Financiamento para aspectos deste trabalho foi fornecida por várias fontes, incluindo o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos Acordo de Cooperação específico 58-6408-1-595 ea National Science Foundation (prêmio 1.049.911).

Colorimétrico Análise da atividade da enzima extracelular em solos e sedimentos 1. Preparação do Substrato e Soluções Tampão de Análises colorimétrica de atividade enzimática <ol><li> H preparar 50 mM de tampão de acetato (pH 5,0-5,5) por mistura de 50 ml de 0,1 M de ácido acético (2,87 ml de ácido acético glacial em 500 ml de água), 150 ml de 0,1 M de acetato de sódio, e 200 ml de água destilada 2 O. Ajustar o pH para 5,0-5,5 com ácido acético 0,1 M, se necessário. </li><li> Prepara-se uma solução de hidróxido de sódio 1 M (NaOH), em H2O destilada </li><li> Preparar soluções de substrato ligado ao NP p em 50 mM de tampão acetato. Para ensaiar fosfatase preparar p NP-fosfato 5 mM em 50 mM de tampão de acetato, para ensaiar β-glicosidase preparar 5 mM de p-NP β-glucopiranósido; para ensaiar NAGase preparar 2 mM de pNP-β-N-acetylglucosaminide. Prepare todas as soluções de substrato em estéreis 15 ml ou 50 ml tubos de centrífuga. As soluções podem ser armazenadas a 4 ° C durante 2-3 semanas. </li></ol> 2. Determinação de um padrão para converter Absorbance para p NP Concentração <ol><li> Prepare soluções padrão de p-nitrofenol em 50 mM de tampão de acetato. Concentrações devem variar 0,025-1 mM. </li><li> Transferência de três repetições de 100 ul de cada concentração de um de 96 cavidades de microplacas claro. Adicionar 10 ul de NaOH 1 M e 190 ul de H2O destilada a cada poço. </li><li> Ficha de absorção a 410 nm utilizando um leitor de microplacas. </li><li> Concentrações multiplicam na curva padrão de 0,3 para obter ^ moles NP p por 300 mL de volume de reação. Traçar uma curva de absorção versus mole de p NP. A inclinação da curva serve como o factor de conversão (C) que se relacionam absorvância a umole de p NP em cada reacção enzimática. </li></ol> 3. Conduzir o ensaio enzimático <ol><li> Para o solo, preparar uma pasta de cada amostra a ser ensaiada em um tubo de centrífuga de 15 ml estéril a uma concentrção de cerca de 1 g / ml -1 usando 50 mM de tampão de acetato. Para sedimentos, adicionar tampão acetato suficiente para fazer a pasta facilmente pipettable. O volume exacto de pasta necessária irá variar de acordo com o número de enzimas testadas, mas recomenda-se um mínimo de 5 ml. Vortex cada pasta até que todos os pedaços de solo ou sedimento se dispersaram e anote o volume final. </li><li> Re-vórtice cada lama e pipetar imediatamente 150 pi em cada um de seis poços em um bloco de 96 poços deepwell (Figura 1). É importante vórtice completamente e frequência, a fim de manter as partículas do solo em suspensão. Deixar pelo menos duas cavidades por bloco vazio para servir como um controle de substrato. Nota: o clipe de fim de pontas de pipeta com uma tesoura antes de pipetar como suspensões de solo tendem a obstruir dicas. Preparar um bloco de 96 poços para cada enzima a ser testada. </li><li> Deita aproximadamente 5 ml de tampão de acetato de dentro de um reservatório de pipeta e usar um pipetador de 8 canais para adicionar 150 ul do tampão para o last dois poços de cada amostra (estes serão controlos de tampão da amostra) e as duas cavidades de controlo de substrato (Figura 1) </li><li> Despeje a cerca de 10 ml da solução apropriada de substrato p-NP para um reservatório de pipeta e usar um pipetador de 8 canais para adicionar 150 ul da solução de substrato para os primeiros quatro poços de cada amostra e as duas cavidades de controlo de substrato (Figura 1). Observe o tempo que a reação começa assim que é adicionado à solução de substrato. </li><li> Incubar as placas a temperatura ambiente (22 ° C) durante 0,5-4 h. Tempo de incubação exacta vai variar dependendo do nível de actividade em amostras e a enzima a ser testada. Para a maioria dos solos e sedimentos, fosfatase e β-glicosidase requerem tempos de incubação de 0,5-1,5 h, enquanto NAGase e outras enzimas requerem tempos de incubação de&gt; 2 horas. </li><li> Enquanto ensaios estão incubando preparar claro microplacas de 96 poços de ler absorbância. Prepare uma microplaca para cada bloco deepwell (ou seja, para cada enzyme ensaiada). Pipetar 10 ul de NaOH 1 M e 190 ul de água destilada em cada poço da microplaca. Nota: NaOH retarda a reacção enzimática e