Agradecemos aos nossos colegas do Departamento de Biologia, Universidade de Fribourg para discussões proveitosas. Agradecemos ao Bloomington Banco Central para fornecer estoques de voar. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Swiss National Science Foundation (PP00P3_123339) ea Fundação Velux para SGS

1. Larvicultura <ol><li> Mantenha voar estirpes ou cruzamentos genéticos na cultura de massa a 25 ° C em meio a farinha de milho em uma hora de luz 12 ciclo de 12 horas de escuro em uma mosca incubadora equipado com luz e timer. </li><li> Diluir Backer levedura em água para formar uma pasta fluida (10 g de levedura Backer diluída com 3-4 ml de H2O destilada). Adicione uma pequena queda para o milho refeição e cobrir os frascos. Deixar secar durante pelo menos uma hora, para evitar moscas adultas adere à pasta de levedura. Colocar uma pequena gota de levedura diluída em água sobre a superfície do alimento pode melhorar a oviposição. Alternativamente pasta de levedura de panificação, ácido acético a 20% (AcOH) (Sigma Aldrich, Suiça A6283-100ml) pode ser usado. Para isso, molhar a ponta de um Q-tip na solução e espalhe sobre a superfície da refeição de milho. </li><li> Coloque moscas adultas (pelo menos quatro dias de idade, mas não mais do que 10 dias), em farelo de frascos de alimentos. Coloque adultos suficientes para cada frasco, a fim de obter larvas suficiente para repetir a preferênciatestar várias vezes e permitir a comparação estatística. Para cruzamentos genéticos, que normalmente usam um mínimo de 20 fêmeas e machos 5-10 por frasco, mas algumas linhas precisam de mais fêmeas para obter uma prole larval suficiente. </li><li> Permitem que os adultos põem ovos para 12 horas e transferi-los para novos frascos. Os adultos podem ser transferidas, de manhã e à noite. Costumamos transferir adultos por sete a dez dias e se necessário tomar novas adultos. </li><li> Manter as colecções de ovo tomadas cada 12 horas na incubadora e deixar crescer as larvas a 25 ° C, 12 horas de ciclo claro-escuro de 12 horas e 60% de humidade. Para testar componentes circadianos de movimento larvas visuais comportamento à escuridão constante (DD) 48 horas após a coleta de ovos (correspondente a dois ciclos claro-escuro). Para isso, use uma incubadora separado, sem luz, mas manter todas as outras condições, tais como temperatura e umidade idênticos. Certifique-se de transferir os frascos para o DD incubadora pouco antes da mudança para a fase escura. Antes de mover os frascos another incubadora colocar os frascos em uma caixa de papelão ou embrulhar os frascos com papel alumínio para evitar a exposição à luz durante a transferência (embalagem em caixa de papelão ou embalagem tem que ser feito durante o &quot;apagar as luzes da fase&quot; antes da mudança entre incubadoras). Impedir que os animais de qualquer exposição à luz após este ponto e até experimentos início. </li><li> Após 4 dias (84-108 hr de postura de ovos) recolher cedo L3 (larvas de alimentação) nos pontos de tempo para serem testados (ver 4. Luz preferência teste, ponto. 4.4.). </li></ol> 2. Test Setup <ol><li> Realizar experiências em um quarto escuro, com temperatura constante e umidade. </li><li> Para manter dois quadrantes da placa de Petri em trevas, cobrir a tampa com fita preta e folha de alumínio. A fim de fazer isso, marcar o centro da circunferência da tampa. Mark também quatro pontos na borda da tampa, com 90 ° de separação entre eles. Para torná-lo mais fácil, desenhar um quadrado 20 centímetros dividido em quatro quadrantes, de 10 cm de comprimento em umfolha de papel ou com a ajuda de um computador. Corte de 10 centímetros quadrados de papel de alumínio e uma fita preta (Figura 1A). Cubra dois quadrantes opostos colando um quadrado de papel alumínio, como primeira camada e fita preta cobrindo-o, tenha cuidado para também cobrir a borda da tampa. No passado foram usadas duas formas ligeiramente diferentes desta ensaios. Nós, aqui utilizar o ensaio &quot;quarter-placa&quot;, em que a placa de Petri é dividido em quatro partes iguais de 10. Em alternativa o ensaio de &quot;meia-placa&quot;, a placa de Petri é dividido metade (metade exposto à luz, em meia escuro) 1,7,8. Até hoje não há diferenças significativas entre os dois testes foi publicada. </li><li> Cola uma folha de quadrante, como a utilizada para a marcação das tampas direito sob a fonte de luz sobre a mesa. Marque a circunferência de uma placa de Petri centrada na intersecção quadrantes. Use as marcas de referência para colocar a placa de teste sempre na mesma posição, sob a fonte de luz. </li><li> Instale umlâmpada, ou uma simples lâmpada de luz branca (Phillips, Softtone 5W) ou uma lâmpada de LED (lâmpadas LED, 80012 Branco, Osram) acima da placa de Petri com a ajuda de um carrinho suporte de ferro (Fisher Scientific, S47808). Ajustar a altura de uma forma que toda a chapa de teste é iluminado de forma homogénea. Recomendamos o uso de lâmpadas LED, uma vez que emitem comprimentos de onda mais específicas do que as lâmpadas convencionais. Além disso, LEDs emitem menos calor. </li><li> Ajustar a intensidade da luz com a ajuda de um fotômetro (Ambiente Medidor PCE EM882). Para alcançar a intensidade da luz necessária de 350-760 lux, mover a lâmpada para cima ou para baixo, conforme necessário. Ligar a lâmpada de uma fonte de alimentação ajustável dá mais flexibilidade para mudar as intensidades, sem mover a lâmpada (Figura 1B). </li></ol> 3. Placas de Preparação <ol><li> Adicione 200 ml de 2,5% de agar (Sigma-Aldrich, Suiça A5093-500G), com água bi-destilada (Millipore). </li><li> Coloque