O ITSN, PI3K C2β, e vetores de controle usado neste protocolo estão disponíveis mediante solicitação aos autores, para fins não comerciais apenas. Os autores gostariam de agradecer o Dr. Chang-Deng Hu gentilmente para aconselhamento e dos reagentes utilizados no estabelecimento do protocolo BiFC no laboratório O&#39;Bryan. KAW foi apoiada por fundos do Jerome Lejeune Foundation. Trabalho no laboratório O&#39;Bryan é suportado por concessões do (HL090651) NIH, DOD (PR080428), a Fundação St. Baldrick, e da Fundação Jérôme Lejeune.

A. BiFC Calibração <ol><li> Escolha um fluoróforo. Existem vários fluoróforos, tais como YFP e Vênus, que funcionam bem como parceiros BiFC fusão (Tabela 1). Termina amino-e carboxi-terminal de Vênus são capazes de formar um complexo a 37 ° C, enquanto os fragmentos YFP BiFC requerem um pré-incubação a 30 ° C, a fim de facilitar a formação de fluoróforo 2. Esta incubação a baixa temperatura podem alterar alguns processos celulares e devem ser levados em conta ao escolher fragmentos. Vetores para a fusão Venus carboxi-terminal de proteínas estão disponíveis a partir Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> ; seepBiFC-VN173 e pBiFC-VC155), juntamente com construções adicionais para uso como controles, por exemplo, <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> e pBiFC-bFosVC155 2. Vetores adicionais, incluindo vetores amino-terminal Venus (PFLAG-VN173 e PHA-VC155), estão disponíveis no seguinte site: <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ HU1 ~ /</a> . </li><li> Tag a proteína de interesse. BiFC Os fragmentos são fundidos para as extremidades amino ou carboxi-terminal das proteínas candidato. Algumas proteínas podem não permitir a marcação em cada extremidade, devido à interrupção da função da proteína. Por exemplo, muitos membros da superfamília Ras de GTPases são lipídios modificados no anexo carboxi-terminal impossibilitando dos fragmentos BiFC naquela final. Assim, é importante ter alguma idéia de como o apego dos fragmentos BiFC pode afetar a função das proteínas de interesse. Se não está claro como a marcação de uma proteína vai afetar a sua função combinações múltiplas devem ser testados. Além do fragmento BiFC, um linker peptídeo pode ser incluído para aumentar a flexibilidade entre o fluoróforo fragmentado e as proteínas candidato. Embora os sites de clonagem múltipla (MCS) nos vetores BiFC codificar pequenos trechos de aminoácido que pode fornecer flexibilidade suficiente, o RSIAT, KQKVMNH e linkers RPACKIPNDLKQKVMNH tem sido utilizado com sucesso em experimentos BiFC 3,9 </li><li> Determinar as condições de transfecção. Mutantes Antes de testar vários, um poucos experimentos de controle deve ser realizado. As duas primeiras combinações BiFC que deve ser julgado duas proteínas do tipo selvagem que são conhecidos por interagir e uma do tipo selvagem e mutante que não interagem. Usando essas duas combinações, diferentes quantidades de DNA e os tempos de transfecção devem ser testados para determinar as condições óptimas para a detecção de um sinal para as proteínas BiFC candidato. Sugerimos testes 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug de cada construto BiFC para um único poço de um prato bem 6. O dia depois que as células transfecção monitor por microscopia de fluorescência para determinar o tempo ideal para o desenvolvimento do sinal. O <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> e pBiFC-bFosVC155 duas construções são úteis controles positivos para BiFC e estão disponíveis a partir Addgene (veja acima). Além disso, Western blot devem ser realizados para confirmar a expressão igual das construções. Condições devem ser escolhidos de forma que um sinal fluorescente é observada entre as duas proteínas do tipo selvagem, mas pouco ou nenhum sinal é observado entre o tipo selvagem e proteínas mutantes. Finalmente, o melhor é manter a expressão da proteína o mais baixo possível para evitar qualquer interações não-específicas. </li><li> Determinar se a adição dos fragmentos BiFC altera a localização das proteínas de interesse. Cada construir BiFC contém quer um HA ou tag epítopo FLAG. Immunostain transefected células tanto para HA ou tag epítopo bandeira, assim como também a proteína endógena (se possível) para determinar se o tag BiFC afeta a localização das proteínas de interesse. </li></ol> B. Galvanização e transfecção de células <ol><li> Células COS (1.3x10 5) são banhados em cada uma placa