eleva o pH o que melhora a cor da p NP libertado durante a reacção. </li><li> Após a incubação, centrifugar os blocos de 96 poços a 2.000-5.000 x g durante 5 min para sedimentar as partículas do solo. </li><li> Usar uma pipeta de canais múltiplos para retirar 100 ml de cada cavidade, tendo o cuidado de evitar a pelota, e transferi-la para a cavidade correspondente no preparado claro microplaca de 96 poços. </li><li> Ligue o leitor de microplacas e configurar qualquer software necessário. Ficha de absorção a 410 nm. Se a absorção de um bem determinado for superior ao limite de detecção linear do leitor de placas, que bem diluir 1:1 com água e re-medida. Se a absorvância é ainda demasiado elevado, o ensaio deve ser repetido com um tempo de incubação mais curto. </li></ol> 4. Determinação da Massa Seca das Amostras <ol><li> Pipete 1 mL de cada sampl<html> e lama em uma panela de alumínio previamente pesado. </li><li> A seco em um forno de secagem de 75 ° C durante 48 horas e pesar. Subtrair o peso do recipiente a partir deste valor para obter a massa seca de solo ou de sedimento em 1 ml de suspensão. Multiplicar por um factor de 0,15 para determinar a massa seca da amostra em 150 ul adicionados a cada cavidade no ensaio de enzima. </li></ol> 5. Cálculo da atividade enzimática por Massa Seca de solo ou sedimento <ol><li> Calcular absorvância final de cada amostra subtraindo a absorvância da amostra de controlo a partir da absorvância da amostra de ensaio. Se os controles de substrato têm alta absorção (cerca de&gt; 0.060), em seguida, subtrair aqueles também. </li><li> Calcular a actividade da enzima em mole hr -1 g de massa seca -1 a partir da equação: </li></ol> A atividade da enzima = / (massa C x tempo de incubação x amostra seca) absorção final Análise fluorescente da atividade da enzima extracelular em Águas Naturais tle &quot;&gt; 1. Preparação de substrato, Standard e Soluções Tampão para análises fluorométricos de atividade enzimática <ol><li> Preparar 200 uM soluções de substratos MUB-ligados (por exemplo, 4-MUB-β-glucopiranósido, 4-MUB-fosfato, 4-MUB-N-acetil-β-D-glucosaminida) por dissolução do substrato apropriado na estéril (autoclavado) destilada H 2 O em estéreis 15 ml ou 50 ml tubos de centrífuga. Enrole tubos em papel de alumínio para excluir a luz e armazenar na geladeira antes de usar. Os substratos devem ser estáveis ​​durante pelo menos 1 semana se armazenada desta maneira. </li><li> Prepara-se uma norma MUB fazendo uma solução de estoque de 100 mM de 4-metilumbeliferona em estéril H2O destilada Loja refrigerado em âmbar ou garrafa embrulhada em papel alumínio. Imediatamente antes do uso, dilui-se a solução de estoque 100 mM por 1/10 em H 2 O estéril para fazer uma solução de trabalho de 10 pM para os ensaios enzimáticos. </li><li> Prepara-se uma solução de reserva de tampão de bicarbonato a 100 mM por dissolução de 8,4 g de NaHCO &lt;sub&gt; 3 em 1 LH 2 O e autoclavagem. Dilui-se esta solução de reserva de 1/20 em H 2 O estéril conforme necessário para produzir uma solução de trabalho de 5 mM para os ensaios enzimáticos. </li></ol> 2. Organizar amostras de água em uma Preto microplacas de 96 poços <ol><li> Organizar uma microplaca para cada enzima, seguindo o exemplo mostrado na Figura 2. Note-se que para permitir a replicação adequada, os padrões e os controlos, este processo pode-se testar a actividade de uma enzima única para até nove amostras de água sobre uma microplaca de 96 poços preta. </li><li> Deita aproximadamente 5 ml da primeira amostra para um reservatório de pipeta e usar um pipetador de 8 canais para pipette200 ul em todos os poços na coluna 1 da microplaca (s). Descarte as pontas de pipeta usados ​​e repita conforme necessário para cada amostra de água para encher colunas 1-9. </li></ol> 3. Configuração de Amostra, Padrão, Quench e Controles de substrato <ol><li> Estabelecer controles para explicar amostras, padrãos, substrato e têmpera na mesma microplaca preta como as amostras (Figura 2). </li><li> Controlos exemplo contêm água da amostra e tampão de bicarbonato, e não são utilizados para os cálculos de actividade mas irá demonstrar leitura consistência ao longo do curso do experimento. Os controlos consistem de têmpera de água da amostra e uma quantidade padrão de marcação fluorescente e são usados ​​para medir a fluorescência de difracção em água da amostra. Substrato e controlos padrão são feitas de tampão ou