O financiamento para esta pesquisa foi fornecido em parte pelo Programa de Pesquisa Associado USDA-ARS e do Comitê de culturas de Germoplasma do USDA.

1. Determinação de amilose de batata Tuber Amido <ol><li> Descasque e corte os tubérculos frescos em cubos pequenos. </li><li> Coloque cubos de batata em pequenos sacos castanhos e armazenar durante a noite a -80 ° C. </li><li> Transfira os cubos de batata para sacos de nylon e por liofilização. </li><li> Depois de liofilizado, moer a amostra de batata em pó utilizando almofariz e pilão ou um Wiley Mill. </li><li> Num tubo de 50 ml, adicionar 20-30 mg da, amostra tubérculo solo seco por congelação. </li><li> Prepara-se uma solução de 45% (w / v) de ácido perclórico (misturar 24,4 ml de ácido perclórico a 60% e 25,6 ml de água ultra-pura. </li><li> Adicionar 500 mL de 45% (w / v) de ácido perclórico e agitar ou agite-a para dispersar os grânulos de amido. </li><li> Após um período de incubação de quatro minutos à temperatura ambiente, adicionar 16 ml de água ultra-pura a solução e misturar por vortex. </li><li> Depois que o material não solúvel tem assentado no fundo do tubo (7-10 minutos mais tarde), a transferência de 40 mL da solução a uma placa de microtitulação (evitando a pipetagem de quaisquer partículas). </li><li> Adicionar 50 ul de solução de iodo (2 g de KI e 1 g de I 2 por 900 ml de água ultra-pura) e misturar a amostra por pipetagem. </li><li> Ler a absorvância a 550 nm e 620 nm imediatamente. </li><li> Determinar a percentagem de amilose depois de comparar a proporção de amilose / amilopectina de cada amostra (620 nm/550 nm de absorvância) com uma curva padrão gerada a partir de amilose e amilopectina soluções a uma gama de concentrações. Este procedimento será descrito a seguir. Leia a (solução de iodo e ácido perclórico) em branco juntamente com as amostras de teste. Use apagado dados para as análises. </li></ol> 2. Amilose / amilopectina Curve <ol><li> Em tubos separados pesa 12,5 mg de teor de amilose e de amilopectina de 12,5 mg. </li><li> Adicionar a cada tubo 5 mL de 45% (w / v) de ácido perclórico e dissolver completamente. </li><li> Para cada uma das soluções (amilose e amilopectina) e levar a um volume final de 50 ml com água ultra-pura. </li><li> Misture 6,25ml de estoque de amilose da etapa anterior com 18,75 ml de água ultra-pura. Isso fará com que uma solução de amilose 6,25 mg / ml. </li><li> Repetir o procedimento para a solução de amilopectina. </li><li> Usando o teor de amilose e amilopectina soluções padrão a partir de passos 2.4 e 2.5, preparar os padrões de amilose por cento que são 0-100% de amilose (100-0% de amilopectina) com um volume final de 5 mL para criar a curva padrão em intervalos de 10%. Por exemplo, para se preparar: A amilose / amilopectina padrão de 100% a 0%, pipeta de 5 ml de solução de amilopectina. A amilose / amilopectina de 90% norma 10%, 0,5 ml de combinar amilose e 4,5 ml de soluções de amilopectina. A amilose / amilopectina padrão de 80% a 20%, misture 1,0 ml de amilose e amilopectina 4,0 ml de soluções. A amilose / amilopectina de 70% norma 30%, 1,5 ml de combinar amilose e 3,5 ml de soluções de amilopectina. A amilose / amilopectina de 60% norma 40%, 2,0 ml combinar amilose e 2,0 ml de soluções de amilopectina. O teor de amilose de 50%/ 50% de amilopectina padrão, combinar 2,5 ml de amilose e amilopectina com 2,5 ml de soluções. A amilose / amilopectina de 40% norma 60%, 3,0 ml combinar amilose e amilopectina de 2,0 ml, e assim por diante). </li><li> Transferir 40 uL de cada mistura de padrão para uma placa de microtitulação. Incluir um poço com 40 uL de 45% (w / v) de ácido perclórico como o branco. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de iodo (2 g de KI e 1 g de I 2 por 900 ml de água ultra-pura) e misturar cada amostra (incluindo a branco) por pipetagem. </li><li> Ler as absorvâncias a 550 nm e 620 nm imediatamente e calcular a proporção de amilose / amilopectina, para cada concentração. </li></ol>

