Name: transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents
Uploaded: 2016-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
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ZHP was supported by the Marie-Curie project: NephroTools.

experimentos necessários para desenvolver o protocolo foram realizados de acordo com os regulamentos nacionais e foram aprovados pelo comitê de ciência ética local (Regierungspräsidium Karlsruhe). 1. Preparação da solução de injecção de FITC-sinistrin <ol><li> Dissolve-FITC sinistrin em solução salina fisiológica para preparar uma solução de reserva. A dose recomendada em murganhos é de 7,5 mg / 100 g de peso corporal (BW), enquanto que em ratos 5 mg / 100 g BW-FITC sinistrin é preferível. Para ratinhos, preparar uma solução de uma solução de estoque de FITC-sinistrin a 15 mg / ml, enquanto que para os ratos preparar a uma concentração de 40 mg / ml. Nota: solução de FITC-sinistrin pode ser preparado antecipadamente e guardado a -20 ° C ao abrigo da luz. </li></ol> 2. Preparação de animais <ol><li> Aclimatar os animais durante pelo menos uma semana antes da sua introdução em qualquer experiência. </li><li> Anestesiar o animal utilizando 5% de isoflurano em 5 L / min de O2 </sub&gt; Fluir por 2 min. </li><li> Confirmar que o animal está devidamente anestesiados por observar a sua respiração, o que torna-se mais lenta e profunda, e verificar a ausência de resposta com a falta de uma resposta dedo do pé. </li><li> Uma vez que o animal está adormecido, reduzir a anestesia para 2,5% de isoflurano em O taxa de entrega de 2 L / min 2 e tomar o BW. </li><li> Remover a pele do flanco da parte de trás do animal utilizando uma máquina de barbear eléctrica. Raspar uma área ligeiramente maior do que a área que irá ser ocupada pelo pedaço de material adesivo de dupla face, que tem dimensões de 3 cm x 6 cm. </li><li> Posteriormente aplica o creme de depilação por um curto período (2-3 min) para remover a pele restante. </li><li> Lave bem a área até que o creme foi completamente removido, como o próprio creme pode ser fluorescente. Nota: Evite coçar a pele do animal, pois ele pode produzir irritação / edema. Se a área depilada mostra pigmentação na pele, raspar uma área maior, até um ponto não pigmentado para oparte óptica do aparelho é encontrado. Recomenda-se fazer a barba 24 horas de antecedência para minimizar a exposição a anestesia. </li></ol> 3. Dispositivo de preparação <ol><li> Colocar o dispositivo óptico para medir a função renal em um lado do pedaço de material adesivo de dupla face, o posicionamento da parte óptica acima da janela transparente (Figura 1), deixando a parte oposta com a película de protecção. Nota: Quando se trabalha com pequenos roedores, reduzir o tamanho do penso, como mostrado na Figura 2. </li><li> Anexar um pedaço de emplastro adesivo de dupla face de tamanho correspondente para a bateria, como mostrado na Figura 3. </li></ol> 4. Fixação do dispositivo no animal <ol><li> Calcular o volume adequado de injecção com base no peso corporal do animal. </li><li> Anestesiar os animais com isoflurano como anteriormente indicado em secções 2.1-2.3. </li><li> Corte um pedaço de gaze tubular elástica atadura of cerca de 1 cm mais longo do que a largura do pedaço de material adesivo de dupla face para ser utilizado. </li><li> Puxe a atadura de gaze elástica sobre a cabeça do animal e do lugar em suas costas, deixando a área raspada descoberto. Nota: Como alternativa, fixar o dispositivo usando apenas fita adesiva, mas esteja ciente de pressão indevida sobre o dispositivo. </li><li> Ligar a bateria para o dispositivo, ligando o conector da bateria para a porta correspondente no dispositivo. Depois disso remover a folha de protecção da parte de remendo e montagem da bateria sobre a superfície superior do dispositivo (Figura 4A). Certifique-se de que a bateria está devidamente ligado ao verificar que o dispositivo começa a piscar. Nota: Em ratos, a bateria pode ser também ligado directamente sobre o pedaço de material adesivo, ao lado do dispositivo (Figura 4B). </li><li> Remover a tampa de protecção a partir do emplastro com o dispositivo de operação e colocá-lo na área rapada no