ligada ao substrato ou a etiqueta fluorescente padrão, respectivamente, e bicarbonato. </li><li> Despeje cerca de 5 ml de 5 mM de tampão bicarbonato em um reservatório pipeta limpa. Pipetar 50 ul de tampão para poços de 1 a 9, em linhas D e E, para formar dois replicar poços de controlo de amostra por amostra. Dicas Mudança de pipetas, em seguida, transferir 200 mL de tampão bicarbonato de poços de 10 a 12 em linhas A e H. </li><li> Reduza a iluminação do ambiente, escurecendo ou desligar lights como o padrão fluorescente é sensível à luz. </li><li> Despeje a cerca de 5 ml de 10 mM de 4-metilumbeliferona num reservatório pipeta limpa. Pipetar 50 mL em poços de 1 a 12 na Linha H, e em poços de 1 a 9 em linhas G e F para formar três repetições de controles de têmpera por amostra e controles globais padrão. Ou colocar a microplaca no escuro ou cobrir com uma tampa opaca para reduzir a degradação de luz MUB. </li><li> Ligue o fluorímetro e set-up de qualquer software necessário para estar pronto para ler antes de adicionar o substrato. Nota: algumas lâmpadas fluorómetro pode exigir um tempo de aquecimento de 3 min ou mais. </li><li> Deita aproximadamente 5 ml de substrato MUB ligada apropriado (por exemplo, 4-MUB-fosfato) para um reservatório de pipeta limpa. Use uma pipeta de 12 canais de pipeta 50 ul em poços de 1 a 12 na linha A, e em poços de 1 a 9 em linhas B e C para formar três ensaios de réplicas para cada amostra e três controles de substrato. Immediately avançar para o passo 4.1, fluorescência de gravação. </li></ol> 4. Gravação de fluorescência <ol><li> Ler a fluorescência inicial imediatamente após a adição do substrato para a microplaca. Após a leitura de fluorescência, incubar a microplaca à temperatura ambiente (22 ° C), quer no escuro ou coberta com uma tampa opaca para reduzir a degradação pela luz do MUB. </li><li> O tempo de incubação necessário para medir a actividade da enzima potencial máximo em uma amostra de água dependerá da concentração de enzima na amostra. Uma vez que este efeito é desconhecido antes do ensaio está completado, a microplaca terá de ser lida a vários intervalos de tempo. Tipicamente, a leitura em intervalos de 10-15 minutos ao longo de 1 hora é aceitável para muitas enzimas, embora as amostras com actividade muito elevada para certos enzimas pode pico antes de 10 min. </li><li> Continuar a leitura de fluorescência na microplaca a seus intervalos designados para, pelo menos, 1 hora. Certifique-se de manter a microplaca cobertos ou no escuro entre a leituras. </li></ol> 5. Cálculo da atividade da enzima por volume de água <ol><li> Para cada amostra em cada intervalo de tempo calcular as: média de fluorescência da amostra inicial (poços D e E), a fluorescência da amostra média final (poços AC), a média de fluorescência padrão (poços H10-11), ea média de saciar controle de fluorescência (poços FG). </li><li> Para cada intervalo de tempo, calcular a actividade enzimática em nmol hr -1 -1 ml a partir da equação: </li></ol> A atividade da enzima = (média de fluorescência da amostra - média de fluorescência da amostra inicial) / ((média padrão de fluorescência / 0,5 mol) x (média saciar controle de fluorescência / média padrão de fluorescência) x (0,2 ml) x (tempo em horas)) <ol start="3"><li> Examine os valores de atividade calculados para cada passo de tempo. Determinar a actividade potencial final a partir do intervalo de tempo com a actividade mais elevada. Se os valores de atividade continuam a aumentar, em seguida, podem ser necessários passos de tempo mais tarde, se valores de atividade cair throughout o curso da execução, em seguida, executar novamente com passos mais curtos. Atividade final é em nmol de substrato consumido hr -1 -1 ml, mas pode ser ampliado para expressar como ^ moles hr -1 L -1. </li></ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain.">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Determinar a atividade de uma variedade de enzimas extracelulares microbianas em solos e sedimentos pode fornecer informações úteis sobre as taxas de mineralização de nutrientes e processamento de matéria orgânica 17. No entanto, os solos podem variar em seus níveis de umidade, por isso é importante para padronizar a atividade de peso seco de solo. Isso requer uma etapa de secagem adicional (normalmente de dois dias) além de simplesmente medir a atividade da enzima. Assim, em contraste com os ensaio...