placas de Petri sobre uma mesa (90 mm de diâmetro;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Áustria) em linhas para permitir derramar quente agarose. </li><li> Ferver a agarose em um forno de microondas até que a solução é completamente transparente e de fluido. Certifique-se de que a solução líquida não contém bolhas. ATENÇÃO: Transporte cuidadosamente a tabela já que a solução pode ser muito quente! </li><li> Verter a quente de agarose em placas de Petri até que toda a superfície seja homogeneamente coberto com uma fina camada da solução, cerca de dois ou três milímetros são suficientes. Seja rápido para evitar agarose solidificar antes de todas as placas de revestimento. Deixe as placas esfriar. Armazenar as placas à temperatura ambiente, e utilizá-los apenas no mesmo dia da preparação. </li></ol> 4. Luz teste de preferência <ol><li> O trabalho sob condições de luz vermelha na sala de ensaio para evitar a influência de luz antes do ensaio, uma vez Drosophila não é capaz de detectar a luz de comprimentos de onda vermelhos. Use uma lâmpada vermelha (Phillips, PFE712E * 8) montado em uma lâmpada para iluminar tele Place to Work. </li><li> Manter a temperatura por meio de todas as experiências a 25 ° C. Temperatura ambiente de controle por meio de um dispositivo de aquecimento ou arrefecimento, se necessário. </li><li> Tome um pouco de comida dos frascos criados para ciclos de dois dias sob constante escuridão (na seção 1). Uma vez que as larvas são geralmente de escavação na superfície da comida, tomar a camada superior (cerca de 5 mm de profundidade) com a ajuda de uma espátula (Fisher Scientific, 14-373-25A). Espalhar a comida no lado exterior de uma tampa da caixa de Petri, adicionar um pouco de água e misturar cuidadosamente com uma espátula. </li><li> Colete alimentando larvas L3 do alimento. Como preferência luz vai ser testado, escolhendo apenas no início / alimentação das larvas L3 é crucial, pois o phototaxis negativa está garantida. Tarde / vagando larvas L3 ou grande larva rastejando sobre a comida provavelmente já mudaram seu photobehavior. Alimentando larvas L3 (fototáxico negativo) pode ser reconhecida porque seus espiráculos anteriores estão abertas e se projetava para o exterior de forma finger-like. O espiráculo posteriors têm três aberturas de cada um, e quatro grupos de grandes pêlos ramificados. As glândulas salivares estender-se ao segundo segmento abdominal 11. Estadiamento larva sob um microscópio é conveniente, ao passo que a luz branca não devem ser usados. Uma lâmpada de luz vermelha é necessária para iluminar as larvas se encenar sob microscópio estereoscópico antes dos experimentos é necessária. </li><li> Lave as larvas brevemente em água corrente e recolher cedo alimentando larvas de terceiro instar (ainda na luz vermelha). Antes de transferir as larvas na placa de teste, tomar as larvas com um pincel molhado e absorver cuidadosamente o excesso de água com uma toalha de papel ou papel-filtro. Não seque as larvas também excessivamente, pois pode prejudicar o animal e influenciar o seu comportamento. </li><li> Usando o pincel molhado transferir cuidadosamente as larvas de placas. Coloque um grupo de cerca de 30 larvas no centro do prato. Cobrir a placa com a tampa já preparada com os quadrantes e colocou o prato com a fonte de luz pronto para a experiência (ver secção 2). </li><li> Ligue a lâmpada de luz branca e iniciar o temporizador. Deixe a larva mover-se livremente sobre a placa durante 5 minutos, em seguida, rapidamente remover a tampa e contar o número de larvas no escuro e nos quadrantes de luz. Marcação da posição de cada larva com um marcador pode facilitar a contagem. Alternativamente tirar uma foto da placa e contar a posteriori. Larvas de luz de uma preferência clara, como larvas rastejar nas paredes ou enterrando-ágar devem ser considerados como preferências neutro e apenas ser incluídos no número total de larvas, quando o índice de preferência luz é calculado. </li><li> Após a contagem, rejeitar a placa com larvas e substitua por uma nova placa de teste para o seguinte experimento. Colete placas usadas em um saco plástico autoclave para o tratamento e despejo posterior. </li><li> Depois de ter realizado um número suficiente de experimentos de um novo genótipo podem ser testados. 10-15 ensaios por genótipo são suficientes para análise. </li></ol> 5. Dados Analysis <ol><li> Por conveniência transferir os dados para uma folha de dados como o Excel (Microsoft) ou de origem (origem Lab) em um computador para análise estatística. Dispor em uma coluna o número de animais no escuro, numa segunda coluna o número de animais nos quadrantes de luz e no terceiro o total de animais na placa (incluindo larvas &quot;neutro&quot;). </li><li> Calcular o índice de preferência (PREF) para a escuridão para cada experiência com a seguinte fórmula: PREF (escuridão) = (número de larvas no escuro - número de larvas na luz) / número total de larvas </li><li> Comparar estatisticamente um conjunto de dados com uma análise apropriada para grupos. Aqui, usamos um teste de Wilcoxon para comparar estatisticamente dois grupos. Um teste de ANOVA com-comparação múltipla de Tukey post hoc teste pode ser feito, se o pressuposto de distribuição normal é cumprida em uma comparação grupo distribuidor. </li><li> Adicione gráficos que mostram claramente as comparações entre as linhas e pontos de tempo ao longo do ciclo de dia. We uso do software Origin (Origin Lab) para testar a significância estatística e gerar gráficos apropriados, mas qualquer outro software de estatística pode ser útil. </li></ol>