dorso do animal, segurando-s bordas até que seja correctamente fixa. </li><li> Cobrir o dispositivo com a atadura de gaze tubular elástica aderindo-o à superfície adesiva do penso (Figura 5). </li><li> Corretamente esticar a atadura tubular no abdômen do animal, garantindo que os membros podem circular livremente. </li><li> Para uma melhor fixação e a protecção do dispositivo, aplicar uma tira de fita adesiva da seguinte forma do dispositivo e que cobrem os fios da bateria. </li><li> Meça fundo para 1 a 3 min, sem colocar pressão sobre o dispositivo </li></ol> Administração 5. FITC-sinistrin e Procedimentos de Medição <ol><li> Se necessário, aquecer-se a cauda do animal, por meio de água quente antes de injecção ou uma placa de aquecimento com controlo de temperatura ao longo de todo o procedimento. </li><li> Injectar através da veia da cauda do volume apropriado de solução de FITC-sinistrin. O volume de injecção depende BW animais e, por conseguinte, deve ser calculado para cada contras individuaisidering a dose desejada e concentração da solução de reserva, acima mencionado na secção 1.1. </li><li> Assegure-se que toda a solução de FITC-sinistrin é administrado por via intravenosa e não por via subcutânea. Nota: Em alternativa, FITC-sinistrin pode ser administrada através de um cateter intravenosa pré-implantados saiu na nuca do pescoço em roedores ou por injecção retro-orbital em murganhos. </li><li> Cuidadosamente, devolver o animal para sua gaiola evitando movimentos fortes e qualquer pressão sobre o dispositivo, uma vez que iria introduzir artefatos de movimento. </li><li> Coloque a gaiola em um lugar calmo para evitar que o animal é perturbado. </li><li> Realizar a medição durante pelo menos 1 hr se trabalhar com camundongos e 2 horas quando se utiliza ratos. Durante esse período, o dispositivo óptico irá medir através da pele a fluorescência emitida por FITC-sinistrin. Nota: Durante o período de gravação do animal deve ser hospedado sozinho. Além disso, o abastecimento de água, bem como salienteestruturas como as tampas de arame, deve ser removido para evitar danos do aparelho e do movimento artefatos eletrônicos devido aos impactos com objetos. </li></ol> Remoção 6. Dispositivo <ol><li> Uma vez que o período de gravação é longo, remover o dispositivo sem anestesia; No entanto, se necessário, anestesiar o animal brevemente sob 5% de isoflurano em taxa de libertação de 5 L / min de O2 durante 2 min. </li><li> Cuidadosamente, retirar a fita adesiva em primeiro lugar, em seguida, a bandagem tubular. </li><li> Gentilmente desprender o adesivo dupla face adesiva da pele e devolver o animal à sua gaiola normal. </li></ol> 7. Leia fora de Dados <ol><li> Desligue a bateria do aparelho e remover o adesivo. Nota: Os dados são armazenados no dispositivo até que um novo começa a medição. Quando a bateria está ligada aos dados armazenados são substituídos com as novas gravações. Portanto, não volte a ligar a bateria antes de baixar os dados dodispositivo. Há um período de carência de 10 seg destinado a reconexão acidental da bateria. </li><li> Conecte o dispositivo a um PC usando um cabo USB micro e baixar os dados usando o software fornecido. O arquivo de saída é um arquivo .csv que pode ser aberto e modificado com um programa de planilha. </li><li> Abra o ficheiro de dados com o software específico para o dispositivo óptico e gerar a curva cinética de eliminação, utilizando os protocolos de software. </li><li> Analisar a curva, seguindo as instruções fornecidas com o dispositivo óptico. Logo, para a avaliação dos dados, definir o sinal de fundo medido administração FITC-sinistrin antes e marca o início da fase de excreção exponencial do marcador, o que geralmente ocorre 15 min e 45 min após a injecção de bólus, em ratinhos e ratos, respectivamente, . Nota: O software irá exibir automaticamente a meia-vida de FITC-sinistrin (t 1/2), juntamente com um valor de R 2, determinada por um 1-Comparmodelo tamento. t 1/2 pode ser utilizado para calcular a taxa de filtração glomerular, utilizando um factor de conversão 9,10. </li></ol>

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NG detém uma patente sobre a produção de FITC-sinistrin.