Os microrganismos, tais como bactérias e fungos obter nutrientes e de carbono a partir de compostos orgânicos complexos, através da produção de enzimas extracelulares. Estas enzimas normalmente hidrolisar polímeros em subunidades menores que podem ser tomadas para a célula. Portanto, a nível ecológico, estas enzimas extracelulares microbianos são responsáveis ​​por grande parte da mineralização de nutrientes e decomposição da matéria orgânica, que ocorre em ambientes naturais. Enzimas tais como celobiohidrolase (CBH) e β-glucosidase são importantes para a degradação da celulose e do trabalho em uníssono para catalisar a hidrólise da celulose em glicose 1,2, o que proporciona um substrato de carbono utilizáveis ​​para a absorção e assimilação microbiana. A fosfatase enzima libera grupos fosfatos inorgânicos solúveis de organofosforados, essencialmente mineralização de fosfato e tornando-o disponível para uso pela maioria dos organismos 3. Outros enzimas, tais como a N-acetilglucosaminidase (NAGase), são important na degradação da quitina e pode fazer tanto carbono e nitrogênio disponível para aquisição microbiana 4. Um dos procedimentos para o ensaio da atividade enzimática extracelular microbiana em ambientes naturais é o uso de p-nitrofenil artificial (p NP) substratos ligados, uma abordagem que foi originalmente desenvolvido para detectar a atividade da fosfatase do solo 5. Esta abordagem baseia-se na detecção de um produto final colorido, p-nitrofenol, o qual é libertado, quando o substrato artificial é hidrolisado pela enzima apropriada. O p-nitrofenol pode ser subsequentemente quantificados colorimetricamente através da medição da sua absorvância de cerca de 400-410 nm. Este método já foi utilizada para a detecção de outras enzimas tais como a NAGase 6, e tem sido utilizado em vários estudos procurando a actividade enzimática extracelular microbiana no solo e nos sedimentos 7-9. Uma abordagem alternativa que era originally desenvolvido para avaliar a actividade de glicosidase extracelular em ambientes aquáticos 10,11 faz uso de 4-metilumbeliferona (MUB) substratos ligados. O produto final libertada (4-metilumbeliferona) é altamente fluorescente e pode ser detectada usando um fluorómetro, com uma configuração de excitação / emissão em torno de 360/460 nm. Uma variedade de substratos artificiais MUB-ligadas estão disponíveis, permitindo a medição fluorométrico da actividade de, pelo menos, como muitas enzimas (por exemplo, β-glicosidase, celobiohidrolase, Nagase, fosfatase), como pode ser testada utilizando o procedimento colorimétrico NP-substrato p. Outras enzimas extracelulares microbianos, tais como a leucina-aminopeptidase proteína-degradante, pode ser ensaiada fluorometricamente utilizando 7-amino-4-metilcumarina (COU) substratos ligados. Ambos MUB-e substratos COU-ligados foram utilizados para determinar a actividade da enzima em diferentes amostras terrestres e aquáticos 12,13. Embora estudos anteriores têm described microplaca fluorométrica ou colorimétrico abordagens para determinar a atividade da enzima extracelular 14, há uma necessidade de uma apresentação clara de como conduzir tais ensaios. Aqui demonstramos procedimentos para a realização de técnicas de alto rendimento de microplacas para a análise da atividade da enzima extracelular em solos e sedimentos, utilizando a abordagem de substratos ligados ao NP p colorimétrico e em águas naturais usando o MUB fluorescente ligada técnica substratos. Nós nos concentramos na medição das atividades de β-glicosidase, NAGase e fosfatase como essas enzimas pode ser amarrado ao carbono, nitrogênio, fósforo e ciclismo, respectivamente. No entanto, os processos descritos aqui podem ser aplicados para a medição de outras enzimas extracelulares usando diferentes substratos artificiais.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS AND MATERIALS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP612-1</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3234</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7006</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9376</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Clear 96-well microplates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-563-301</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96-well deep well blocks</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3958</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Aluminum weigh pans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8883</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3633</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2133</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96-well microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3792</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-81</td>
			<td>For microplates/deep-well blocks</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate fluorometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>FLx 800</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-channel pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of microbial extracellular enzyme activity in waters, soils, and sediments using high throughput microplate assays

