Agradeço ao Dr. Jessica Dominguez Rieg para a leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association (Scientist Desenvolvimento Grant 10SDG2610034), a Carl W. Gottschalk Research Grant da Sociedade Americana de Nefrologia, o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais O&#39;Brien Center for Acute Kidney Injury Research ( P30DK079337) e do Departamento de Assuntos de Veteranos.

1. Soluções <ol><li> 0,85% de NaCl: 8,5 g de NaCl / 1 l ddH2O (8,5 g / L). </li><li> 0,5 mol / L de HEPES pH 7,4 (dissolver 59,6 g de HEPES em 0,5 L de ddH 2 0 e ajustar o pH para 7,4 utilizando NaOH 10 N). </li></ol> 2. Preparação de FITC-inulina Injection Solution <ol><li> Pesar com FITC inulina para preparar uma solução a 5% e dissolvido em 0,85% de NaCl (normalmente 100 mg / 2 ml de 0,85% de NaCl) por aquecimento a 90 ° C até estar completamente dissolvido. </li><li> Pesar dissolvido solução de FITC-inulina e peso nota. </li><li> Cortar uma 20 centímetros pedaço de membrana de diálise (peso molecular de corte: 1000) e coloca em ddH2O durante 30 min para remover o residual NaN 3 a partir da membrana e lave algumas vezes depois. </li><li> Preencha dissolvido FITC-inulina em membrana de diálise e lacrar com encerramentos. </li><li> Pese toda membrana de diálise. </li><li> Colocar a membrana de diálise, em 1 L de solução de NaCl a 0,85% e agita-se lentamente à luz protegida durante 24 horas à rotemperatura om. </li><li> Pesar inteiro membrana de diálise novo e calcular a nova concentração (a água irá passar para o osmoticamente membrana e FITC não ligado ou ligado de FITC-inulina &lt;1,000 peso molecular irá mover para fora da membrana, assim, a concentração de FITC-inulina diminui substancialmente) . </li><li> A nova concentração FITC-inulina (c) é calculada utilizando a seguinte fórmula: C = N / V, onde n = quantidade de FITC-inulina inicial, V = novo volume (diferença de peso do tubo de diálise antes e depois da diálise mais o volume inicial de solução de FITC-inulina). </li><li> Antes de usar esterilizar solução dialisada com FITC inulina por filtração através de um filtro de seringa 0,22. </li><li> Ficar FITC-inulina protegido da luz (folha de alumínio), a 4 ° C. Dialisadas e esterilizado com FITC inulina pode ser utilizada para um máximo de 2 semanas. Participaram FITC-inulina pode ser re-dissolvido por aquecimento a 90 ° C durante alguns minutos. </li></ol> Nota: se estiver usandoFITC-sinistrin 16-18, o qual não necessita de diálise, todos os passos necessários para a diálise pode ser ignorada. 