O presente artigo descreve o procedimento para determinar a função renal em roedores conscientes utilizando um dispositivo miniaturizado ea exógena marcador renal FITC-sinistrin. Como afirmado anteriormente, este método tem várias vantagens em comparação com os processos tradicionais de depuração na urina e no plasma. Um deles é a independência em relação a amostragem de sangue e urina, que conduz a uma grande economia em termos de consumo, o tempo e, evidentemente, o stress dos animais. Como mostrado na Tabela 2, o marcador exógeno renal FITC-sinistrin e a medição da sua cinética de eliminação através da pele permitir que o impacto de patologias renais sobre a função renal a ser estudado 9,10,14-18. A recolha de amostras de sangue em série dos necessários para avaliar a depuração plasmática ou biomarcadores de doença renal são stressante para o animal, pesado e para os investigadores demorado. Portanto, as medidas sequenciais dentro do mesmo animal ter sido limbida pelo bem-estar dos animais e razões metodológicas. A reprodutibilidade intra-provou animais da medição transcutânea 13 faz com que seja um método ideal para a detecção de alterações na função renal devido à progressão da doença ou envelhecimento. Pela mesma razão, também pode ser extremamente útil para estudar a eficácia de abordagens terapêuticas. Dois passos críticos para uma aplicação bem sucedida desta tecnologia são a fixação do dispositivo óptico no animal e a correta administração do marcador. O dispositivo deve ser fixado de forma adequada para evitar artefatos de movimento. Para esse efeito, impedindo a ligação e separação do pedaço de material adesivo de dupla face é crucial, pois pode levar à perda das suas propriedades adesivas e, finalmente, uma fixação inadequada no animal. Como mencionado no protocolo, a imobilização e proteção do dispositivo óptico, cobrindo-o com fita adesiva é uma abordagem eficaz para garantir uma adequate fixação. Ao realizar a injecção bolus FITC-sinistrin é crucial para administrar toda a substância por via intravenosa e não por via subcutânea. A liberação do marcador no tecido subcutâneo pode ser facilmente identificado por um anel amarelo circulando a cauda do animal produzido pela própria cor do FITC-sinistrin. A injecção subcutânea normalmente se manifesta como uma curva mais plana e hora marcador excreção prolongada. A possível limitação deste método está mais relacionado com o marcador usado do que com a tecnologia por si só. Quando um edema está presente na pele de um animal, a avaliação da função renal transcutânea não seria recomendada, como existe um compartimento adicional que pode alterar a dinâmica de excreção de FITC-sinistrin. Da mesma forma, a pele pigmentada pode limitar o uso da técnica, devido à sobreposição de excitação e de emissão de espectros de FITC-sinistrin e melanina. No entanto, em animais com pigmentação da pele em manchas, o problema é resolvido através da colocação da ópticaparte do dispositivo em uma área não pigmentado. É possível modificar os diferentes aspectos da avaliação transcutânea da função renal, a fim de adaptar o procedimento a espécie e / ou abordagens diferentes animais. Por exemplo, a dosagem recomendada de FITC-sinistrin ou o comprimento da medição pode ser ajustado dependendo do objectivo do ensaio, bem como para diferentes espécies ou modelos animais. Esta adaptação do método já foi confirmado pela sua aplicação com sucesso em diferentes espécies de roedores e vários tipos de estirpes com problemas de saúde variados. Além disso, a avaliação transcutânea da função renal foi recentemente validado em cães e gatos 12, com excelentes resultados. Devido às diferenças entre estes animais indubitáveis ​​e roedores, este estudo determinou-se a dose apropriada do FITC-sinistrin para ambos, cães e gatos, e é realizada uma medição de tempo muito mais longo, em vez de 4 horas ou 1 ou 2 horas de usod em roedores. Tomados em conjunto, a utilização desta técnica pode ajudar a obter insights mais precisos em nefrologia, incluindo uma melhor compreensão da progressão da doença renal e o efeito de terapias. As características da avaliação da função renal transcutânea coloca-lo como uma técnica adequada para ser aplicada em campos clínicos humanos e veterinários no futuro, e deve ser considerado como uma tecnologia promissora para substituir as abordagens tradicionais.

