A colheita do meio condicionado enriquecido exossomo de células cultivadas em frascos bioreatores e isolamento por ultracentrifugação de almofada de sacarose resultam em preparação exosóica de alto rendimento com proteínas contaminantes mínimas ou vesículas não exosômicas. O uso de uma única almofada de sacarose preparada em óxido de deutério contorna a preparação laboriosa de um gradiente de sacarose descontínua e reduz a quantidade de sacarose necessária para alcançar a densidade necessária. A entrega in vitro eficaz do encapsulamento de siRNA em exosóis preparados neste protocolo destaca o potencial deste sistema como uma nova geração de terapia baseada em interferência de RNA para câncer de pâncreas.
Para começar, cultura HEK-293 células em meio normal, como descrito no manuscrito. Expanda as células em quatro frascos T75, e cresça até atingir 90% de confluência. Para preparar um frasco bioreator, adicione 50 a 100 mililitros de meio normal no reservatório médio do frasco bioreator para molhar a membrana.
Colete todas as células HEK-293 dos quatro frascos T75, e resuspenque-as em 15 mililitros de meio exosomos em um tubo de centrífuga. Em seguida, use uma seringa de 20 mililitros conectada a uma agulha de enchimento contundente para adicionar cuidadosamente esta suspensão celular ao compartimento celular do frasco bioreator. Em seguida, encha o reservatório médio do frasco bioreator com o meio normal, até 500 mililitros, e incuba-o a 37 graus Celsius, 5% de CO2 por uma semana.
Após uma semana de incubação, remova todo o meio do reservatório médio do frasco bioreator, despejando-o. Usando uma seringa de 20 mililitros conectada a uma agulha de enchimento sem corte, remova todo o meio do compartimento celular. Em seguida, adicione 50 a 100 mililitros de meio normal ao reservatório médio e 15 mililitros de meio exosome fresco esgotado ao compartimento celular usando uma seringa de 20 mililitros conectada a uma agulha de enchimento contundente.
Em seguida, encha o reservatório médio do frasco bioreator com meio normal até 500 mililitros. Incubar a 37 graus Celsius, 5% de CO2 por mais uma semana. Para pré-limpar o meio condicionado coletado, centrifuá-lo a 500 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Transfira o supernatante para um novo tubo, e descarte a pelota. Depois de repetir essa etapa de centrifugação com o supernante recuperado, recupere o sobrenante novamente e descarte a pelota. Em seguida, centrífugue o supernaente recuperado a 2.000 vezes g por 15 minutos e quatro graus Celsius.
Mantenha o supernatante, e descarte a pelota. Filtre o supernatante uma vez através de um filtro de 22 micrômetros ligado a uma seringa de 20 mililitros em um tubo de centrífuga fresco. Enquanto isso, para preparar uma solução de 25% de sacarose em óxido de deutério, pesar com precisão 1,9 gramas de sacarose em um tubo universal.
Em seguida, adicione óxido de deutério até que o peso atinja 7,6 gramas. Em seguida, encha um tubo de ultracentrifutura com 22,5 mililitros de meio condicionado pré-limpo. Coloque uma pipeta de vidro no tubo.
Adicione três mililitros de solução de sacarose através da pipeta para que a solução forme uma camada separada abaixo do meio condicionado. Coloque cuidadosamente o tubo contendo solução média/sacarose em camadas em camadas no balde de um rotor swing-out. Segure o balde no rotor.
Coloque o rotor no ultracentrifuuge e gire a 100.000 vezes g a quatro graus Celsius por 1,5 horas. Colete dois mililitros da camada de sacarose do tubo, um mililitro de cada vez usando uma pipeta P1000, com sua ponta presa a uma ponta de 10 microliteres, e adicione-a a uma garrafa ultracentrífa contendo 20 mililitros de PBS filtrado para lavagem. Coloque o tubo em um rotor de ângulo fixo e centrífugue a 100.000 vezes g a quatro graus Celsius por 1,5 horas.
