A termoforese de microescala rotulada obtém constantes de dissociação, ou KDs, de diversas interações bioquímicas de forma eficiente. Este protocolo e o vídeo acompanhado dão a afinidade aproximada por Vam7, a única proteína snare solúvel na levedura, ao ácido fosfídico. Esta é a maneira que Vam7 associa com duas membranas antes de interagir com outras proteínas.
Este método obtém KDs rapidamente para diversas interações bioquímicas a baixo custo, com alta reprodutibilidade e com custo mínimo de proteína. Esta técnica é adequada para o desenvolvimento farmacêutico de primeiro estágio, permitindo que KDs facilmente obtidos determinem potenciais compostos de chumbo. Antes de iniciar uma análise, ligue o interruptor de alimentação na parte de trás do dispositivo MST e abra o software de controle.
Confirme se o computador está conectado ao dispositivo e ao status conectado e defina o MST antes de 3 segundos, o MST para 30 segundos e a Recuperação de Fluorescência para depois de 1 segundo. Para cada tubo capilar, digite o nome do ligante alvo, o nome do ligante analito, a concentração do alvo e a maior concentração de titulação usando a razão de titulação de preenchimento automático. Selecione uma gama de poderes MST e digite valores para cada potência para testar o ajuste de ligação mais robusto.
Para preparar amostras rotuladas de MST, diluir uma solução de Vam7-octahistidina para uma concentração de 200 nanomolares e um corante NTA-Atto 647 para 100 de concentração de nanomolar, ambos em PBS. Misture o Vam7-octahistidina e o corante NTA-Atto 647 a uma proporção volumosa de 1:1 e deixe a mistura sentar-se à temperatura ambiente protegida da luz por 30 minutos. Ao final da incubação, centrifufique a mistura de corante e proteína e armazene a solução a 4 graus Celsius por até algumas horas antes do uso.
Em seguida, prepare a amostra, pegue o ligante tingido e exponha o analito. Para termoforese de microescala da amostra, abra o dispositivo e deslize o rack capilar para fora. Coloque os capilares de amostra no rack com a maior concentração na posição um e selecione o canal Vermelho no software de controle.
Em seguida, carregue o rack no instrumento. Em seguida, selecione uma faixa de potência MST e inicie a medição do Cap Scan MST e avalie a resposta de mudança. Traços termoforéticos de um teste de uma titulação de 1:1 de DiC8 PA a partir de 500 micromoles contra 50 nanomolar NTA-Atto 647 rotulado domínio Vam7 são mostrados aqui.
A fluorescência inicial, o salto de tempo e a termoforese podem ser observados, permitindo que o KD seja calculado a partir de qualquer uma ou uma combinação dessas medidas. Uma curva de saturação pode ser traçada a partir desses resultados, por exemplo, para a termoforese com a saída de salto de tempo, como ilustrado no gráfico. Geralmente, os resultados do MST são determinados por meio da escala de log, levando em conta a concentração de proteínas para determinar a afinidade vinculante selecionando o modelo KD e inserindo a concentração de proteínas.
Ao executar este protocolo, certifique-se de que a solução está no centro do capilar e que não há bolhas de ar e que o capilar não tenha poeira ou solução na parte externa do capilar. A calorimetria de titulação isotérmica ou ressonância plasmon superficial poderia ser usada para validar o KD experimental obtido. Se houver potencial vinculação cooperativa, o ITC seria o próximo método lógico realizado, dado os recursos.
Essa técnica permitiu que pesquisadores tradicionais de biologia incorporassem técnicas de triagem biofísica em suas pesquisas para determinar relações de caminho. Um exemplo dessa técnica é a lise celular com a proteína alvo expressa endógena, onde a tag GFP é uma nova maneira de realizar um ensaio tradicional de puxar para baixo.