taxa de filtração glomerular (TFG) é o melhor parâmetro para avaliar a função renal global. O padrão de ouro para determinar a GFR se baseia na depuração do plasma ou urina dos marcadores renais exógenos, tais como inulina 1. No entanto, estes procedimentos são demorados e complicados, exigindo a recolha de sangue em série e / ou amostras de urina e posteriores ensaios laboratoriais para a sua análise. Além disso, estes métodos são invasivos e stressante para os animais, o que limita o número de vezes e de frequência em que as medições podem ser utilizadas. Um número de abordagens alternativas têm sido desenvolvidas para simplificar os procedimentos clássicos para determinar GFR, mas eles ainda dependem de urina e plasma de amostragem 2-4 e / ou requerem anestesia profunda 5,6, que é conhecido por influenciar a hemodinâmica e função renais 7, 8. Produtos finais do metabolismo, tais como creatinina, também são amplamente utilizados para estimar a função renal. No entanto, sabe-se que o accurACY destes marcadores endógenos não é óptima e, por outro lado, a analisá-los, a urina ou a amostragem de sangue, também é indispensável. Aqui nós descrevemos uma metodologia transcutânea para avaliar a função renal em animais conscientes. Este método é mais simples e mais rápido do que os métodos tradicionais, bem como apenas minimamente invasiva. Com esta técnica, usando um dispositivo óptico miniaturizado e o -sinistrin exógeno renal marcador de isotiocianato de fluoresceína (FITC), é possível determinar a função renal quase em tempo real sem a necessidade de plasma ou amostras de urina e sem cateterização cirúrgico para a administração da substância. Devido a estas características, o método é adequado para realizar medições sequenciais no mesmo animal. FITC-sinistrin é um marcador renal filtrado livremente pelos glomérulos, sem reabsorção tubular ou secreção. A parte óptica do dispositivo miniaturizado consiste em dois diodos emissores de luz (LEDs), que excitamo marcador administrado e um fotodíodo para detectar a fluorescência emitida através da pele. Os dados gravados são armazenados na memória interna integrada no dispositivo e que pode ser usado para gerar a curva cinética de eliminação de FITC-sinistrin. A energia é fornecida por uma pequena bateria de lítio recarregável. Para obter informações mais detalhadas sobre o dispositivo e seus componentes individuais referem-se a Schreiber et al. 9. O dispositivo é facilmente montado sobre o corpo do animal utilizando um emplastro de dupla face adesiva levando uma janela transparente para os componentes ópticos. Os resultados estão disponíveis após o período de gravação é longo. Com o método e o protocolo fornecido aqui, introduzimos uma tecnologia promissora, que pode substituir o padrão de ouro para determinar TFG actual, não só na pesquisa mas também no campo clínico.

<table><tbody><tr><td>NIC-Kidney device</td><td>Mannheim Pharma &amp;amp; Diagnostics GmbH</td><td></td><td>Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com</td></tr><tr><td>FITC-sinistrin</td><td>Mannheim Pharma &amp;amp; Diagnostics GmbH</td><td></td><td>Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com</td></tr><tr><td>Double-sided adhesive patch</td><td>Mannheim Pharma &amp;amp; Diagnostics GmbH</td><td></td><td>Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com</td></tr><tr><td>Isis Rodent electric shaver</td><td>Braun Aesculap&amp;nbsp;</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott GmbH&amp;nbsp;</td><td>PZN4831850</td><td></td></tr><tr><td>Leukosilk adhesive tape</td><td>BSN medical</td><td>102200</td><td></td></tr><tr><td>Tubular elastic gauze bandage&amp;nbsp;</td><td>MaiMed Medical GmbH</td><td>73012</td><td>There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice.</td></tr><tr><td>Veet depilation cream</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>PZN7768307</td><td>Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals</td></tr><tr><td>Micro USB cable</td><td>Samsung</td><td>APCBU10BBE</td><td></td></tr><tr><td>Deltajonin Physiologic solution</td><td>AlleMan Pharma GmbH</td><td>3366954</td><td>Alternatively, it can be used saline or PBS&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