de vidro de fundo Matek e dois poços de uma placa de 6 poços por amostra. Permitem que as células para resolver durante a noite a 37 ° C. Tipos de células alternativas que são mais relevantes para as proteínas de interesse candidato também pode ser usado. </li><li> Prepare DNAs de transfecção. Nós normalmente utilizam Lipofectamine (Invitrogen) para transfections COS. No entanto, outros reagentes podem ser mais apropriados para a linha de células de interesse. Uma vez que a mistura de transfecção será dividido entre um prato fundo de vidro e dois poços de uma placa de 6 poços, use a quantidade adequada de DNA para dar conta dessa divisão. Diluir DNA em 250uL de soro livre (SF) DMEM. Adicionar PCP em 05/01 a quantidade do total DNAs BiFC como um controle de transfecção. Para a quantificação BiFC, apenas as células que são positivos para o CFP serão analisadas para a presença de um sinal BiFC. Note-se que os espectros PCP vai coincidir com alguns dos pares BiFC na Tabela 1, portanto um controle alternativo de transfecçãotalvez necessário. Diluir Lipofectamine em 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug de DNA). Misturar o DNA e as diluições Lipofectamine. Incubar à temperatura ambiente por 20min. Nota: O Lipofectamine: relação de DNA pode variar dependendo do tipo de célula. Use o método apropriado para a transfecção linhagem de células de interesse. </li><li> Enxágüe com água morna células 2x SF DMEM. Adicionar 2 ml de SF DMEM para cada prato fundo de vidro ou bem de um prato 6-bem. </li><li> Dividir cada mistura de transfecção uniformemente entre um prato fundo de vidro e dois poços de um prato 6-bem. </li><li> Incubar as células a 37 ° C por 5 horas. </li><li> Remova a mídia de transfecção e substituir com a mídia completo (DMEM +10% SFB). </li><li> Células incubar durante a 37 ° C. O comprimento de transfecção seguintes incubação varia de acordo com os níveis de expressão das proteínas de interesse. Incubação prolongada pode resultar em não-específicas de interação de modo que este passo terá de ser determinada empiricamente. </li></ol> C. Preparação das células para criação de imagens <ol><li> Células são inicialmente examinados sob um microscópio de epifluorescência para garantir que o controlo positivo é fluorescente. Se não, pode ser necessário para permitir que as células tempo adicional a 37 ° C até que sinal é observado. </li><li> Enxágüe células 3x com PBS (pH 7,4). Para as células no prato fundo de vidro adicionar paraformaldeído 2% (pH 7,4). Corrigir as células por 10 min no gelo. Enxágüe células 3x com PBS (pH 7,4). Células armazenar a 4 ° C coberto com 1mL de PBS (pH 7,4). Células não tem que ser corrigido para imagens, mas uma vez que os fragmentos BiFC reforma um fluoróforo intacta é a análise evitando assim irreversível de interações dinâmicas 3. Além disso, mantenha em mente que as células unfixed continuará a desenvolver sinal. Lisar as células do prato 6-bem e preparar lisados ​​para Western blot. É importante que todas as células são preparadas ao mesmo tempo para que as células lisadas são representativos das células imagens. </li></ol> Células D. Imagem <ol><li> A intensidade de fluorescência será calculado por célula. Certifique-se de células de imagem individual. </li><li> PCP foi incluído como um controle tranfection e somente PCP células positivas são selecionados para análise de sinais BiFC. Nós fazemos a suposição de que se a célula é transfectadas com PCP, é também transfectadas com as construções BiFC. Essa abordagem garante que as células com imagens que não têm um sinal BiFC são negativos, devido à falta de uma interação entre as proteínas de interesse e não devido à ausência de um ou ambos os construtos de expressão BiFC naquela célula. </li><li> Nós usamos uma Zeiss LSM 510 microscópio confocal para imagens de células. Ao usar este microscópio é importante para manter o zoom, pinhole, ganho de detector, amplificador offset, tamanho do quadro, velocidade de digitalização, média de verificação, e laser de potência consistente. Ao usar qualquer sistema de imagem é importante para manter as configurações constante para que a fluorescência é comparável entre as amostras. Além disso, ao quantificar a fluorescência é importante que pixels não são saturadas. </li></ol> E. Quantificação de fluorescência <ol><li> Fluorescência pode ser quantificada usando qualquer software de imagem. Nós utilizamos ImageJ que está livremente disponível a partir do NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Abrir arquivos de imagem no ImageJ. Ir para Medições AnalyzeSet. Marque as caixas de Área e Valor médio cinza na caixa de Medições. </li><li> Usando a ferramenta &#39;Seleção mão livre &quot;, desenhe um contorno ao redor da borda da célula inteira no canal PCP. </li><li> Deixando este esquema no lugar, mudar para o canal YFP. Ir para AnalyzeMeasure. O Valor Médio Gray é a soma dos valores de cinza de todos os pixels na seleção, dividido pelo número de pixels (ou seja, a intensidade média de fluorescência por área da célula). </li><li> Para cada imagem desenhar um círculo no canal YFP em uma área que não contém uma célula. Tomar uma medida para esta área como pano de fundo. Subtrair o fundo de cada imagem. </li><li> Valor a média menos o cinza de fundo para todas as células fotografada em uma amostra. Esta será a intensidade média de fluorescência para uma população de células. Gostaríamos de sugerir cerca de 60 células ao longo de três experimentos ser quantificado. </li></ol> Resultados F. Representante: Nosso laboratório centra-se na proteína andaime multi-domínio, intersectin (ITSN) que interage com proteínas numerosos para regular múltiplas vias bioquímicas e de sinalização 10,11,12,13,14. ITSN contém dois homologia Eps15 (EH) domínios, uma região enrolada em espiral, e cinco homologia Src 3 (SH3) domínios. Quanto mais tempo isoforma de ITSN também contém homologia Dbl (DH) e homologia pleckstrin (PH) domínios que atuam em conjunto como um fator de troca de nucleotídeos guanina para Cdc42 15. Esta estrutura modular promove proteína: interações de proteínas e faz ITSN um candidato ideal para experimentos BiFC. A localização subcelular de ITSN pode alterar os seus parceiros de ligação e, portanto, alterar as rotas regulamentada pelo ITSN (unpublished de dados). Recentemente, nosso laboratório demonstrou que ITSN regula a sobrevivência neuronal através da regulamentação de um romance de classe II PI3K, PI3K-C2β 11. O domínio amino-terminal Pro-rica de PI3K-C2β contém dois sítios de ligação para SH3 ITSN de domínios. Usando co-imunoprecipitação com ITSN e mutantes PI3K-C2β truncamento demonstramos que SH3A ITSN e domínios SH3C interagir com a região amino-terminal da PI3K C2β. Em seguida, utilizamos BiFC para visualizar a localização subcelular deste complexo. ITSN foi fundida ao amino-terminal de Vênus (PFLAG-VN173) e PI3K-C2β constrói fundido a carboxi-terminal de Vênus (PHA-VC155). Como outro controle negativo, um peptídeo não-específica foi fundida a PHA-VC155. VN-ITSN e VC-PI3K C2β formado um complexo com uma distribuição BiFC pontuam (Figura 2A, painéis superiores). Mutações no domínio Pro-rica de PI3K-C2β que perturbam co-precipitação de ITSN e PI3K-C2β diminuiu o sinal BiFC (Figura 2A, painéis inferiores) 11. Esta diferença de sinal entre BiFC ITSN e os dois PI3K C2β-proteínas não foi devido a diferenças na expressão da proteína (Figura 2B). <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="Figura 1" /> . Figura 1 Em BiFC, um fluoróforo (neste caso, Venus) é dividido em aminoácidos (VN) - e carboxi (VC)-terminal termina. Esses fins são fundidos para duas proteínas de interesse. Quando as duas proteínas interagem, os fragmentos VN e VC re-associar resultando em reconstituição do fluoróforo e fluorescência nos locais de interação. BiFC é um exemplo específico do ensaio complementação protéica fragmento (PCA) utilizado para medir proteína: interações proteína 5. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. ITSN e PI3K-C2β formar um complexo BiFC. A. VN-tagged ITSN foi co-tranfected com VC-tagged PI3K-C3β WT ou um domínio rico em prolina mutante (PI3K-C2β-PA). ITSN e WT forma PI3K-C2β um complexo (verde). PCP (vermelho) foi usado como um controle de transfecção B. A Western blot foi realizada para demonstrar a expressão de igualdade dos construtos. O VC-tagged construções são HA marcados. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1. Existem vários vetores que são compatíveis com BiFC. YN155: 1-155aa de YFP; YC155: 155-238aa de YFP; YN173: 1-172aa de YFP; YC173, 173-238aa de YFP; VN155: 1-154aa de Vênus; VC155: 155-238 de Vênus; VN173: 1-172aa de Vênus; VC173: 173-238aa de Vênus; CN155 1-154aa do PCP; CC155 155-238aa do PCP, GN173: 1-172aa da GFP, CitN155: 1-155aa de Citrino, CitC155: 155-238aa de citrino, CitN173: 1-172aa de Citrino, CitC173: 173-238aa de Citrino, CerN173: 1-172aa de Cerulean 2,3,9.