<ol>
	<li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).</li><li>Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+and+larval+photoreceptors+use+different+mechanisms+to+specify+the+same+Rhodopsin+fates.">Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates.</a> Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons.">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454, 533-537 (2008).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Diaz, N. N., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors:+unconventional+ways+of+seeing.">Photoreceptors: unconventional ways of seeing.</a> Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).</li><li>Emery, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+CRY+is+a+deep+brain+circadian+photoreceptor.">Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor.</a> Neuron. 26, 493-504 (2000).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293-300 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).</li><li>Gong, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Pairs+of+Neurons+in+the+Central+Brain+Control+Drosophila+Innate+Light+Preference.">Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference.</a> Science. 330, 499-502 (2010).</li><li>Lilly, M., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smellblind:+a+gene+required+for+Drosophila+olfaction.">smellblind: a gene required for Drosophila olfaction.</a> Genetics. 124, 293-302 (1990).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Pittendrigh, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+systems:+Entrainment.">Circadian systems: Entrainment.</a> Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, 95-124 (1981).</li><li>Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+Activity+between+LN(v)s+and+Glutamatergic+Dorsal+Clock+Neurons+Promotes+Robust+Circadian+Rhythms+in+Drosophila.">Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila.</a> Neuron. 74, 706-718 (2012).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).</li><li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae.">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O teste de preferência light descrito aproveita o photobehavior inata larval. O ensaio é fácil de estabelecer, permite que muitas repetições com baixo custo e oferece informações valiosas sobre detecção de luz e de processamento. O paradigma experimental permite a quantificação relativamente rápido de quantas pessoas preferem clara ou escura. Essa preferência pode ser exibido como percentagens brutas ou, alternativamente, como Índice de Preferência (PREF). O PREF é expressa como a diferença entre os ani...

