Com o TRAP-seq, podemos isolar o RNA de tipos de células específicas, como os hepatócitos repovoando no fígado ferido para analisar as mudanças de expressão genética que ocorrem nessas células. Não requer nenhuma medida para remover células indesejadas do tecido. O RNA específico do tipo celular é isolado pela purificação de afinidade de órgãos inteiros.
Essa técnica nos ajuda a determinar como células específicas respondem a lesões, o que poderia ajudar a identificar novas estratégias ou drogas para combater doenças hepáticas. Isso pode ser usado para identificar como as células hepáticas respondem a diferentes tipos de lesões hepáticas. Atualmente, existem poucas opções para lesões hepáticas agudas graves e este método ajudará a nos levar a novos tratamentos.
Este método se originou no cérebro. No fígado, imaginamos que poderia ser usado para examinar mudanças dinâmicas em uma variedade de tipos celulares, hepatócitos, células do ducto biliar, células kupffer e células endoteliais para citar alguns. Demonstrando o procedimento será Amber Wang, uma estudante de pós-graduação e minha mentee.
Para começar, resuspend contas magnéticas por tubulação suave. Colete as contas em uma posição magnética por mais de um minuto e remova o supernatante. Em seguida, remova o tubo de microcentrifuge do suporte magnético e adicione um mililitro de PBS, seguido de pipetação para cima e para baixo para lavar as contas.
Coloque o tubo de volta no suporte magnético por mais de um minuto para coletar as contas e remover o PBS. Para preparar contas revestidas de proteína l, adicione 16 microliters de proteína biotinilada L às contas magnéticas resuspended e lavadas e adicione 1X PBS para fazer o volume final um mililitro, se usar um tubo de microcentrífustração de 1,5 mililitro, ou 1,5 mililitros, se usar um tubo de microcentrítrida de dois mililitros. Incubar as contas magnéticas com proteína biotinilada L por 35 minutos à temperatura ambiente em um rotador de tubo.
Em seguida, coloque o tubo no suporte magnético por mais de um minuto e remova o supernascido para coletar as contas revestidas de proteína L. Remova o tubo de microcentrifuge do suporte magnético e adicione um mililitro de PBS com tampão BSA de 3%, seguido de tubulação suave pelo menos cinco vezes para lavar as contas revestidas de proteína L. Novamente, coloque o tubo no suporte magnético por mais de um minuto e remova o sobrenatante para coletar as contas revestidas.
Repita a lavagem da BSA mais quatro vezes. Em seguida, adicione 50 microgramas de anticorpos para anticorpo GFP 19C8 e anticorpo GFP 19F7 cada um nas contas revestidas de proteína L, e incubar por uma hora a quatro graus Celsius em um rotador de tubo. Para coletar a matriz de afinidade, coloque o tubo no suporte magnético por mais de um minuto e remova o supernasal.
Retire o tubo do suporte magnético e adicione um mililitro de tampão de baixo sal. Cano suavemente para cima e para baixo para lavar a matriz de afinidade e repetir o tampão de baixo sal lavando mais duas vezes. Resuspenja as contas em 200 microliters de tampão de baixo sal, para fazer 200 microliters de matriz de afinidade.
Primeiro, configure o moedor de tecido para que os tubos de vidro PTFE possam ser colocados no gelo durante a homogeneização. Encha quatro mililitros de tampão de lise fria nos tubos de vidro PTFE. Coloque o fígado em uma placa de Petri.
Use uma faca para isolar de 200 a 500 miligramas de pedaços de fígado e mover-se para os tubos de vidro PTFE. Coloque o tecido hepático restante em um tubo de microcentrifuge pré-refrigerado e congele em nitrogênio líquido. Homogeneize as amostras em um homogeneizador motorizado, a partir de 300 rpm por pelo menos cinco traçados para dissociar hepatócitos da estrutura hepática.
Abaixe o tubo de vidro cada vez. Prevenir a aeração, que poderia causar desnaturação de proteínas, mantendo o pilão abaixo da solução. Em seguida, eleve a velocidade para 900 rpm para homogeneizar totalmente os tecidos hepáticos por pelo menos 12 golpes completos.
Transfira o lise em tubos rotulados e pré-refrigerados com não mais do que um mililitro de lise cada. Para iniciar a lise nuclear, centrifugar o fígado lysate a 2.000 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos, em seguida, transferir o supernascer para um novo tubo de microcentrifuuge pré-refrigerado no gelo. Adicione 1/9 do volume supernacido de 10%NP-40 no tubo de microcentrifuuge no gelo e misture a solução invertendo suavemente o tubo.
