir os seguintes passos: <ol><li> Remover pós mortem perna de um embrião C57/Bl6 18,5 postceutus dias (E18.5). </li><li> Selar a parte mais estreita de uma ponteira de poliestireno (2-20 mL) usando resina epóxi ou outra cola, e preencha a ponta com o buffer de trabalho (PBS ou outro). </li><li> Encaixar bem a perna na ponta e selar o outro lado com a folha de parafilme. </li><li> Coloque a ponta da pipeta em um suporte adequado e seguir o protocolo do capítulo 3. Para visualizar o fêmur da perna embrião de rato, o instrumento é definido 40 KV e 200 mA. Para 8μ resolução 1000 imagens de projeção com ampliação de 4x tem que ser adquirida. </li></ol></li><li> Não mineralizado tecidos têm de ser inicialmente fixado e corado, a fim de aumentar a atenuação de raios-X do tecido de interesse, usando um dos muitos protocolos disponíveis 8,9. Para os pulmões de ratos e amostras semelhantes, o protocolo de preparação é: <ol><li> Implantação Orthotopical de carcinoma do pulmão de não pequenas células (NSCLC) NCI-H460 em pulmões de ratos nua </li><li> Nódulos de câncer de pulmão passam a ser detectáveis ​​quatro semanas a partir da implantação </li><li> Sacrificar a ratazana e infundi-la imediatamente com soro fisiológico misturado com heparina </li><li> Injetá-lo com uma solução diluída de Microfil (Flowtech), (2 ml de solução composta, 3 ml de diluente e 0,3 ml de agente de cura) para o ventrículo esquerdo para manchar a circulação brônquica </li><li> Extrair os pulmões eo coração do rato </li><li> Imobilizar a amostra (ver capítulo 2 do protocolo) ajustando-o firmemente em um tubo de 50 ml de plástico teste </li><li> Criar uma atmosfera saturada de etanol, colocando no fundo do tubo de um pano embebido em etanol </li><li> Cola ou parafuso em um tubo do detentor do instrumento </li><li> Prosseguir com a definição dos parâmetros de imagem (capítulo 3). Para a imagem completa dos pulmões de ratos a fonte é de 40KV e 100 mA. A fim de alcançar uma resolução 16μ tem de adquirir 2500 imagens de projeção com uma ampliação de 0.5x. </li></ol></li></ol> 2. Imobilização amostra Em alta resolução, é importante evitar qualquer mudança na posição da amostra durante a medição. Para isso, a amostra é firmemente fixada em um recipiente de plástico que se encaixa o seu tamanho. Dicas de poliestireno pipeta, pipetas Pasteur de plástico especialmente construídos ou titulares de plástico são usados ​​a esse respeito. De acordo com os requisitos experimental, a amostra pode ser examinada no ar ou imersos em soluções de etanol ou tampão. Imobilização típicos e posicionamento final da perna do embrião de rato no instrumento é mostrado na Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Posicionamento final da perna embrionárias de camundongos no instrumento CT micro. 3. Definição de parâmetros de aquisição: x-ray de tensão e corrente, tempo de exposição CCD <ol><li> Colocado em um suporte, a amostra é colocada na fase de rotação do instrumento </li><li> Uma imagem de raio-x primeiro é tomado com a tensão ea corrente arbitrariamente definida. </li><li> Se a imagem está muito escura, deve-se aumentar o número de fótons primeiro lugar, para aumentar um pouco a corrente. Se isso não for suficiente, deve-se aumentar ligeiramente a energia dos fótons de raios-x, ou seja, a tensão no tubo de raios-x. </li><li> Se a imagem é muito brilhante, deve-se primeiro diminuir a tensão, então a corrente. </li><li> O brilho da imagem pode ser aumentada por binning. Binning de 1 leva em conta a intensidade de cada pixel da imagem, enquanto que binning de 2 leva a soma de cada matriz de pixels 2x2. A imagem será de cerca de 4 vezes mais brilhante do que no caso de binning 1, mas terão metade da resolução. </li><li> Depois de definir a luminosidade ideal, é preciso otimizar o tempo de exposição da câmara de compromisso entre o melhor contraste de um lado e uma duração razoável do experimento em outro lado. </li><li> O contraste das imagens, especialmente das amostras de baixa absorção, pode ser melhorada por meio de filtros, que reduzem o fluxo de fótons, principalmente a dos fótons de energia mais baixos. </li></ol> 4. Posicionamento da amostra <ol><li> Escolha a ampliação de trabalho. Escolhas possíveis são 0.5x, 4x, 10x, 20x e 40x. O campo de visão diminui com a ampliação cada vez maior. </li><li> Obter a melhor resolução e campo de visão, definindo as distâncias entre a fonte de raios-X ea amostra e entre a amostra eo detector. Aumentar a fonte de distância da amostra diminui o campo de visão e aumenta a resolução. Amostra com a distância detector tem o efeito oposto. </li></ol> Todo o campo para ser visto em 3D deve estar presente noprojeção de imagem em todos os ângulos. Deve-se verificar esta girando a amostra em diferentes ângulos e por trazer a amostra o mais perto possível do eixo de rotação. Para isso, deve-se seguir os seguintes passos: <ol start="3"><li> Ter uma imagem a 0 graus, e depois girar a amostra a -20 graus. Se o volume desejado mudou lateralmente, deve-se corrigir a sua posição através do reposicionamento do eixo de rotação. </li><li> Após a correção, a amostra deve ser rodado em outro ângulo e posição corrigida novamente, até que o campo de interesse está dentro da imagem em todos os ângulos de -90 a 90 graus. </li></ol> 5. Tomografia de alta resolução <ol><li> Durante a medição, a amostra é girada por um pequeno ângulo em um momento e em cada imagem de projeção um ângulo é tomada. O número total de imagens é sempre um compromisso entre a resolução desejada de um lado e no momento da medição e do tamanho do arquivo em outro lado. Como mostrado na Fig.2, cada única projeção inclui todas as fatias na amostra sobrepostas uma sobre a outra, e, portanto, não pode revelar a estrutura 3D da amostra. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Projeção de imagens do pulmão de ratos em 0 ° (A), 45 º (B) e 90 ° de ângulo de rotação (C). <ol start="2"><li> Só depois de tomar imagens de projeção, pelo menos, entre -90 e 90 graus, pode-se proceder à reconstrução do volume da amostra. Reconstrução leva entre 10 minutos e 2 horas, dependendo do software utilizado e do número de projeções. Mais uma vez, a qualidade final da imagem em 3D é um compromisso entre a resolução desejada e do tempo que se quer gastar e do tamanho do arquivo resultante. </li></ol> 6. Calibração da escala de imagem O nível de pixel (valor) em uma imagem reconstruída é exclusivo para essa imagem. A fim de comparar duas imagens diferentes, uma escala de intensidade única tem de ser imposta em cada imagem. Para este <ol><li> Executar uma tomografia com um fantasma padrão, utilizando as mesmas condições experimentais, como para a amostra </li><li> Recalibrar a imagem de exemplo usando os valores obtidos para o fantasma. A escala mais comum é a escala Hounsfield (ou CT). Para ampliação de 4x o valor de fundo de 15 mil (para água ou PBS) foi substituído por 0 eo valor máximo de 35.000 para o osso foi substituído com o valor padrão de Hounsfield 3000. Valores de pixel outras resultaram de interpolação linear ou extrapolação com base nesses limites. </li></ol> 7. Processamento de imagem e análise Depois de obter imagens de alta resolução, deve-se extrair informações relevantes usando software de análise de imagem. O pacote de software a ser utilizado tem que ser projetado para trabalhar com arquivos muito grandes (até 20Gb). 8. Resultados representante A representação de um fémur de um camundongo C57/Bl6 embrionárias no dia 18.5 (E18.5) - quatro dias após o início do processo de mineralização é mostrado na Figura 3. As camadas minerais são claramente visíveis (branco), enquanto os tecidos moles não são visíveis nesta preparação. Pegamos 1000 imagens de projeção com uma ampliação linear de 4x. A resolução final é de 8 microns. Uma análise cuidadosa da prestação de volume mostrado na Fig.1, mostra que a fração de volume ósseo (a fração do volume de osso que é ocupado por tecido mineralizado) é de 0,18, ea densidade mineral óssea é 723 mg / cm 3. Esses valores permitem-nos comparar essa estrutura com ossos em outros estágios de desenvolvimento. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Representações diferentes de uma imagem 3D de um embrião fêmur mouse. A (corte transversal) transversal (A), a seção (medio-lateral) sagital (B) e um instantâneo do volume renderização (C) são mostrados. A Figura 4 mostra uma imagem 3D do pulmão de um rato fêmea nude (RNU), 12 semanas de idade, implantado ortotopicamente com carcinoma do pulmão de não pequenas células (NSCLC) NCI-H460. 2500 imagens de projeção foram tiradas com uma ampliação linear de 0.5x, garantindo uma resolução final de 16 microns. A imagem mostra a Microfil vasos sanguíneos corados (até 20 mícrons de diâmetro). A análise das imagens mostra que quatro semanas após o implante, os nódulos de câncer múltiplas são formadas. Eles estão cobrindo uma fração significativa do volume de pulmão (17%). A maioria dos coloração pulmonar foi encontrada em áreas periféricas dos tumores. Significativamente, como mostrado na fig 4B, diversos vasos sangüíneos estão presentes também no interior do nódulo, que abrange, de acordo com análise preliminar cerca de 3% do seu volume. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Imagem 3D de nódulos de câncer que cresce em um ratopulmão. Um instantâneo da prestação volume (A) e uma seção através do volume (B) são mostrados. Os nódulos de câncer são marcadas com setas. Filme 1. Renderização Volume do fêmur do rato na Figura 1. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">Clique aqui para assistir o filme.</a> Filme 2. Renderização de volume dos pulmões de ratos na Figura 2. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">Clique aqui para assistir o filme.</a> Filme 3. Seções Serial através dos pulmões. Os nódulos aparecem como áreas cinzentas na maioria das fatias. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">Clique aqui para assistir o filme.</a>