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	<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation.">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li><li>Martin, N. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving.">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li><li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+can+regulate+the+Ras/MAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis.">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li><li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis,+activates+mitogenic+signaling+pathways.">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li><li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogenesis+and+endocytosis:+What's+at+the+INTERSECTIoN?.">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?.</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

BiFC é um excelente método para a visualização de proteínas: interações de proteínas em células inteiras e determinar a localização subcelular desses complexos. As vantagens de BiFC são de que apenas as proteínas que interagem são fluorescentes, as interações transitórias são estabilizadas, e pós-processamento dos dados de imagem é mínima. Duas desvantagens deste método são o tempo de maturação para a fluoróforo ea irreversibilidade do complexo fluoróforo. Em algumas aplicações este irrevers...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

Definir a distribuição subcelular de complexos de sinalização é imprescindível para a compreensão de que a saída do complexo. Métodos convencionais, tais como imunoprecipitação não fornecem informações sobre a localização espacial dos complexos. Em contraste, BiFC monitora a interação e compartimentalização subcelular de complexos de proteínas. Neste método, uma proteína fluororescent é dividido em amino-e carboxi-terminal não-fluorescentes fragmentos que são então fundidas para duas proteínas de interesse. Interação das proteínas resulta na reconstituição do fluoróforo (Figura 1) 1,2. Uma limitação do BiFC é que uma vez que o fluoróforo fragmentada é reconstituído o complexo é irreversível 3. Esta limitação é vantajoso na detecção de interações transitória ou fraco, mas impede uma análise cinética da dinâmica complexa. Uma advertência adicional é que o flourophore reconstituído requer 30min para amadurecer e fluorescentes, mais uma vez impedindo a observação de interações em tempo real 4. BiFC é um exemplo específico do ensaio complementação protéica fragmento (APC), que emprega proteínas repórter como o verde variantes proteína fluorescente (BiFC), diidrofolato redutase, b-lactamase, e luciferase para medir proteína: interações de proteínas 5,6. Métodos alternativos para o estudo de proteínas: as interações das proteínas nas células incluem fluorescência co-localização e transferência de energia de ressonância Förster (FRET) 7. Para co-localização, duas proteínas são individualmente marcados diretamente com um fluoróforo ou por imunofluorescência indireta. No entanto, esta abordagem leva a fundo elevado de proteínas não-interativas que torna difícil de interpretar co-localização de dados. Além disso, devido aos limites de resolução da microscopia confocal, duas proteínas podem aparecer co-localizadas, sem necessariamente interagir. Com BiFC, a fluorescência é observada somente quando as duas proteínas de interesse interagem. FRET é outro método excelente para estudar proteínas: interações de proteínas, mas pode ser tecnicamente desafiadora. FRET experimentos requerem o doador e receptor seja de brilho semelhantes e estequiometria na célula. Além disso, deve-se conta de sangrar através do doador para o canal receptor e vice-versa. Ao contrário FRET, BiFC tem pouco fundo de fluorescência, o pós-processamento de dados de imagem pouco, não exige a superexpressão de alta, e pode detectar interações fracas ou transitórios. Bioluminescência transferência de energia de ressonância (BRET) é um método semelhante ao FRET exceto o doador é uma enzima (luciferase, por exemplo) que catalisa um substrato para se tornar bioluminescente, assim, uma emocionante aceitador. BRET falta a problemas técnicos de sangrar através fluorescência de fundo e alta, mas não tem a capacidade de fornecer informação espacial, devido à falta de localização do substrato para compartimentos específicos 8. No geral, BiFC é um excelente método para a visualização de localização subcelular de complexos de proteínas para obter insights sobre sinalização compartimentada.

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Bimolecular Fluorescence Complementation

A localização subcelular de proteínas é importante para determinar a regulação espaço-temporal de sinalização celular. Aqui, descrevemos complementação bimolecular de fluorescência (BiFC) como um método simples para monitorar as interações espaciais de proteínas na célula.

Complementação de fluorescência bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

27.7K visualizações.  University of Illinois at Chicago. A localização subcelular de proteínas é importante para determinar a regulação espaço-temporal de sinalização celular. Aqui, descrevemos complementação bimolecular de fluorescência (BiFC) como um método simples para monitorar as interações espaciais de proteínas na célula.

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Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biologia

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

Cryosectioning comunidades de leveduras para o exame de padrões de fluorescência

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...