Aqui nós descrevemos um ensaio comportamental com base na preferência larval para escuro (ou luz). Larvas reagir com uma resposta fotonegativo forte e estereotipados durante os estágios de forrageio (L1 até o início L3) 1. O ensaio é destinado a avaliar o comportamento photophobic da larva e compara o claro ou escuro preferência de um grupo de larvas de mover-se livremente em uma placa de Petri revestidas com ágar. Este ensaio comportamental não só fornece informações sobre a sensibilidade, a integração temporal e plasticidade do sistema visual, proporciona ainda dicas sobre como sensibilidade à luz e ao seu processo é controlado pelo sistema circadiano. A Drosophila olho larval (também denominado Órgão Bowlig; BO), é o principal órgão de percepção luminosa. Cada olho é composto de 12 fotorreceptores (PR), oito PRs expressar a rhodopsin6 verde-sensível (RH6) e quatro PRs expressar a rhodopsin5 blue-sensível (RH5) 2,3. Além de PRs, alsÔ classe IV neurônios multidendritic, que cobrem a parede do corpo larval, foram identificados para responder a intensidades de luz nocivos 4,5. Sabe-se também que os neurónios do pacemaker situados no centro do cérebro larval expressar a proteína sensível à luz criptocromo (Cry), que age como relógio sensor de luz azul intrínseca dentro do cérebro 6,7. Curiosamente photophobicity de animais de tipo selvagem mostra um componente circadiano em diferentes pontos de tempo durante o decurso do dia e da noite, quando um teste com este ensaio. Respostas a luz de forrageamento larva L3 mostrou photophobicity forte na madrugada e inferior photophobicity ao entardecer, quando testado para a preferência claro-escuro 7. Curiosamente só RH5-PRs são necessários para evitar a luz, enquanto RH6-PRs são dispensáveis. Ambos, RH5-PRs e RH6-PRs estão envolvidos em como acertar o relógio molecular pela luz 8. O caminho Cry deve ser coordenada com as outras vias de luz sensores de orquestrar uma saída de comportamento apropriado nodecorrer do dia. A acetilcolina em RP desempenha um papel essencial no comportamento de evasão luz, bem como o arrastamento do relógio molecular. Bloqueio de neurotransmissão acetilcolina dos PRs aos neurônios marcapasso circadiano reduz a resposta photophobic no ensaio de preferência light-escuridão 8. Utilizando o mesmo ensaio, os dois pares simétricos de neurónios foram recentemente identificados para exibir a preferência luz do terceiro instar de larvas de Drosophila 9. Esses dois pares de neurônios pode estar funcionando durante a fase larval final, quando os animais deixam a comida para encontrar provavelmente um site pupariation apropriado. No entanto, a questão de como as vias visuais interagir e controlar o comportamento visual de uma forma larval circadiano permanece praticamente sem resposta. O ensaio de preferência light permite comparações entre os momentos circadianos, voar linhas e estaduais circadiano sob diferentes qualidades de luz. O ensaio é barato e facilmente preparado e tem sido útil anteriormente in vários laboratórios para descrever e estudar a luz comportamento derivado da larva.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5093-500G</td><td>2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland </td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td>90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria</td></tr><tr><td>LEDs Lamp</td><td>OSARAM</td><td>80012 White</td><td>LED lamp, 80012 White</td></tr><tr><td>Environment Meter</td><td>PCE</td><td>PCE EM882</td><td>Lux, Temp, RH%</td></tr><tr><td>Thermostatic cabinet</td><td>Aqua Lytic (Liebherr)</td><td>ET636-6</td><td></td></tr><tr><td>Light timer</td><td>Timer T</td><td>6185.104</td><td>230V/50HZ (check specifications for your country)</td></tr><tr><td>Universal thermostat</td><td>Conrad</td><td>UT200</td><td></td></tr><tr><td>Humidifier</td><td>Boneco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balck tape</td><td>Tesa</td><td></td><td>5 cm </td></tr><tr><td>Glue</td><td>Uhu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lncubator lamp</td><td>Phillips</td><td>Softtone</td><td>5W</td></tr><tr><td>Timer clock</td><td>Ziliss</td><td></td><td>Ziliss, Switzerland</td></tr><tr><td>Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Excel</td></tr><tr><td>Origin Software 8.5</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Backer Yeast</td><td>Migros Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iron support stand 17X28CM</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47808</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283-100ML</td><td>20% acetic acid dilluted in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Red light lamp</td><td>Phillips</td><td>PFE712E*8C</td><td></td></tr><tr><td>Spatula </td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>EA</td><td>EA PS 2042-06B</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td>Prix Coop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heater</td><td>GOON</td><td>NSB200C</td><td></td></tr><tr><td>Microwave Oven</td><td>Intertronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard corn meal fly food</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Destilled water </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in drosophila larvae