3. Injeção e Coleta de Sangue <ol><li> Tire o peso corporal (pc) dos camundongos antes do experimento. </li><li> Anestesiar ratos brevemente com isoflurano. </li><li> Por alto rendimento de 6 ratinhos siga protocolo fornecido na Figura 3. </li><li> Injetar 2 l / g de peso corporal de dialisado FITC-inulina no plexo retro-orbitária 24 usando um G30 ½ em agulha (remover bolhas de ar de 100 l seringa Hamilton, primeiro usando uma G26 ½ na agulha e, em seguida, mudar para um G30 ½ na agulha para injecção). </li><li> Corte de 1 mm da cauda do rato com uma tesoura uma vez e coletar sangue em 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 min após a injeção de Na-heparina minicapillaries. Seal minicapillaries após a coleta de sangue, com Cha-seal. </li><li> Manter as amostras protegidas da luz. </li><li> Coloque selado minicapillaries dentro hematocrit capilares e centrifugar durante 5 min. </li><li> Quebre minicapillaries usando um cortador de diamante e plasma toda transferência por pipetagem em um tubo de 0,2 ml. </li><li> Fazer uma diluição de 1:10 utilizando 2 ul de plasma e 18 ul de 0,5 mol / L de HEPES (pH 7,4) em 0,2 ml novo tubo (amostras podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C, para medições de fluorescência). </li><li> Meça 2 mL de amostra diluída com NanoDrop 3300 em duplicatas. A descrição e uso do instrumento é descrito aqui 5. </li></ol> 4. Elaboração de normas <ol><li> Coleta de sangue de ratos da mesma linhagem fundo em heparina revestido hematócrito capilares, girar e diluir 1:10 com 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4), geralmente 80 mL de plasma + 720 ul de HEPES. </li><li> Diluir solução injeção FITC-inulina com plasma diluído mouse para obter as seguintes diluições padrão: 01:10: 10 ul solução não diluída de FITC-inulina + 90 ul de plasma diluído rato 1:100: 10 &amp; mu, Solução l (1.10) + 90 mL de plasma diluído rato 1:1000: 10 ul (1:100) + 90 ul de solução de plasma de rato diluído 1:2000: 30 ul (1:1) + 30 ul de solução de plasma de rato diluído 1:10000: 10 ul (1:5) + 40 ul de solução de plasma de rato diluído 1:20000: 20 ul (1:1) + solução de 20 ul de plasma diluído rato 1:100.000: 10 ul (1:5) + 40 ul de solução de plasma de rato diluído A concentração dos padrões dependerá da diálise e será sempre diferente para cada preparação de FITC-inulina. É necessário entrar na concentração para a curva padrão novo a cada vez. </li><li> Analisar os dados para calcular a taxa de filtração glomerular com software apropriado (por exemplo, GraphPad Prism) utilizando uma função de decaimento exponencial de duas fases, tal como descrito aqui 15, 20 e mostrado na secção de resultados representativas. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate.">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li><li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatinine:+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases.">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li><li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. 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D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. 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Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