<ol>
	<li>Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+micro-CT+in+small+animal+imaging.">Application of micro-CT in small animal imaging.</a> Methods. 50, 2-13 (2010).</li><li>Bauer, J. S., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoporosis+imaging.">Advances in osteoporosis imaging.</a> Eur J Radiol. 71, 440-449 (2009).</li><li>Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+insight+bone+measurements+by+histomorphometry+and+microCT.">Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT.</a> J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).</li><li>Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+human+bone+biopsies:+a+quantitative+structural+comparison+of+histological+sections+and+micro-computed+tomography.">Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography.</a> Bone. 23, 59-66 (1998).</li><li>Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Aliased+3D+Cone-Beam+Reconstruction+Of+Low-Contrast+Objects+With+Algebraic+Methods.">Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).</li><li>Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+single-slice+rebinning+in+cone-beam+spiral+CT.">Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT.</a> Med Phys. 27, 754-772 (2000).</li><li>Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination-weighted+Feldkamp-based+reconstruction+algorithm+for+cone-beam+CT.">A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT.</a> Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).</li><li>Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging.">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med Phys. 31, 305-313 (2004).</li><li>Plourabou&#233;, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+high-resolution+vascular+network+imaging.">X-ray high-resolution vascular network imaging.</a> J Microsc. 215, 139-148 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