A configuração da medição transcutânea é muito simples e rápida: o dispositivo é colocado sobre o pedaço de material adesivo de dupla face (Figura 1) e ajustada em tamanho, se necessário (figura 2), a bateria é preparado (Figura 3) e ligado (Figura 4). Este método para avaliar a função renal já foi validado em diferentes espécies, em comparação com a abordagem tradicional da depuração plasmática 9,11,12. Seguindo o protocolo exposto aqui, Schreiber et ai. demonstraram a validade da técnica em diferentes modelos de ratos, que mostra resultados altamente comparável entre a medição e o plasma passe transcutânea para todos os grupos estudados (Tabela 1) 9. Neste trabalho a obtida t 1/2 foi convertido para GFR usando um mouse de conversão semi-empírica específicafator. A consistência da avaliação transcutânea da função renal também é provada usando diferentes cepas de camundongos. Medidas sequenciais dentro de 3 dias no mesmo animal, mostrou um coeficiente de variâncias de 3,0-6,2% 13. Neste estudo, não houve conversão ao TFG, mas os resultados foram expressos e interpretados diretamente em termos de t 1/2. A possibilidade de ter os resultados quase em tempo real é uma das grandes vantagens deste método. Após o período de gravação, os resultados estão imediatamente disponíveis para a análise e o software fornecido mostra a curva de excreção de FITC-sinistrin instantaneamente (Figura 6). Dentro do mesmo software a t 1/2 de FITC-sinistrin pode ser obtido, o qual pode ser utilizado directamente como o parâmetro para avaliar a função renal do convertida em termos de taxa de filtração glomerular. Figura 7 </strong&gt; mostra como ele olha a curva de excreção FITC-sinistrin medida transcutânea em um animal com insuficiência renal. Quando a função renal é afetada, FITC-sinistrin t 1/2 aumenta devido à excreção reduzida da substância e a aparência da curva muda. Normalmente, a curva medida não voltar para o nível de fundo e apresenta uma área aumentada sob a curva. No mesmo animal, as medições de pré para pós-lesão pode experimentar um aumento na intensidade de fluorescência máxima devido à acumulação do marcador causada por sua excreção reduzida. Na presença de insuficiência renal, a curva medida por via transcutea de FITC-sinistrin pode mostrar um estado estacionário, devido à função severamente prejudicada (Figura 7B). A utilização do dispositivo miniaturizado em diversas estirpes de roedores com diferente estado de saúde tem mostrado que esta técnica é adequada e suficientemente sensível para detectar alterações due a doença renal e ao envelhecimento. A Tabela 2 mostra um resumo dos modelos murinos estudados até à data com este método. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig1.jpg" /> Figura 1. A colocação do dispositivo sobre o pedaço de material adesivo de dupla face. O dispositivo é montado sobre o pedaço de material adesivo de posicionamento sua parte óptico na janela transparente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig2.jpg" /> Figura 2. Adaptação do pedaço de material adesivo de pequeno porte roedores. Para uso em pequenos animais, recomenda-se reduzir o tamanho do emplastro. A: usar o dispositivo como um guia para cortar o emplastro adequadamente. B: Uma vez que o tamanho desejado tenha sido obtido, o dispositivo pode ser colocado sobre a superfície adesiva do sistema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig2large.jpg" target="_blank">P</a>locação clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig3.jpg" /> Figura 3. Preparação da bateria. Para fixar a bateria ao dispositivo, cortar um pequeno pedaço de adesivo dupla face adesiva (A e B) e coloque-o sobre a superfície da bateria (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig4.jpg" /> Figura 4. Ligação e colocação da bateria durante a medição. (A) em pequenas roedores tais como ratinhos, devido ao espaço reduzido, a bateria deve ser colocado na parte superior do dispositivo. (B) Em animais maiores a bateria cum ser colocado ao lado do dispositivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig5.jpg" /> Figura 5. Colocação da atadura de gaze elástica tubular em um rato. A bandagem tubular deve cobrir o adesivo dupla face adesiva, sem interferir com a livre circulação dos membros para o conforto do animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig6.jpg" /> Figura 6. imagem representativo de uma curva de eliminação do FITC-sinistrin. O sinal gerado por FITC-sinistrin é detectado transcuneamente e armazenados na memória interna do dispositivo. Quando os dados registados são descarregados para um PC, o software gera uma curva comparável ao apresentado na imagem. Eixo Y mostra a intensidade de fluorescência registrados [AU], emitida pelo marcador FITC-sinistrin injetado, enquanto eixo X representa a duração da medição em tempo [min]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53767/53767fig7.jpg" /> Figura 7. imagem representativo de uma curva de eliminação do FITC-sinistrin em animais com insuficiência renal. (A) curva de eliminação de FITC-sinistrin em animais com uma função renal reduzida tipicamente mostra um aumento da área sob a curva e a incapacidade para atingir a linha de base dentro do período normal de medição<html> . (B) Em animais gravemente prejudicada a curva transcutânea medida pode mostrar um estado estacionário que indica insuficiência renal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53767/53767fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/53767/53767table1.jpg" /> Tabela 1. Validação da medida transcutânea, comparando com a depuração plasmática tradicional. A medida transcutânea da função renal foi validado em diferentes modelos de ratos (saudável e unilateralmente nefrectomia (UNX C57BL) / 6-129 SV ratos e mouse modelo de nefronofitíase ( PCY)) em comparação com a depuração de plasma. Os valores são médias ± DP. TFG, taxa de filtração glomerular 9. /53767/53767table2.jpg &quot;/&gt; Tabela 2. modelos murinos estudada usando a medição transcutânea UNX, unilateralmente nefrectomia.; ECA, enzima conversora da angiotensina; T gumodwt / wt, transgénico uromodulin nocaute, SD, Sprague Dawley; PKD, doença renal policística.