O autor recebeu financiamento para cobrir os custos desta publicação pela Thermo Fisher Scientific.

O presente estudo descreve uma técnica para a determinação da taxa de filtração glomerular em ratos conscientes pela injeção single-bolus e análise de fluorescência em oito amostras de sangue por duas fases de decaimento exponencial. A medição da TFG em um rato leva 75 min. Ao utilizar um fluxograma especial, é possível medir a TFG de 6 ratinhos em 130 min. É possível repetir esse protocolo fluxograma até quatro vezes por dia e medir a taxa de filtração glomerular em 24 ratos. Nós este método modificado de modo que seja possível a recolha de sangue a partir de um pequeno recorte da cauda, ​​em vez de punção na veia da cauda, ​​o que é mais rápido e mais fácil para os investigadores a executar em relação ao punção da veia da cauda. Usando 10 ml de hematócrito capilares e uma diluição de 1:10, é possível reduzir a quantidade total de sangue necessário para &lt;100 ul. Finalmente, a fluorescência é medida utilizando um NanoDrop fluorospectrometer 3300, que permite a determinação da fluorescência de 1-2 ul de amostra diluída. Este método vai dar o investigato interessadosra o verdadeiro valor da TFG. Em contraste, as medições de creatinina em ratos têm várias deficiências, incluindo &quot;gama cego creatinina&quot;, e dificuldades relacionadas com a determinação específica e sensível. A &quot;escala de creatinina cego&quot; limita a sua função como um marcador para a taxa de filtração glomerular da creatinina sérica, porque permanece na gama normal de até 50% da função renal é perdido 19. Uma vez que vários investigadores utilizam camundongos geneticamente modificados em suas pesquisas para estudar a fisiologia e fisiopatologia renal, este tem o seguinte problema: supondo que um camundongo knockout do gene X teria um GFR significativamente menor (40%) em comparação com um rato do tipo selvagem, uma triagem simples, comparando creatinina plasmática não detectar essa diferença. A necessidade de um bom método preciso para determinação TFG torna-se mais crítica quanto menor as diferenças na taxa de filtração glomerular se. Os ratos têm concentrações elevadas de chromagens não creatinina no plasma e na urina que interferem com comercialmenteOs ensaios da creatinina estão disponíveis. Consequentemente, os ensaios que se baseiam na picrato Jaffé reacção alcalina sobreavaliação concentração de creatinina no plasma em comparação com a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) determinação 6, 13. Outra limitação é que a creatinina sérica é inferior aos limites de detecção dos vários ensaios disponíveis comercialmente em comparação com a análise por HPLC. No entanto, através da utilização de reacções enzimáticas investigadores foram capazes de determinar a creatinina no plasma em ratinhos 10, 22. TFG em uma faixa semelhante foram encontrados em ratos conscientes, utilizando um método comparável de injeção single-bolus, bem como desembaraço FITC-inulina urinária 14. Em contraste com o seu protocolo, o nosso protocolo usando recorte cauda não exige precauções especiais para preservar a integridade do vaso em relação ao punção da veia da cauda, ​​ou veia safena. Para o apuramento urinária / plasma baseada FITC-inulina é necessário implantar cirurgicamente duas milhas osmóticanipumps. Duas bombas são necessárias para atingir suficientes concentrações plasmáticas no estado de equilíbrio alta FITC-inulina que são claramente distinguíveis do fundo. Isso também requer o uso de gaiolas metabólicas para coleta de urina completo e cronometrado. As gaiolas devem ser enxaguados para ter em conta a perda de 25-37% de FITC-inulina, que de outro modo ocorre sem enxaguar. Os perigos de usar este método de FITC-inulina são limitadas. Os investigadores devem estar cientes do seguinte: (i) assegurar que não há bolhas de ar na seringa usada para a injeção da solução de FITC, (ii) a injeção retrobulbar completo deve ser alcançado porque a quantidade injetada determina a TFG calculada e ( iii) a ratos vão mais provável urinar durante o 75 min experimento TFG, portanto, evite a contaminação de amostras de sangue com a urina, o que terá uma concentração muito elevada de FITC-inulina, como uma consequência da capacidade de concentração renal. Vantagens Geral of este método FITC-inulina incluem o seguinte: (i) é uma técnica não-radioactivos, (ii) é possível repetir várias vezes medições no mesmo rato, (iii) o ensaio pode ser realizado em ratos conscientes, ( iv) recolha de urina não é necessário, e (v) uma opção de alto rendimento podem ser utilizadas. As desvantagens para a injecção de bolus único incluem a necessidade de diálise de FITC-inulina, que pode ser ultrapassada pela utilização de um melhor marcador FITC, FITC-sinistrin, que está disponível e pode ser medido usando um dispositivo transcutea miniaturizado especial 18. Mesmo que a TFG é medida, não é possível medir a excreção fracionada de fluido ou de iões com este método. Tomados em conjunto, este método oferece a viabilidade de um método de alto rendimento para a medição da TFG em ratos conscientes. Assim, esta técnica pode ser de interesse para outros pesquisadores que estão interessados ​​na determinação da função renal em camundongos.