C57/Bl6 mouse no dia embrionário 18.5 (E18.5) é de quatro dias após o início do processo de mineralização. Nesta fase de desenvolvimento, o osso futuro é feito de muitas camadas de osteóide mineralizado, claramente visto na Fig. 3. Neste ponto, deve-se ressaltar que tecidos mineralizados pode ser visualizado na resolução mais baixa com instrumentos diferentes, que exigem um tratamento menos amostra. O presente protocolo (e as micro instrumento CT usado nele) além de proporcionar maior resolução, oferece a máxima flexibilidade para o usuário a escolher os melhores parâmetros geométricos para a medição. Resultados na Fig. 4 mostram que, no pulmão ortotópico modelos animais de câncer humano, câncer de pulmão não pequenas células podem induzir o recrutamento de vasos sanguíneos e neovascularização. Consideramos que o tecido pulmonar não era nem se movia, nem tem sua forma alterada durante a medição. O usuário deve tomar precauções especiais para evitar tais mudanças durante uma tomografia. Para algumas amostras, especialmente para os tecidos mais moles, um tem de construir aparelhos especiais de holding que imobilizam perfeitamente a amostra durante a medição. Infelizmente, a presença de vazamentos elevados de agente de contraste nas imediações dos tumores impedido quantificação confiável dos vasos sanguíneos periféricos. Como resultado as imagens estão contaminados por algum agente de coloração especialmente nas bordas, que está claramente presente nos filmes 2 e 3. Nós não poderíamos evitar esse vazamento, mas as informações úteis sobre os nódulos de câncer, incluindo seu tamanho, forma e presença de vasos sanguíneos internos não foi afetada. Poderíamos concluir claramente que, pelo menos, para a circulação brônquica, que foi aqui estudado, a oferta de sangue periférico participa de perfusão do tumor, com cerca de perfusão presente também no interior do tumor.

