Nosso protocolo fornece um método de alto rendimento para triagem de um grande número de interações microbianas em conjunto para identificar interações de interesse que podem ajudar na pesquisa de microbioma e na descoberta antimicrobiana. Este método é facilmente aplicável ao estudo de interações microbianas em uma variedade de sistemas, desde que os microrganismos sejam amáveis à cultura em condições laboratoriais. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os usuários trivem um grande número de interações microbianas em um período relativamente curto de tempo.
Novos usuários dessa técnica devem levar tempo, especialmente quando vacinam as placas de bioensaio, pois é crucial ter cuidado para minimizar o crescimento excessivo ou a contaminação. A demonstração visual dessa técnica é fundamental, pois a inoculação das placas de bioensaio requer precisão para garantir que os organismos não superem os poços, e que as co-culturas não estejam contaminadas. Comece preparando culturas da noite para o dia.
Use uma pipeta sorológica para adicionar três mililitros de caldo BHI em tubos de cultura de 14 mililitros. Em seguida, use um loop inoculante de um microliter estéril para inocular uma colônia bacteriana no caldo. Gire o laço para garantir que a moita se disperse no caldo.
Brevemente vórtice os tubos de cultura, e incuba-los durante a noite a 37 graus Celsius em um shaker a 250 RPM. Uma vez que as culturas bacterianas atingem um OD 600 acima de um, vórtice-los para quebrar os aglomerados de células. Prepare a mídia PHI com 1,5% de ágar e esterilize-a autoclaving.
Em seguida, esfrie a mídia a 55 graus Celsius em um banho de água controlado pela temperatura, e dispense três mililitros de mídia BHI derretida em cada um dos 12 poços em um prato, garantindo que os poços sejam o mais uniforme possível. Em seguida, deixe o ágar definir durante a noite. Inocular o organismo de teste em uma placa de bioensa de ensaio inserindo um loop inoculante de 10 microliter estéril na cultura da noite para o dia, e espalhando a gota de cultura sobre o terço esquerdo de uma placa bem.
Repita até que todos os 12 poços da placa tenham sido inoculados. Incubar as placas de cabeça para baixo na temperatura apropriada por sete dias. Se incubar a temperaturas maiores ou iguais a 37 graus Celsius, ou em climas mais secos, armazene as placas em um recipiente úmido para evitar que sequem.
Após a incubação de seis dias da placa de bioensadura, prepare culturas noturnas do organismo alvo como descrito anteriormente. Prepare a placa-alvo preenchendo cada poço de uma placa vazia de 12 poços com 1,8 mililitros de BHI, e 200 microliters da cultura da noite para o dia. Coloque um carimbo de inoculação estéril na placa de destino.
Gire suavemente as culturas ao redor dos poços, garantindo que eles não contaminem os poços vizinhos. Levante o carimbo de inoculação e certifique-se de que haja uma gota de cultura de destino diluída em cada ponta de selo. Coloque o carimbo de inoculação em uma placa de bioensa de ensaio não vacinada, e balance suavemente o carimbo para que a cultura caiacula cada poço.
Uma vez que o selo é removido, uma gota de cultura deve ser visível nos poços. Se algum poço não for inoculado com o carimbo de inoculação, localizará três microliters de cultura diluída durante a noite nos poços usando uma pipeta. Em seguida, inocular as placas de bioensaio como descrito anteriormente, mas alinhe as pontas de selo com o lado direito da placa de 12 poços, garantindo que o selo não entre em contato com a colônia bacteriana existente.
Remova cuidadosamente o carimbo e coloque-o de volta na placa alvo. Se o ágar se solidificou nos poços de forma desigual, balance suavemente o carimbo para frente e para trás, mas tenha cuidado para não transferir o carimbo para o crescimento do organismo de teste. Repita a inoculação para cada placa de bioensauditivo até que todas as placas sejam inoculadas e, em seguida, incubar as placas de cabeça para baixo na temperatura apropriada durante sete dias.
Após co-culminar o teste e o organismo alvo por uma semana, marque as interações com base na avaliação visual. Escore os poços com o crescimento do organismo-alvo que exibe crescimento indistinguível da monocultura como zero. Escore os poços com crescimento reduzido como um, e sem crescimento como dois.
Os ensaios de cocultura descritos aqui foram utilizados para avaliar a atividade inibitória dos organismos de teste de actinobactérias em direção aos organismos-alvo da espécie staphylococcus isolados da cavidade nasal humana. Um total de 812 combinações em pares foram testadas. Notavelmente, o propinquum de Corynebacterium inibiu fortemente a coagulase negativa de estafilococos, particularmente em comparação com outras Corynebacterias que ou inibiram fracamente o estafilococos negativo da coagulase ou não tinham efeitos inibitórios.
Através do uso de genômica comparativa, um aglomerado genético biossintético para produção de siderophore foi identificado no genoma de propinquum corynebacterium. Ensaios de interação co-cultura utilizando o meio BHI padrão e complementado por ferro determinaram que o fenótipo de inibição entre o propinquum de Corynebacterium e o estafilococos negativo coagulase era, na verdade, dependente do ferro. É importante ter cuidado ao estampar a placa.
Verifique novamente cada poço após a estampagem e certifique-se de que o selo de inoculação esteja alinhado corretamente para evitar contaminação. Após a identificação de interações de interesse, estudos subsequentes utilizando genética microbiana e genômica, isolamento e caracterização de produtos naturais, ou espectrometria de massa de imagem podem ser usados para caracterizar mecanismos subjacentes a essas interações. Este protocolo foi recentemente usado para descobrir a competição mediada pelo siderophore entre a microbiota nasal humana, e ajudou na descoberta de uma nova molécula antifúngica chamada cifomicina.