Atos de luz como sinal ambiental para controlar o comportamento de animais em vários níveis. O sistema nervoso Drosophila larval é usado como um modelo único para responder a perguntas básicas sobre como informação de luz é processada e compartilhada entre os comportamentos rápidos e circadiano. Larvas Drosophila exibir um comportamento de evitação estereotipada quando expostos à luz. Para investigar comportamentos dependentes leves testes comparativamente simples de preferência claro-escuro podem ser aplicadas. Em vertebrados e artrópodes as vias neurais envolvidos na percepção e processamento de informações visuais se sobrepõem parcialmente com os de processamento de informações circadiano photic. A questão fascinante de como o sistema de detecção de luz e o sistema circadiano interagem para manter as saídas de comportamento coordenado permanece largamente inexplorado. Drosophila é um modelo de impacto biológico para abordar estas questões, devido a um pequeno número de neurónios no cérebro e na disponibilidade de ferramentas genéticas para manipul neuronalração. O ensaio de preferência claro-escuro apresentado permite a investigação de uma série de comportamentos visuais, incluindo controle circadiano da phototaxis.

Seguindo o protocolo descrito acima, foi testada preferência claro-escuro no terceiro estádio larvar precoce do tipo selvagem Canton-S opera em dois tempos diferentes e circadianos CT0 CT12. Os adultos foram criados 12 horas de luz de 12 horas escuro e deixou de botar ovos de 12 horas. As larvas crescem os primeiros dois dias no mesmo regime de luz-escuro. Uma vez que nós quisemos testar modulação circadiano em condições constantes (de funcionamento livre do relógio circadiano), as larvas foram então transferid...

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Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Aqui nós descrevemos um teste de preferência claro-escuro para Drosophila larva. Este ensaio fornece informações sobre regulação inata e circadiano da luz de sensoriamento e processamento photobehavior.

Luz Ensaio Preferências para estudar inata e circadiano Photobehavior Regulamentado<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

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Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e sono Parâmetros em Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Neurociência

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but effective method to observe and document the behavior or morphology of flies. Flies were placed in a translucent observation chamber c.a. &#216;15 x 5mm (no food inside) or &#216;15 x 12 mm (with an 8 mm-high piece of food inside). After covering with an ultraviolet (UV)/clear filter with high light transmittance, the chamber was placed under a 5-50x zoom stereo microscope, and mini light-emitting diode (LED) video lights were placed on both sides of the microscope to illuminate the chamber to obtain uniform, soft, bright, and nearly shadow-free light. Then, a compact digital camera with 3-5x optical zoom, which can record 1080 P high-definition or higher resolution video (at a frame rate of &#8805;30 fps), was connected to the eyepiece of microscope through a bracket, and photographs or videos were taken through the eyepiece. By adjusting the zoom knob of the zoom stereo microscope, it was very easy to track the flies and take panoramic or detailed close-up images as needed, while the camera recorded everything under the microscope. Because the flies can stay at any position in the chamber, they can be observed and recorded from all directions. The photographs or videos taken are of good image quality. This method can be used both for scientific research and teaching.

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

This protocol describes how to make a simple adult Drosophila behavior observation chamber, and how to take high-definition photographs/videos of the morphology or behavior of different types of fruit flies in the observation chamber through relatively simple and affordable methods.

Um sistema de imagem de alta definição ajustável para estudos comportamentais de adultos drosophila

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but ...