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	<li>Composition Hoover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=molecular+structure,+and+physicochemical+properties+of+tuber+and+root+starches:+a+review.">molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review.</a> Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).</li><li>Bertoft, E., Blennow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Potato+Starch.">Structure of Potato Starch.</a> Advances in Potato Chemistry and Technology. , 83-98 (2009).</li><li>Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+methods+for+amylose+screening+in+maize+starches+from+exotic+backgrounds.">Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds.</a> Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).</li><li>Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+amylose+determination+methods+and+the+development+of+a+dual+wavelength+iodine+binding+technique.">Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique.</a> Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).</li><li>Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+estimation+of+the+amylose+amylopectin+ratio+in+small+amounts+of+tuber+and+leaf+tissue+of+the+potato.">Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato.</a> Potato Res. 31, 241-246 (1988).</li><li>Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Physiology+of+Starch+Development.">Genetics and Physiology of Starch Development.</a> Starch. , 23-82 (2009).</li><li>Haase, N. U., Plate, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+potato+starch+in+relation+to+varieties+and+environmental+factors.">Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors.</a> St&#228;rke. 48 (5), 167-171 (1996).</li><li>Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+storage+on+the+size+distribution+and+amylose/amylopectin+ratio+in+potato+starch+granules.">Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules.</a> Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).</li><li>Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+to+measure+amylose+in+cereal+starches+and+flours+with+concanavalin+A.">A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A.</a> J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).</li><li>Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+amylose+content+of+starches+after+precipitation+of+amylopectin+by+concanavalin+A.">Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A.</a> Starch. 42, 302-305 (1990).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Teor de amilose em tubérculos de batata geralmente varia de 20-35% 7,8. Se a maioria dos valores estão do lado de fora deste intervalo, considerar estes erros possíveis: 1) Os dados brutos foram usados ​​em vez de dados inibidas para a construção da curva padrão de amilose / amilopectina, 2) Os dados brutos foram usados ​​em vez de dados inibidas para a determinação do teor de amilose / proporções de amilopectina das amostras de batata, ou 3) a água utilizada para a análise não foi sufici...

Cerca de 80% do peso fresco de um tubérculo da batata é água; quase toda a matéria seca remanescente é de amido 1. A maior parte do amido (70%) é composto de amilopectina, enquanto que o restante é amilose. A relação entre a amilose e amilopectina é a propriedade mais importante que influencia as propriedades físicas do amido. Amilose é um alfa 1-4 cadeia glicose linear, enquanto a amilopectina é uma cadeia alfa 1-4 linear com alfa 1-6 ramos 2. Métodos tais como iodo de ligação, calorimetria diferencial de varrimento (DSC), cromatografia de exclusão de tamanho de elevado desempenho (HPSEC) e concanavalina A interacções têm sido desenvolvidos para a determinação de amido em diferentes espécies de plantas 3,4. Cada protocolo requer habilidades e equipamentos especiais, o que torna difícil para escalar até quantificar numerosas amostras de cada vez. O método que apresentamos aqui é um protocolo modificado de Hovenkamp-Hermelink et al. 5, que é uma associação de iodo comprimento de onda duplométodo baseado em grânulos de amido coradas. As vantagens deste método em relação a outras incluir a determinação do teor de amilose de amido em bruto sem purificação e a utilização do sistema de duplo comprimento de onda para aumentar a precisão do método 4,6.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amylose </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>859656</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amylopectin </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A8515</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perchloric Acid 60%</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>311413</td>
 <td>Very hazardous to skin and eyes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>23214TD</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium iodide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>08625JE</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plate Reader</td>
 <td>Bio Tek</td>
 <td>ELx800</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

rapid high throughput amylose determination in freeze dried potato tuber samples

Este protocolo descreve um elevado através do método colorimétrico de colocar que se baseia na formação de um complexo entre o iodo e cadeias de moléculas de glucose em amido. Iodo forma complexos com tanto amilose e amilopectina em longas cadeias. Após a adição de iodo a uma amostra de amido, o máximo de absorção de amilose e amilopectina ocorre a 620 e 550 nm, respectivamente. A proporção de amilose / amilopectina pode ser estimada a partir da razão dos valores de absorvância de 620 e 550 nm e comparando-os com uma curva padrão em que as concentrações específicas conhecidas são traçados em função de valores de absorção. Esta alta taxa de transferência, método barato é confiável e reprodutível, permitindo a avaliação de grandes populações de clones de batata.

A curva padrão construída a partir de dados inibidas de soluções de concentração de amilose / amilopectina diferentes mostra proporções aproximadas de absorvância entre 0,7 e 1,6 (Tabela 1). Uma linha de tendência de regressão linear a partir destes dados é utilizada mais tarde para inferir o teor de amilose no liofilizadas amostras de batata (Figura 1). O ambiente de produção da planta tem algum efeito sobre o teor de amilose do tubérculo <su...

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Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Rápidas alto rendimento amilose Determinação em amostras liofilizadas tubérculo

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

rapid-high-throughput-amylose-determination-freeze-dried-potato-tuber

Research

JoVE Journal

Chemistry

13.8K visualizações.  University of Wisconsin - Madison.  Este protocolo descreve um elevado através do método colorimétrico de colocar que se baseia na formação de um complexo entre o iodo e cadeias de moléculas de glucose em amido. Iodo forma complexos com tanto amilose e amilopectina em longas cadeias. Após a adição de iodo a uma amostra de amido, o máximo de absorção de amilose e amilopectina ocorre a 620 e 550 nm, respectivamente. A proporção de amilose / amilopectina pode ser estimada a partir da razão dos ...