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Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Avaliação transcutânea da função renal em roedores conscientes

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

transcutaneous-assessment-of-renal-function-in-conscious-rodents

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K visualizações.  Medical Faculty Mannheim, University of Heidelberg. Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kidney diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in the permeability barrier comprised of podocytes, vascular endothelial cells, and a basement membrane working in unison. Data from our laboratory using intravital 2-photon microscopy revealed a more permeable glomerular filtration barrier (GFB) than previously thought under physiologic conditions, with retrieval of filtered albumin occurring in an early subset of cells called proximal tubule cells (PTC)1,2,3.
Previous techniques used to study renal filtration and establishing the characteristic of the filtration barrier involved micropuncture of the lumen of these early tubular segments with sampling of the fluid content and analysis4. These studies determined albumin concentration in the luminal fluid to be virtually non-existent; corresponding closely to what is normally detected in the urine. However, characterization of dextran polymers with defined sizes by this technique revealed those of a size similar to serum albumin had higher levels in the tubular lumen and urine; suggesting increased permeability5.
Herein is a detailed outline of the technique used to directly visualize and quantify glomerular fluorescent albumin permeability in vivo. This method allows for detection of filtered albumin across the filtration barrier into Bowman's space (the initial chamber of urinary filtration); and also allows quantification of albumin reabsorption by proximal tubules and visualization of subsequent albumin transcytosis6. The absence of fluorescent albumin along later tubular segments en route to the bladder highlights the efficiency of the retrieval pathway in the earlier proximal tubule segments. Moreover, when this technique was applied to determine permeability of dextrans having a similar size to albumin virtually identical permeability values were reported2. These observations directly support the need to expand the focus of many proteinuric renal diseases to included alterations in proximal tubule cell reclamation.

A technique utilizing high resolution intavital 2-photon microscopy to directly visualize and quantify gloemrular filtration in surface glomeruli. This method allows for direct determination of permeability characteristics of macromolecules in both normal and diseased states.

Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Medicina

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is estimated to contribute to 19- 25% of all clinical cases of acute kidney injury (AKI) in critically ill patients. AKI detection has historically relied on metrics such as serum creatinine (sCr) or blood urea nitrogen (BUN) which are demonstrably inadequate in full assessment of nephrotoxicity in the early phase of renal dysfunction. Currently, there is no robust diagnostic method to accurately detect hemodynamic alteration in the early phase of AKI while such alterations might actually precede the rise in serum biomarker levels. Such early detection can help clinicians make an accurate diagnosis and help in in decision making for therapeutic strategy. Rats were treated with Cisplatin to induce AKI. Nephrotoxicity was assessed for six days using high-frequency sonography, sCr measurement and upon histopathology of kidney. Hemodynamic evaluation using 2D and Color-Doppler images were used to serially study nephrotoxicity in rats, using the sonography. Our data showed successful drug-induced kidney injury in adult rats by histological examination. Color-Doppler based sonographic assessment of AKI indicated that resistive-index (RI) and pulsatile-index (PI) were increased in the treatment group; and peak-systolic velocity (mm/s), end-diastolic velocity (mm/s) and velocity-time integral (VTI, mm) were decreased in renal arteries in the same group. Importantly, these hemodynamic changes evaluated by sonography preceded the rise of sCr levels. Sonography-based indices such as RI or PI can thus be useful predictive markers of declining renal function in rodents. From our sonography-based observations in the kidneys of rats that underwent AKI, we showed that these noninvasive hemodynamic measurements may consider as an accurate, sensitive and robust method in detecting early stage kidney dysfunction. This study also underscores the importance of ethical issues associated with animal use in research.