A taxa de formação de ultrafiltrado do plasma no glomérulo tornou-se a base para a avaliação da função renal (taxa de filtração glomerular, TFG). O marcador ideal para determinar a TFG deve ser filtrada livremente, nem segregada ou reabsorvido e não metabolizado. Tal comportamento foi encontrado para ser verdadeiro para inulina, e depuração de inulina tornou-se um padrão-ouro para a determinação da taxa de filtração glomerular 3. Considerando que a liberação de creatinina é amplamente utilizado como uma medida da taxa de filtração glomerular em humanos e animais, a creatinina não preenche os requisitos de um marcador ideal da TFG. Cerca de 10 - 40% do clearance de creatinina em seres humanos é a conseqüência de secreção tubular ativa 1, 11, e secreção renal de creatinina também é destaque em camundongos e ratos 4, 7, 9, 22. A disfunção renal é conhecido para aumentar a secreção tubular de creatinina, que limita a sua utilidade como um marcador de uma taxa de filtração glomerular, 2. Nós mostramos anteriormente que ânion orgânico transportador isoforma3 (OAT3) contribui para murino secreção de creatinina 22. No entanto, a depuração de inulina normalmente requer o uso de inulina marcada radioactiva (3 H, ou 14 C). A determinação radioactiva da inulina pode ser utilizada tanto em ratinhos anestesiados e conscientes, mas abriga as desvantagens de vários regulamentos de segurança e problemas de manuseamento inerentes rigorosas com a utilização de isótopos radioactivos. Ao longo destas linhas, os preparativos apuramento cirúrgicas para determinação da TFG são demorados, bem como do terminal na natureza. Em 1999 Lorenz et al. 12 introduzida FITC-inulina, como marcador do único nefrónio TFG em ratos anestesiados. Cinco anos mais tarde, Qi et al. 15 determinou todo rim TFG em ratinhos conscientes utilizando FITC-inulina. Protocolos alternativos estão usando agora FITC-inulina como um marcador exógeno para medir a taxa de filtração glomerular em ratos conscientes e anestesiados. Estes protocolos de reter a sensibilidade de inulina radioactivos usando fluorescência DETECTIe em contornar as desvantagens de se trabalhar com um marcador radioactivo marcado. O ensaio FITC-inulina foi modificado por outros 7, 8 e nos 22, 23 para aproveitar a capacidade microvolume do NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Isto permite a redução do volume total de amostra necessária para &lt;100 ul de sangue por TFG medida. Com o método e o protocolo de alto rendimento fornecida nesta publicação, que demonstram a viabilidade da medição de GFR em até 24 ratinhos conscientes por dia. Esta técnica pode ser útil para outros pesquisadores que estudam GFR murino e esperamos que ele irá substituir métodos menos precisos como índices para a função renal, tais como creatinina e uréia no sangue.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

A medida da taxa de filtração glomerular (TFG) é o padrão ouro na avaliação da função renal. Actualmente, os investigadores a determinar TFG por medição do nível de creatinina no biomarcador endógena ou exogenamente aplicado radioactivos inulina marcada (3 H, ou 14 C). Creatinina tem a desvantagem substancial de que as contas de secreção tubulares proximais para ~ 50% da excreção de creatinina e, por conseguinte, a creatinina é um marcador fiável da TFG. Dependendo da experiência realizada, a depuração de inulina pode ser determinada através de uma única injecção de bolus ou infusão intravenosa continua (intravenosa ou mini bomba osmótica). Ambas as abordagens requerem a recolha de plasma ou de plasma e urina, respectivamente. Outros inconvenientes da inulina rotulado radioactivo incluem o uso de isótopos, demorado preparação cirúrgica dos animais, e a exigência de uma experiência de terminal. Aqui, nós descrevemos um método que usa uma única injecção bolusfluoresceína isotiocianato (FITC) de inulina marcada e a medição da sua fluorescência em 1-2 ml de plasma diluído. Através da aplicação de um modelo de dois compartimentos, com oito coletas de sangue por mouse, é possível medir a TFG em até 24 ratos por dia usando um protocolo especial de fluxo de trabalho. Este método requer apenas anestesia isoflurano breve com todas as amostras de sangue a ser coletado em um mouse não-contido e acordado. Outra vantagem é que é possível seguir ratinhos durante um período de vários meses, e os tratamentos (isto é, fazendo experiências emparelhadas com as alterações dietéticas ou aplicações de droga). Esperamos que esta técnica de medição da TFG é útil para outros pesquisadores que estudam a função renal do rato e vai substituir métodos menos precisos para estimar a função renal, tais como creatinina plasmática e uréia.

