Sincronizar drosophila para definir tempos circadianos é o primeiro passo para estudar eventos que controlam ou respondem ao relógio biológico. A sincronização de todos os modelos seguirá a mesma abordagem básica. Há muitos passos para fazer isso prático e pode parecer esmagador colocá-los todos juntos.
Espere tentar algumas vezes antes que pareça natural. Mantenha as temperaturas estáveis e quero a luz acesa durante os três minutos. Prepare a comida de mosca em um Crock-Pot a 121 graus Celsius, misturando-se à medida que os ingredientes são adicionados.
Cubra o Crock-Pot e leve o conteúdo para ferver, misturando o conteúdo a cada 10 minutos. Depois de 20 minutos em uma fervura, desligue o fogo e adicione 83,6 mililitros de água ao Pote de Crock. Deixe a tampa fora enquanto a comida esfria.
Enquanto a comida estiver esfriando, mexa a cada 10 minutos para evitar permitir que um filme se forme por cima. Também meça a temperatura a cada 10 minutos com um termômetro de vidro. Uma vez que o alimento tenha esfriado para abaixo de 60 graus Celsius, adicione Tegosept e ácido propiônico, como descrito no manuscrito.
Misture bem e ajuste o Crock-Pot para manter uma temperatura, apenas alguns graus menos de 60 graus Celsius. Use uma bomba peristáltica para distribuir a comida de mosca. Para frascos estreitos, bombeie 10 mililitros, e para garrafas de fundo quadrados de seis onças, bombeie 60 mililitros.
Armazene moscas selvagens a 25 graus Celsius por 10 a 12 dias, até que aproximadamente 200 pupas estejam presas ao interior da garrafa. Para remover os adultos da garrafa, coloque-os em uma garrafa nova e use a extremidade maçante de um pincel número zero para empurrar todos os adultos restantes. Limpe o pincel com 70% de etanol antes e depois do uso.
Incubar a pupa a 25 graus Celsius para permitir que a próxima geração emerja. Depois de três dias, as moscas terão de zero a três dias de idade. Lembre-se que a temperatura, a luz e até mesmo a sua escolha de comida influenciarão a entrada.
Certifique-se de mantê-los, cada controle durante o seu experimento. Nos pontos de tempo designados para coleta, use uma almofada de anestesia de dióxido de carbono para imobilizar as moscas, e coletar 100 machos e 100 fêmeas. Moscas fêmeas são muito maiores que os machos.
As moscas também podem ser diferenciadas examinando a genitália. Os machos têm genitália arredondada escura, enquanto as fêmeas têm genitálias mais claras e pontiagudas. Coloque machos e fêmeas em frascos separados com 100 fêmeas por frasco e 50 machos por frasco.
As interações sociais masculinas levam a muitas mortes quando há 100 indivíduos em um frasco. Para permitir a entrada circadiana, coloque os frascos em incubadoras reguladas por luz por três a cinco dias. Para produzir moscas para futuras entranhas, coloque 25 das fêmeas restantes, e cinco a sete dos machos restantes em uma nova garrafa.
Incubar a garrafa a 25 graus Celsius. Para cada 100 moscas que serão coletadas. Prepare um frasco estreito adicionando 4,8 mililitros de fixação.
Coloque os frascos estreitos em um balde de gelo, e leve o balde, toalhas de papel, papel alumínio e fita adesiva para a incubadora. Para coletar as moscas, coloque um funil no frasco estreito, em seguida, remova a tampa do frasco de moscas e inverta-a rapidamente para o funil. Toque suavemente para ajudar a guiar as moscas para o frasco de fixação.
Ao coletar machos, combine dois frascos de 50 moscas em um frasco estreito. Enrole os frascos para ZT13 e ZT19 em papel alumínio. Depois de transferir as moscas, tape as tampas no lugar para evitar derramamento.
Coloque os frascos no Misturador de Nozes a 165 RPM, e quatro graus Celsius, durante quatro horas. As moscas não são mais sensíveis à luz, então, a folha pode ser removida para verificar se as moscas estão sendo submersas no fixador. Depois de remover os frascos do Misturador de Nozes, remova o formaldeído e depois lave as moscas três vezes com 3000 microliters de 1X PBS, invertendo o frasco durante cada lavagem.
Armazene os frascos a quatro graus Celsius, para aguardar futuras imunofluorescências. A luz e a escuridão eram usadas para entrar em moscas para ciclos circadianos. A entrada foi verificada por imunoblotação, e análise de imunofluorescência da proteína do período, um marcador para a entrada circadiana.
A imunoblotação de extratos celulares inteiros, preparados a partir de cabeças de moscas entratinadas, mostra um padrão canônico de mobilidade e intensidade de proteínas de período. A imunofluorescência de cérebros entranados, coletadas no ZT1, mostra proteínas de período em padrão característico. Este método é um ponto de partida para imunofluorescentes, imunoplotting, imunoprecipitação, análise comportamental, e qualquer outra técnica que você possa querer usar para comparar como o caminho muda à medida que o relógio biológico marca.
Com a capacidade de entrar no organismo modelo, você pode perguntar se seu caminho favorito muda ao longo do tempo, e se os efeitos em seu caminho favorito podem levar à interrupção do biológico. Uma série de doenças são agravadas quando o relógio biológico é interrompido. Identificar os mecanismos subjacentes nos ajudará a criar medicamentos mais eficazes para pessoas que sofrem de doenças, como Alzheimer e Mal de Parkinson.