Early stage hemodynamic dysfunction is critical to the development of kidney disease. Yet, detection methodologies are limited. Recent advances in sonography provide a noninvasive, accurate option for early detection of kidney injury. This study outlines a step-by-step, sonographic methodology for detecting kidney dysfunction using a drug-induced nephrotoxicity rat model.

Detecção precoce de Induzida por Medicamentos Renal hemodinâmica Disfunção Usando ultrassonografia Tecnologia em Ratos

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Novel Approach for Simultaneous Recording of Renal Sympathetic Nerve Activity and Blood Pressure with Intravenous Infusion in Conscious, Unrestrained Mice.

Renal sympathetic nerves contribute significantly to both physiological and pathophysiological phenomena. Evaluating renal sympathetic nerve activity (RSNA) is of great interest in many areas of research such as chronic kidney disease, hypertension, heart failure, diabetes and obesity. Unequivocal assessment of the role of the sympathetic nervous system is thus imperative for proper interpretation of experimental results and understanding of disease processes. RSNA has been traditionally measured in anesthetized rodents, including mice. However, mice usually exhibit very low systemic blood pressure and hemodynamic instability for several hours during anesthesia and surgery. Meaningful interpretation of RSNA is confounded by this non-physiological state, given the intimate relationship between sympathetic nervous tone and cardiovascular status. To address this limitation of traditional approaches, we developed a new method for measuring RSNA in conscious, freely-moving mice. Mice were chronically instrumented with radio-telemeters for continuous monitoring of blood pressure as well as a jugular venous infusion catheter and custom-designed bipolar electrode for direct recording of RSNA. Following a 48-72 hour recovery period, survival rate was 100% and all mice behaved normally. At this time-point, RSNA was successfully recorded in 80% of mice, with viable signals acquired up to 4 and 5 days post-surgery in 70% and 50% of mice, respectively. Physiological blood pressures were recorded in all mice (116&plusmn;2 mmHg; n=10). Recorded RSNA increased with eating and grooming, as well-established in the literature. Furthermore, RSNA was validated by ganglionic blockade and modulation of blood pressure with pharmacological agents. Herein, an effective and manageable method for clear recording of RSNA in conscious, freely-moving mice is described.

Anesthetized mice exhibit non-physiological systemic blood pressure, which precludes meaningful assessment of autonomic tone given the intimate relationship between blood pressure and the autonomic nervous system. Thus, a novel method to simultaneously record renal sympathetic nerve activity and blood pressure with intravenous infusion in conscious mice is outlined.

Nova abordagem para gravação simultânea da atividade do nervo simpático Renal e pressão arterial com infusão intravenosa em consciente, ratos desenfreados.

Renal sympathetic nerves contribute significantly to both physiological and pathophysiological phenomena. Evaluating renal sympathetic nerve activity ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Biologia

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermal medição da taxa de filtração Glomerular em ratos