TFG será calculada utilizando a seguinte fórmula: TFG = n / (+ A/K1 B/K2), onde n = quantidade injetada (n = c • V, onde c = concentração FITC-inulina, V = volume injetado) A = amplitude1, y-interceptar de eliminação K1 = constante de decaimento para a eliminação B = Span2, y-interceptar de distribuição K2 = constante de decaimento para distribuição Nota: A, K1, K2 e B são abreviaturas dadas por GraphPad Prism, cada um software capaz de analisar duas fase de decaimento exponencial pode ser utilizado, no entanto, outro software científica podem usar diferentes abreviaturas. Ao empregar um ajuste da curva de decaimento exponencial de duas fases, que se baseia no plasma concentrações de FITC-inulina, uma curva similar à mostrada na Figura 1, deve ser obtida. Calculando TFG pela fórmula mostrada acima (e como descrito aqui &lt;sup&gt; 20) permite detectar perturbações da função renal glomerular, hiperfiltração 15 ou 8, 23, conforme se encontra em ratos com diabetes mellitus tipo 1 (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> Figura 1. Para medir a taxa de filtração glomerular nos ratos conscientes, cinética plasmática do FITC-inulina na sequência de uma injecção intravenosa de uma dose única é usado. Para o cálculo da taxa de filtração glomerular, um modelo de dois compartimentos é empregue. No modelo de dois compartimentos, a fase inicial rápida decomposição representa redistribuição do FITC-inulina a partir do compartimento intravascular para o fluido extracelular. A fase posterior, com uma queda mais lenta em concentração de FITC-inulina, reflecte predominantemente depuração sistémica a partir do plasma. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> Figura 2. Detection de hiperfiltração diabética em ratinhos de tipo selvagem. Diabetes mellitus tipo I foi induzida por aplicação intraperitoneal de estreptozotocina (STZ, 50 mg / kg durante 5 dias consecutivos). TFG foi determinada antes (basal) e 5 semanas após a indução do diabetes. Devido ao feedback tubuloglomerular, um aumento primário na reabsorção proximal provoca cedo hiperfiltração diabético 21 uma descoberta que é reproduzível em camundongos selvagens (n = 10, p &lt;0,01 vs basal mesmo mouse). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> Figura 3. Fluxograma para a medição da taxa de filtração glomerular em um conjunto de seis camundongos. Para medir todo renal TFG pelo método de injeção única em bolus, oito amostras de sangue devem ser coletadas em 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 min após FITC-inulina injecção. Os números indicam os pontos temporais. Os números entre parênteses indicam o número da amostra. Momentos à esquerda da linha vertical vermelha indica injeçãoOs pontos de tempo (0, 11, 22, 33, 44 e 55 min). Cada rato é marcado com uma cor diferente. Para obter coletas de sangue sequenciais seguir as setas. Caixas cinzentas indicar quando o próximo rato deve estar preparado para anestesia com isoflurano antes da injecção. Usando este protocolo o tempo mínimo entre duas coletas de sangue de diferentes ratos é 1 min.

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A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Medição da taxa de filtração glomerular (TFG) é o padrão ouro para avaliação da função renal. Aqui, nós descrevemos um método de alto rendimento que permite a determinação da taxa de filtração glomerular em ratinhos conscientes utilizando uma única injecção de bolus, a determinação de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-inulina no plasma e no cálculo da TFG por um modelo de decaimento exponencial de duas fases.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

43.1K visualizações.  University of California, San Diego. Medição da taxa de filtração glomerular (TFG) é o padrão ouro para avaliação da função renal. Aqui, nós descrevemos um método de alto rendimento que permite a determinação da taxa de filtração glomerular em ratinhos conscientes utilizando uma única injecção de bolus, a determinação de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-inulina no plasma e no cálculo da TFG por um modelo de decaimento exponencial de duas fases.

Vídeo: A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biologia

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

High-Throughput medição e classificação de P orgânico em amostras ambientais

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice Cap: Um Método para Crescer Arabidopsis Plantas e tomate em placas de 96 poços para High-Throughput Genotipagem

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Laboratório de Fisiologia Demonstração: Taxa de filtração glomerular em um Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...