Gire rapidamente os tubos de microcentrifuuge com uma mini centrífuga e adicione 1/9 do volume amostral de 10%DOC. Misture invertendo suavemente os tubos de microcentrifuuagem e gire rapidamente os tubos de microcentrifuuge e incubar no gelo por cinco minutos. Centrifugar o lise nuclear a 20.000 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos e transferir o supernascer para novos tubos de microcentrifuuge pré-refrigerados no gelo.
Para cada tubo, tire 1% do volume total do supernante como controle pré-imunoprecipitação. Coloque os controles de pré-imunoprecipitação em um rotador de tubo a quatro graus Celsius durante a noite. Tome cuidado extra para resuspensar suavemente a matriz de afinidade por pipetação, em seguida, adicionar 200 microliters a cada amostra.
Incubar os lises a quatro graus Celsius durante a noite com mistura suave em um rotador de tubo. Para isolar o RNA, gire rapidamente os tubos contendo os lises na mini centrífuga e colete as contas colocando no rack magnético por pelo menos um minuto. Colete o supernatante em tubos de microcentrifuuagem adicionais.
Adicione um mililitro de tampão fresco de sal alto a cada tubo, seguido de tubos suaves pelo menos cinco vezes sem introduzir bolhas. Colete as contas no suporte magnético no gelo por mais de um minuto e remova o supernatante. Repita os passos de lavagem mais quatro vezes.
Em seguida, remova os tubos de microcentrifuuagem do suporte magnético e coloque em temperatura ambiente por cinco minutos para aquecer. Resuspenja as contas em 100 microliters de tampão de lise com 0,7 microliters de beta-mercaptoetanol para liberar RNA vinculado da matriz de afinidade. Vórtice os tubos por pelo menos cinco segundos na velocidade mais alta e rapidamente giram para baixo.
Em seguida, incubar os tubos em temperatura ambiente por 10 minutos. Coloque os tubos no suporte magnético por pelo menos um minuto, depois colete o supernasce e prossiga imediatamente para a limpeza do RNA de acordo com o protocolo de purificação do RNA no kit. Para alcançar a máxima qualidade do RNA isolado, execute todas as etapas opcionais, incluindo digestão DNase e todas as etapas de elução de RNA, incluindo o pré-aquecimento recomendado do tampão de elução a 60 graus Celsius.
Neste estudo, a fusão GFP-L10A e os transgenes Fah foram co-entregues dentro de um vetor de armadilha plasmida contendo transposon para fígados por injeção hidrodinâmica. A remoção de nitisina induziu uma lesão hepática tóxica. A coloração da imunofluorescência confirmou a coexpressão da proteína de fusão FAH e GFP-L10A e dos hepatócitos repovoantes após duas semanas de repopulação hepática.
A amostra quiescente produziu o maior rendimento de proteína de fusão, uma vez que todos os hepatócitos expressam GFP-L10A após a injeção de AAV8-TBG-Cre. Por outro lado, quase nenhum RNA era detectável em controles do tipo selvagem que não tinham o transgene GFP-L10A, indicando que o procedimento TRAP é altamente específico e tem um baixo fundo. Quando o TRAP foi usado em tecido hepático submetido à repopulação com hepatócitos transduzidos GFP-L10A, obteve-se RNA abundante de alta qualidade.
Em contraste, nenhum traço de RNA foi detectado via Bioanalyzer para a amostra de controle negativo. A expressão gsta1 foi induzida por mais de dez vezes em hepatócitos repovoantes em comparação com hepatócitos quiescentes, enquanto nenhum valor de ciclo limiar foi detectado com RNA isolado trap do rato tipo selvagem devido à falta de RNA de entrada. Ao homogeneizar o tecido, certifique-se de mover o pilão lentamente para evitar a aeração.
Após isolar o RNA, o sequenciamento de alta throughput ou qPCR pode ser realizado para analisar a expressão genética. Com o TRAP-seq, agora temos um método para isolar especificamente o RNA de hepatócitos repovoantes e analisar a mudança na expressão genética durante a repopulação hepática. Isso nos permite identificar genes que são alterados durante esse processo e potenciais alvos terapêuticos para o tratamento de lesões hepáticas.
Cicloheximida e DTT, que estão presentes em vários buffers, são ambos tóxicos. Os resíduos devem ser coletados e descartados de acordo com as diretrizes institucionais.