Para aquisição de imagem nós usamos uma MICRO XCT-400 microfocussed X-ray sistema de tomografia produzido por Xradia, Concord, EUA. As imagens foram processados ​​e analisados ​​utilizando ImageJ (NIH, EUA), Avizo (VSG, França) e MicroView (General Electric, EUA) pacotes de software. Qualquer software de análise disponíveis imagem pode ser usada em vez

high resolution 3d imaging of ex-vivo biological samples by micro ct

Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia computadorizada micro (μCT). De alta resolução μCT é muito versátil e preciso técnica (1-2 mícrons de resolução) para exame em 3D de ex-vivo amostras biológicas 1, 2. Em oposição a tomografia eletrônica, o μCT permite o exame de até quatro centímetros de espessura amostras. Esta técnica requer horas apenas algumas das medidas em relação a semana em histologia. Além disso, μCT não depende de modelos 2D estereológico, portanto, podem complementar e, em alguns casos podem até mesmo substituir métodos histológicos 3, 4, que são tanto demorado e destrutivo. Condicionamento de amostras e posicionamento em μCT é simples e não requer alto vácuo ou baixas temperaturas, que pode afetar adversamente a estrutura. A amostra é posicionada e rotação de 180 ° ou 360 ° entre um microfocused fonte de raios-x e um detector, que inclui um cintilador e uma câmera CCD preciso, Para cada ângulo de uma imagem 2D é levado, em seguida, todo o volume é reconstruído usando uma dos algoritmos diferentes disponíveis 5-7. A resolução 3D aumenta com a diminuição do passo de rotação. O protocolo de vídeo atual mostra os principais passos na imobilização de preparação, e posicionamento da amostra seguido por imagem em alta resolução.

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia micro computadorizada (TC).

Imagens de alta resolução em 3D de Ex-Vivo Amostras Biológicas por Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

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Research

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

18.6K visualizações.  Weizmann Institute of Science. Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia micro computadorizada (TC).

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

De alta resolução de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imagem

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Bioengenharia

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-partículas Velocimetry Imagem para a velocidade Medidas de fluxos de sangue Micro Perfil

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imagem de tecidos biológicos por dessorção ionização electrospray Espectrometria de Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Posicionamento adequado e a contenção de um membro posterior de ratos para concentrado de alta resolução de imagem de osso usando Microarquitetura na Vivo Microtomografia computadorizada

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Imagens 3D de alta resolução da rede Neuro-insular pâncreas humano

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Imagem latente de alta resolução da dinâmica nuclear em pilhas vivos a tensão elástica uniaxial

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...