Comportamento

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Biologia

Analysis of Circadian Photoresponses in Drosophila Using Locomotor Activity

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant environmental parameters that synchronize animal circadian clocks. In Drosophila circadian photo-responses are mediated by a solely blue light photoreceptor named CRYPTOCHROME (CRY). Upon photoreception, CRY changes its conformation and initiates the proteosomal dependent degradation of TIMELESS (TIM). TIM is an important pacemaker protein, thus degradation of TIM will reset the circadian clock. Under constant light conditions (LL), wild type flies quickly become arrhythmic because of the constant degradation of TIM, while flies bearing defects with circadian photo-responses will still be rhythmic. Thus LL triggered arrhythmicity has been used for screening of components in circadian light input pathways. A brief short light pulse in the night can also dramatically shift phases of circadian rhythms. As expected, this phase shift response is reduced in flied with defects in circadian photoresponse. Thus analyzing locomotion behavior rhythmicity under LL or phase changes after short light pulse in constant darkness (DD) are two major methods to study circadian photoresponse. Here we describe how to design and analyze LL and phase response experiments. LL arrhythmicity is suitable for screening light input pathways mutants, whereas phase response validates the results and provide further information for light sensitivity.

Drosophila locomotor activity is a robust and quantitative measurement of circadian photo-responses. We describe protocols for designing behavior experiments for circadian photo-responses and analyzing the data. Studying the circadian photo-responses is important for dissecting the neuronal and molecular mechanisms of light entrainment.

Circadian rhythms are only beneficial to animals if they can be synchronized by changes of ambient conditions. Light and temperature are two dominant ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Ensaio Light Spot-Based para análise de Drosophila larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Behavioral Assays for Optogenetic Manipulation of Neural Circuits in Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study introduces easy-to-implement setups for applying optogenetic methods in Drosophila melanogaster. Two optogenetic tools, CsChrimson, a red-light-activated cation channel, and GtACR2, a blue-light-activated anion channel, were employed in four experimental approaches. Three of these approaches involve single-fly experiments: (1) a blue-light optogenetic thermotactic positional preference assay targeting temperature-sensitive heating cells, (2) a red-light optogenetic positional preference assay activating bitter sensing neurons, and (3) a proboscis extension response assay activating the sweet-sensing neurons. The fourth approach (4) is a fly maze setup to assess avoidance behaviors using multiple flies. The ability to manipulate neural activity temporally and spatially offers powerful insights into sensory processing and decision-making, underscoring the potential of optogenetics to advance our knowledge of neural function. These methods provide an accessible and robust framework for future research in neuroscience to enhance the understanding of specific neural pathways and their behavioral outcomes.

This paper presents methods for optogenetic manipulation in Drosophila melanogaster, utilizing CsChrimson and GtACR2 to activate and silence specific neurons. Four experiments are described to utilize optogenetics to explore thermotactic and gustatory behaviors, providing insights into the underlying neural mechanisms governing these processes.

Ensaios Comportamentais para Manipulação Optogenética de Circuitos Neurais em Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study ...

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this rhythm and to understand the resulting outputs, entrainment of model organisms to defined circadian time-points is required. Here we detail a procedure to entrain many Drosophila to a defined circadian rhythm. Furthermore, we detail post-entrainment steps to prepare samples for immunofluorescence, nucleic acid, or protein extraction-based analysis.

Here, we detail how to synchronize Drosophila to a circadian day. This is the first, and most important step necessary for studying biological rhythms and chronobiology.

Circadiano De Drosophila Melanogaster

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

Light Spot Assay: A Method to Investigate Drosophila Phototactic Behavior

Source: Sun, Y., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60235/" target="_blank">Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis</a>. J. Vis. Exp. (2019).
Drosophila larvae are light-sensitive and respond to changes in surrounding light. This video describes an assay that tests their ability to avoid light, called the light spot assay. The featured protocol demonstrates how to set up the assay with a blue light LED and shows how to record the animal&#39;s behavior in response to the light encounter.

Ensaio de ponto de luz: um método para investigar o comportamento fototático da Drosophila

Source: Sun, Y., et al. Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis. J. Vis. Exp. (2019).
Drosophila larvae are light-sensitive ...

Luz Ensaio Preferências para estudar inata e circadiano Photobehavior Regulamentado

Resumo

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Assaying atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e sono Parâmetros em Drosophila