Use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para remover cuidadosamente o supernatante. Resuspenja a pelota com 400 microliters de PBS filtrado. Antes de iniciar a eletroporação, pré-esfrie a cuvette de eletroporação no gelo por 30 minutos.
Misture sete microgramas de exosósmos com 33 microgramas de siRNA no tubo de microcentrifutura. Adicione o tampão de ácido cítrico para atingir o volume de 150 microliters. Adicione a mistura exossome-siRNA ao cuvette de eletroporação usando uma pipeta de plástico, e tampa a cuvette.
Coloque a cuvette na orientação certa no suporte de cuvette do eletroporador, e gire a roda giratória do eletroporador 180 graus no sentido horário. Selecione o programa desejado e pressione o botão Iniciar para iniciar a eletroporação. O visor indicará um pulso bem sucedido.
Em seguida, volte a roda 180 graus no sentido anti-horário e remova a cuvette. Use uma pipeta de plástico para remover a amostra da cuvette em um novo tubo de microcentrifuuagem. Mantenha o tubo no gelo ou em uma geladeira antes de processamento adicional, se não for usado imediatamente.
Para iniciar a remoção gratuita do siRNA, passe 3,5 mililitros de PBS filtrado através da coluna de cromatografia de exclusão de tamanho duas vezes para equilibrá-la. Em seguida, dissolver 150 microliters de amostra eletroporada em 350 microliters de PBS filtrado, e transferi-lo para a coluna SEC. Colete a primeira fração de 500 microliter eludida da coluna em um tubo de microfuça, e marque-a como F0. Em seguida, adicione 500 microliters de PBS filtrado à coluna.
Colete a próxima fração, e marque-a como F1. Repita a adição do PBS e a coleta de frações de elução até que um total de 10 frações de 500 microliter, ou até F9, seja coletado. Finalmente, para remover quaisquer resíduos amostrais, lave a coluna com PBS filtrado pelo menos duas vezes e, em seguida, continue com experimentos, como descrito no manuscrito. A análise morfológica usando microscopia eletrônica de transmissão mostrou que os exosóis HEK-293 eram estruturas esféricas ligeiramente maiores que 100 nanômetros.
Este resultado concorda com o da medição da análise de rastreamento de nanopartículas, que também mostrou a distribuição de tamanho dos exosóis. Além disso, foram positivos para marcadores exosômicos CD81, CD9 e CD63. A recuperação percentual de exosóis purificados por meio da cromatografia de exclusão de tamanho e a recuperação percentual do siRNA foram calculadas conforme descrito no manuscrito.
A recuperação pós-purificação do exossomo foi de 75% Utilizando a curva padrão siRNA, a eficiência de encapsulamento do siRNA em exosóis foi calculada em cerca de 10 a 20% A análise qualitativa da citometria de fluxo de absorção in vitro de exossomos carregados com Atto655-siRNA fluorescente mostrou que as células PANC-1 tratadas com exosomos encapsulados pelo siRNA tiveram a maior mudança no sinal de fluorescência. Isso foi confirmado pela constatação de que as células PANC-1 tratadas com exosóis encapsulados pelo siRNA registraram maior percentual de população positiva para o sinal Atto655 em comparação com a tratada com exosomos descarregados e mistura de siRNA. A absorção celular do siRNA também foi significativamente maior em células PANC-1 tratadas com exossomos encapsulados pelo siRNA em comparação com a tratada com a mistura exosome-sirna, confirmando que os exosóis encapsulados pelo siRNA foram internalizados pelas células PANC-1 e que efetivamente entregam o siRNA intracelularmente.
É importante pesar o óxido de sacarose e deutério com muita precisão no preparo da solução de sacarose, e sempre usar solução de sacarose recém-preparada para evitar alterações de densidade durante o armazenamento. A microscopia confocal pode ser realizada para validar ainda mais a internalização do siRNA encapsulado nos exosóis nas células e estudar seu tráfico intracelular após a captação celular. Este protocolo nos permite avaliar o knockdown específico do siRNA fornecido por exosomos e serve como uma ferramenta para nova validação de alvo na terapia de câncer baseada em interferência de RNA.