Grande parte da ciclagem de nutrientes e processamento de carbono em ambientes naturais ocorre através da atividade de enzimas extracelulares produzidos por microorganismos. Assim, a medição da atividade dessas enzimas extracelulares pode dar insights sobre as taxas de processos de nível do ecossistema, como a decomposição da matéria orgânica ou de azoto e de mineralização do fósforo. Os ensaios de actividade da enzima extracelular em amostras ambientais tipicamente envolver a exposição das amostras de substratos colorimétricos ou fluorométricos artificiais e rastreando a taxa de hidrólise do substrato. Aqui nós descrevemos os métodos em microplacas para estes procedimentos que permitem a análise de um grande número de amostras dentro de um curto espaço de tempo. As amostras são deixados reagir com substratos artificiais dentro microplacas de 96 poços ou de poço profundo blocos de microplacas, e a actividade da enzima é subsequentemente determinada por absorção ou fluorescência do produto final resultante utilizando uma microplaca Reade típicor ou fluorímetro. Tais procedimentos de alto rendimento não só facilitar as comparações entre os locais ou ecossistemas espacialmente separadas, mas também reduzir substancialmente o custo de tais ensaios, reduzindo os volumes totais de reagentes necessários por amostra.

Solos e sedimentos aquáticos têm tipicamente níveis apreciáveis ​​de actividade da enzima extracelular, como resultado de comunidades microbianas acoplados (biofilmes) que crescem na superfície das partículas. Figura 3 mostra como esta actividade muda dependendo do tamanho das partículas obtidas a partir da superfície do sedimento de um terceiro fluxo de ordem no norte Mississippi, EUA. Um estudo anterior demonstrou que as comunidades bacterianas em partículas de sedimentos deste fluxo pode...

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Procedimentos em microplacas são descritos para a análise colorimétrica ou fluorimétrica da atividade da enzima extracelular. Estes procedimentos permitem o rápido ensaio de tal atividade em um grande número de amostras ambientais dentro de um prazo administrável.

Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

JoVE Journal

Environment

38.6K visualizações.  The University of Mississippi.  Procedimentos em microplacas são descritos para a análise colorimétrica ou fluorimétrica da atividade da enzima extracelular. Estes procedimentos permitem o rápido ensaio de tal atividade em um grande número de amostras ambientais dentro de um prazo administrável. 