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Laboratório de Fisiologia Demonstração: Taxa de filtração glomerular em um Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain slices and neuronal cell cultures. Recently, this technology has been applied to the whole organs. Advances in sensor design have made &#160;possible the measuring of&#160;cell signaling in blood-perfused in vivo kidneys. The present protocols list the steps needed to measure ATP and H2O2 signaling in the rat kidney interstitium. Two separate sensor designs are used for the ex vivo and in vivo protocols. Both types of sensor&#160;are coated with&#160;a thin enzymatic biolayer on top of a permselectivity layer to give fast responding, sensitive and selective biosensors. The permselectivity layer protects the signal from the interferents in biological tissue, and the enzymatic layer utilizes&#160;the sequential catalytic reaction of glycerol kinase and glycerol-3-phosphate oxidase in the presence of ATP to produce H2O2. The set of sensors used for the ex vivo studies further detected analyte by oxidation of H2O2 on a platinum/iridium (Pt-Ir) wire electrode. The sensors for the&#160;in vivo studies are instead based on the reduction of H2O2 on a mediator coated gold electrode designed for blood-perfused tissue. Final concentration changes&#160;are detected by real-time amperometry followed by calibration to known concentrations of analyte. Additionally, the specificity of the amperometric signal can be confirmed by the addition of enzymes such as catalase and apyrase that break down H2O2 and ATP correspondingly. These sensors also rely heavily on accurate calibrations before and after each experiment. The following two protocols establish the study of real-time detection of ATP and H2O2 in kidney tissues, and can be further modified to extend the described method for use in other biological preparations or whole organs.

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

Uso de biossensores para quantificar enzimática endógena ATP ou H<sub&gt; 2</sub&gt; Ó<sub&gt; 2</sub&gt; No rim

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Long-Term Continuous Measurement of Renal Blood Flow in Conscious Rats

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital functions of filtration and metabolism in kidney function. Many acute studies have been carried out in anesthetized animals to measure RBF under various conditions to determine mechanisms responsible for the regulation of kidney perfusion. However, for technical reasons, it has not been possible to measure RBF continuously (24 h/day) in unrestrained unanesthetized rats over prolonged periods. These methods allow the continuous determination of RBF over many weeks while also simultaneously recording blood pressure (BP) with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry). RBF monitoring is carried out with rats placed in a circular servo-controlled rat cage that enables the unrestrained movement of the rat throughout the study. At the same time, the tangling of cables from the flow probe and arterial catheters is prevented. Rats are first instrumented with an ultrasonic flow probe placement on the left renal artery and an arterial catheter implanted in the right femoral artery. These are routed subcutaneously to the nape of the neck, and connected to the flowmeter and pressure transducer, respectively, to measure RBF and BP. Following surgical implantation, rats are immediately placed in the cage to recover for at least one week and stabilize the ultrasonic probe recordings. Urine collection is also feasible in this system. The surgical and post-surgical procedures for continuous monitoring are demonstrated in this protocol.

The present protocol describes a long-term continuous measurement of renal blood flow in conscious rats and simultaneously recording blood pressure with implanted catheters (fluid-filled or by telemetry).

Medição Contínua a Longo Prazo do Fluxo Sanguíneo Renal em Ratos Conscientes

The kidneys play a crucial role in maintaining the homeostasis of body fluids. The regulation of renal blood flow (RBF) is essential to the vital ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mechanically Ventilated Piglets

Transdermal measurement of glomerular filtration rate (GFR) has been used to evaluate kidney function in conscious animals. This technique is well established in rodents to study acute kidney injury and chronic kidney disease. However, GFR measurement using the transdermal system has not been validated in pigs, a species with a similar renal system to humans. Hence, we investigated the effect of sepsis on transdermal GFR in anesthetized and mechanically ventilated neonatal pigs. Polymicrobial sepsis was induced by cecal ligation and puncture (CLP). The transdermal GFR measurement system consisting of a miniaturized fluorescence sensor was attached to the pig's shaved skin to determine the clearance of fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin, an intravenously injected GFR tracer. Our results show that at 12 h post-CLP, serum creatinine increased with a decrease in GFR. This study demonstrates, for the first time, the utility of the transdermal GFR approach in determining renal function in mechanically ventilated, neonatal pigs.

Glomerular filtration rate (GFR) is the ideal marker for assessing kidney function. However, the standard measurement method using inulin injection with serial blood and urine analysis is impractical. This article delineates a practical method to measure GFR transdermally in piglets.

Medição Transdérmica da Taxa de Filtração Glomerular em Leitões Ventilados Mecanicamente

Transdermal measurement of glomerular filtration rate (GFR) has been used to evaluate kidney function in conscious animals. This technique is well ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Medições de esfíncter uretral Cystometric e externo em ratos acordados com cateter implantado e eletrodos permitindo medições repetidas

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...