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High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

De alta capacidade Fluorometric Medição do Potencial dos Solos extracelulares atividades enzimáticas

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Ambiente

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

Medição do fluxo de gases com efeito de Solos Agrícolas Usando Chambers estáticos

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

Desenvolvimento de sulfidogenico Sludge de sedimentos marinhos e Redução Trichloroethylene em um Reator Anaeróbio de Manta de Lodo

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Sediment Core Sectioning and Extraction of Pore Waters under Anoxic Conditions

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is built and can be transported to a temporary work space close to field sampling site(s) to facilitate rapid analysis. Cores are extruded into a portable glove bag, where they are sectioned and each 1-3 cm thick section (depending on core diameter) is sealed into 50 ml centrifuge tubes. Pore waters are separated with centrifugation outside of the glove bag and then returned to the glove bag for separation from the sediment. These extracted pore water samples can be analyzed immediately. Immediate analyses of redox sensitive species, such as sulfide, iron speciation, and arsenic speciation indicate that oxidation of pore waters is minimal; some samples show approximately 100% of the reduced species, e.g. 100% Fe(II) with no detectable Fe(III). Both sediment and pore water samples can be preserved to maintain chemical species for further analysis upon return to the laboratory.

A protocol for sectioning sediment cores and extracting pore waters under anoxic conditions in order to permit analysis of redox sensitive species in both solids and fluids is presented.

Sedimentos Núcleo de corte e extração de Pore Waters sob condições anóxicas

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

Limpo Amostragem e Análise do Rio e Estuarina Waters de Estudos de metal de rastreamento

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

Um teste de flexão para a determinação do limite de plástico Atterberg em solos

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Métodos de Reamostragem do solo para monitorar as mudanças nas concentrações químicas de Solos Florestais

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and organiclastic sulfate reduction (OSR) in marine sediments. However, unravelling the complex pyritization sequence is a challenge because of the coexistence of different sequentially formed pyrite phases. This manuscript describes a sample preparation procedure that enables the use of secondary ion mass spectroscopy (SIMS) to obtain in situ &#948;34S values of various pyrite generations. This allows researchers to constrain how SO4-AOM affects pyritization in methane-bearing sediments. SIMS analysis revealed an extreme range in &#948;34S values, spanning from -41.6 to +114.8&#8240;, which is much wider than the range of &#948;34S values obtained by the traditional bulk sulfur isotope analysis of the same samples. Pyrite in the shallow sediment mainly consists of 34S-depleted framboids, suggesting early diagenetic formation by OSR. Deeper in the sediment, more pyrite occurs as overgrowths and euhedral crystals, which display much higher SIMS &#948;34S values than the framboids. Such 34S-enriched pyrite is related to enhanced SO4-AOM at the sulfate-methane transition zone, postdating OSR. High-resolution in situ SIMS sulfur isotope analyses allow for the reconstruction of the pyritization processes, which cannot be resolved by bulk sulfur isotope analysis.

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Analyses of the sulfur isotopic composition (&#948;34S) of pyrite from methane-bearing sediments have typically focused on bulk samples. Here, we applied secondary ion mass spectroscopy to analyze the &#948;34S values of various pyrite generations to understand the diagenetic history of pyritization.

Preparação de pirita Authigenic de sedimentos de metano-rolamento para In Situ enxofre isótopo análise usando o SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the associated accuracy is unknown. Here, we present a detailed protocol for efficient and clustered soil sampling in a research plot and, relying on a pilot sampling using this design, for demonstrating soil spatial heterogeneity and informing reasonable sample sizes and associated accuracy for future study. The protocol mainly comprises four steps: sampling design, field collection, soil analysis, and geostatistical analysis. The step-by-step procedure is modified according to former publications. Two examples will be presented to demonstrate contrasting spatial distributions of soil organic carbon (SOC) and soil microbial biomass carbon (MBC) under different management practices. In addition, we present a strategy to determine the sample size requirement (SSR) given a certain level of accuracy based on the plot-level coefficient of variation (CV). The field sampling protocol and the quantitative determination of the sample size will assist researchers in seeking feasible sampling strategies to meet research needs and resources' availability.

The traditional soil-sampling procedure determines the number of soil samples arbitrarily. Here, we provide a simple yet efficient clustered soil-sampling design to demonstrate soil spatial heterogeneity and quantitatively determine the number of soil samples required and the associated sampling accuracy.